本方案描述了研究基于重组受体结合域（RBD）的SARS亚单位疫苗的一般步骤。内容包括在293T细胞中转染和表达RBD蛋白的方法、用RBD免疫小鼠，以及利用已建立的SARS假病毒中和实验检测小鼠血清的中和活性。
本文内容
摘要
摘要
基于其安全性以及针对感染诱导强烈免疫反应的能力，亚单位疫苗已被用作多种病原体的候选疫苗1-3。由于哺乳动物细胞系统能够进行翻译后修饰，从而形成正确折叠和糖基化的蛋白质，因此在哺乳动物细胞中表达的重组蛋白在维持高抗原性和免疫原性方面表现出最大潜力4-6。
尽管自2004年以来未再报告新的SARS病例，但未来暴发的风险始终存在；因此，开发针对SARS-CoV的疫苗是一项明智的预防措施，应当持续推进。SARS-CoV刺突蛋白的受体结合域（RBD）在受体结合以及诱导针对病毒感染的特异性中和抗体方面发挥着重要作用7-9。因此，在本实验方案中，我们描述了开发基于RBD的亚单位疫苗的创新方法。简言之，重组RBD蛋白（rRBD）在哺乳动物293T细胞的培养上清液中表达，以获得正确折叠、构象完整且具有高免疫原性的蛋白6。随后采用磷酸钙转染法对编码RBD的重组质粒进行细胞转染6,10，并进行了部分改良。与脂质体转染法11,12相比，这种改良的磷酸钙转染法成本更低、操作更简便，且一旦形成合适大小和形状的转染复合物，即可实现较高的转染效率13,14。最后，本方案引入了SARS假病毒中和实验，用于检测接种rRBD蛋白的小鼠血清中的中和活性。该实验相对安全，不涉及具有感染性的SARS-CoV病毒，且无需在生物安全三级实验室中进行15。
本文所述方案还可用于设计和研究针对其他具有Ⅰ类融合蛋白病毒的重组亚单位疫苗，例如HIV、呼吸道合胞病毒（RSV）、埃博拉病毒、流感病毒，以及尼帕病毒和亨德拉病毒。此外，生成假病毒并建立假病毒中和实验的方法同样适用于上述所有病毒。
方案
1. 重组SARS-CoV RBD蛋白的制备
- 制备磷酸钙转染试剂
- 2X HBS 缓冲液的配制：将 16 g NaCl、0.4 g Na2HPO4·7H2O 和 13.0 g HEPES 混合，用去离子水定容至 1000 mL，并调节 pH 至 7.00。过滤除菌后分装，于 -20°C 保存。
提示：pH 值的任何变化均会影响转染效果。因此，建议测试 pH 7.00 附近的多个值（例如 6.99、7.00 或 7.01），并通过下文介绍的方法确定最适合转染的 pH 值。 - 2.5 M CaCl2 溶液的配制：将 73.5 g CaCl2·2H2O 溶于去离子水中，定容至 200 mL。过滤溶液后于 -20°C 保存。
- 2X HBS 缓冲液的配制：将 16 g NaCl、0.4 g Na2HPO4·7H2O 和 13.0 g HEPES 混合，用去离子水定容至 1000 mL，并调节 pH 至 7.00。过滤除菌后分装，于 -20°C 保存。
- 重组质粒转染与蛋白纯化
- 转染前 24 小时，将 293T 细胞以 50–70% 汇合度进行传代。在含有 10% 热灭活（HI）FBS 和 1% 青霉素/链霉素（P/S）的 40 mL DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO2 条件下，在 T-175 cm2 组织培养瓶中培养细胞。
- 所有转染试剂在使用前应恢复至室温。这些试剂包括 2X HBS、2.5M CaCl2、DiH2O 和 rRBD 质粒6。
提示：用于蛋白表达的最终重组质粒应包含信号肽序列，以确保表达的重组蛋白分泌至培养上清中。可在表达蛋白的 C 末端添加 6x His 标签，以便于后续纯化。 - 准备一个 50 mL（A 管）和一个 15 mL（B 管）的 BD Falcon 管，按表 1 所示向各管中加入试剂。向 A 管中加入 2X HBS 缓冲液。在 B 管中加入 2.5M CaCl2 和 rRBD 质粒，并用 DiH2O 定容至所需体积。
表 1. 转染混合物的配制及体积A. 一个 T-175 cm2 组织培养瓶（4000 μL/瓶）：用于 rRBD 蛋白表达 A 管 B 管 2X HBS 2000 μL 2.5M CaCl2 200 μL rRBD 质粒 DNA 40 μg DiH2O 定容至 2000 μL B. 一个 100 mm 培养皿（1000 μL/皿）：用于 SARS 假病毒制备 A 管 B 管 2X HBS 500 μL 2.5M CaCl2 50 μL SARS-CoV S 质粒 DNA 5 μg HIV-1 质粒（pNL4-3.luc.RE） 5 μg DiH2O 定容至 500 μL
表 1 中所列体积适用于一次转染单位。若使用更多培养瓶或培养皿进行转染，应相应调整体积。 - 将 B 管中的 DNA-钙溶液逐滴加入 A 管中，同时在涡旋振荡器上持续轻柔混匀。室温静置 20–30 分钟。成功的磷酸钙转染关键在于所形成沉淀物的大小和形态。因此，混合过程中应持续缓慢涡旋，以满足此要求，从而提高转染效率。
- 将混合液均匀地逐滴加入 293T 细胞中（4000 μL/瓶）。将细胞置于 37°C、5% CO2 的培养箱中继续培养。
- 转染后 8–10 小时，更换为新鲜的无血清 OPTI-MEM I 低血清培养基（50 mL/瓶）。在相同条件下继续培养细胞两天。
- 转染后 72 小时收集含有表达 rRBD 蛋白的上清液。以 6000 rpm 离心 15 分钟，去除细胞碎片。向上清液中加入蛋白酶抑制剂混合物，4°C 过夜保存。
- 次日，按照生产商说明书，使用 Ni-NTA Superflow 从培养上清液中纯化 rRBD 重组蛋白。
- 使用 Amicon Ultra-15 浓缩管对纯化后的蛋白进行浓缩。浓缩完成后，向浓缩管中加入 PBS，再次离心以去除洗脱缓冲液中的咪唑。测定蛋白浓度后，将纯化蛋白分装并保存于 -80°C，直至使用。
2. 小鼠免疫与样本采集
- 根据制造商说明，将Sigma佐剂系统（SAS）预热至40–45°C。每瓶加入1 mL PBS，充分混匀。
- 根据表2中的方案制备蛋白-佐剂乳剂。将计算量的rRBD蛋白移入1.5 mL离心管中。加入等体积的SAS佐剂，剧烈涡旋振荡2–3分钟以形成乳剂。
提示：表2中所列体积为单只小鼠的用量。请根据实际使用的小鼠数量调整体积。每组实验需将疫苗所需的蛋白与佐剂混合均匀。每次免疫接种时应额外准备一份样品，以确保剂量准确。
表2. 小鼠免疫方案组 1st 疫苗
（200 μL/只）2nd 疫苗
（200 μL/只）3rd 疫苗
（200 μL/只）rRBD 蛋白 20 μg 蛋白质（溶于 PBS）
(100 μL) + 100 μL SAS10 μg 蛋白质溶于 PBS（100 μL）+ 100 μL SAS 10 μg 蛋白质溶于 PBS（100 μL）+ 100 μL SAS PBS 对照 100 μL PBS +
100 μL SAS100 μL PBS +
100 μL SAS100 μL PBS +
100 μL SAS - 皮下接种4-6周龄雌性BALB/c小鼠（每组5只），按照表2所示使用rRBD和SAS进行初次免疫和加强免疫，共加强两次。以PBS组作为对照组。皮下注射通常选择肩胛骨之间的松弛皮肤区域，也可选用腹侧腹部，因其更易于注射，并可便于观察注射部位是否有液体渗漏。当需要多次接种疫苗时，可选择不同注射部位，以避免可能发生的局部皮肤反应。
- 通过眼后静脉丛在麻醉下对小鼠进行采血，分别在免疫前及每次接种疫苗后10天采血，将血清于56°C加热30分钟以灭活补体。小鼠血清储存于-20°C直至使用。
3. 使用假病毒中和实验进行中和作用检测
- 制备SARS假病毒
- 转染前16小时，将293T细胞以每100 mm组织培养培养皿2×106个细胞的密度进行传代，并按上述条件培养细胞。
- 按照表1所示配制转染试剂。使用磷酸钙转染试剂，共转染编码SARS-CoV刺突蛋白（S蛋白）的质粒和编码缺失包膜蛋白但表达荧光素酶的HIV-1基因组质粒（pNL4-3.luc.RE）。
- 转染后8–10小时，更换为10 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的新鲜DMEM培养基。转染后72小时收集含有SARS假病毒的上清液。
- 通过0.45 μm滤膜过滤假病毒上清液，分装后于-80°C保存备用。
- SARS假病毒中和实验
- 感染前16小时，将表达SARS-CoV受体ACE2的293T细胞（ACE2/293T）以每孔104个细胞/100 μL的密度接种于96孔组织培养板中。
- 对SARS假病毒进行2倍系列稀释，以测定其在ACE2/293T细胞中的病毒滴度。
- 在96孔组织培养板中对小鼠血清进行连续稀释，加入等体积已标定滴度的SARS假病毒，37°C预孵育1小时。
- 孵育结束后，将100 μL血清-假病毒混合液加入ACE2/293T细胞中，在含5% CO2的37°C培养箱中继续培养。24小时后更换新鲜DMEM培养基。
- 感染后72小时，彻底移除培养板中的培养上清液，每孔加入1×荧光素酶细胞裂解试剂60 μL，并在室温下持续振荡1–2小时以促进细胞裂解。
- 将细胞裂解液（每孔50 μL）转移至发光检测板（Microfluor 96孔板）中，加入荧光素酶检测试剂盒提供的荧光素酶底物（每孔50 μL），使用Ultra 384发光仪检测相对荧光素酶活性。
- 计算SARS假病毒中和滴度，并以50%中和抗体滴度（NT50）表示6。
讨论
细胞密度是影响基于磷酸钙转染效率的重要因素。根据我们的经验，细胞汇合度低于70%时可获得最佳转染效果。因此，为了提高转染效率，建议将细胞密度控制在约50%-70%的汇合度。通常认为，磷酸钙转染法的效率低于其他转染方法，例如脂质体转染16。然而，在本实验方案中，我们采用了一种改良的磷酸钙转染方法，通过在旋涡中持续缓慢混合转染溶液，确保形成大小和形态适宜的沉淀物，从而提高转染效率。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（RO1 AI68002）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Na2HPO4·7H2O | Sigma-Aldrich | S2429 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140 | |
| OPTI-MEM I 培养基 | Invitrogen | 31985 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Group | 11836170001 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30450 | |
| Sigma 佐剂系统 | Sigma-Aldrich | S6322 | |
| 荧光素酶检测试剂盒 | Promega Corp. | E1501 | |
| 荧光素酶细胞裂解液（5倍浓度） | Promega Corp. | E1531 | |
| Amicon Ultra - 15 | EMD Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor 96孔板 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7905 | |
| Ultra 384 发光检测仪 | Tecan Group Ltd. |
参考文献
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