介绍了一种结合多种技术的方法，以最大限度地从小鼠组织中收集数据。
本文内容
摘要
摘要
超越单个基因功能、更深入地研究基因调控网络，需要将多个突变组合于同一个动物体内。对两个或更多基因的此类分析必须辅以 原位 对其他基因进行杂交，或对其蛋白质进行免疫组织化学分析，可在整体安装的发育器官或切片中进行，以详细解析细胞和组织表达的变化。结合多种基因修饰需要使用 cre 或 flipase 系统进行条件性基因删除，以避免胚胎致死。所需的繁育方案会随着突变基因数量的增加而显著提高工作量和成本，最终获得具有全套目标遗传修饰的动物数量极少。为获得这些携带多重突变的珍贵样本所投入的巨大时间和精力，要求必须优化组织处理流程。此外，利用多种技术对单个动物进行研究，有助于将基因删除引起的缺陷与表达谱更紧密地关联起来。我们已开发出一种技术，可对单个动物进行更全面的分析，能够从同一标本中——无论是整体安装的器官还是切片——同时分析多种在组织学上可识别的结构以及基因和蛋白的表达。尽管本技术的有效性已在小鼠中得到验证，但其可广泛应用于多种动物。为此，我们结合了脂溶性染料示踪与整体安装 原位 杂交、免疫组织化学和组织学，以提取尽可能多的数据。
方案
1. 脂溶性染料注射
组织制备：
所有组织解剖与操作均在经4%多聚甲醛（PFA）溶于0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中通过心内灌流固定后的动物上进行，灌流使用蠕动泵及适当尺寸的针头完成。组织可在4% PFA中于冰箱内保存长达6个月。所有制备与操作过程均在0.4%或更高浓度的PFA中进行，直至以甘油封片用于成像。该浓度的PFA可有效灭活RNase并保存RNA 原位 杂交。
染料储存：
所有染料均应储存在阴暗密闭的容器中，以尽量减少空气流通和暴露于强光下，因为染料具有光敏性。为避免交叉污染，应使用单独的一套仪器操作每一种染料。
- 首先，必须选择染料的应用位点，并去除多余的组织，以在视觉上确认所选位点，并便于染料的放置。选择应用位点是该过程中的关键步骤。准确选择目标神经元群的标记位点，同时避免标记无关结构，可能具有挑战性。在解剖显微镜下通过视觉控制将染料精确注入特定神经通路，需要对相关神经解剖结构具备一定程度的理解。根据具体实验需求（例如脑、外周神经、耳、眼），可将染料置于中枢或外周，以分别标记外周或中枢投射。脂溶性染料可在单个神经元的所有突起中双向扩散（顺行和逆行），从而填充单个神经元，或所有投射至特定通路的神经元。
- MTTI 公司的 NeuroVue 染料已预先加载于滤纸条上，便于直接使用。也可将染料溶解于 100% DMSO 中（需在通风橱内操作），用细毛发浸入该溶液后干燥，用于更小范围的染色应用。使用显微剪将预载染料的滤纸剪成适当大小的三角形片段。染料片段的大小取决于样本尺寸、待标记结构的大小以及同时使用的颜色数量。应尽量剪取最小可能的片段，以避免标记到非目标结构。使用显微剪切割及镊子操作染料后，需将器械在酒精中震荡以去除残留染料，随后完全晾干或用纸巾轻拭，以防止器械上残留的染料污染样本，导致非目标结构被标记。
- 对于脑等柔软组织，可直接使用滤纸三角的尖端刺入组织以插入染料。对于较坚硬的组织，应先做切口以便于染料插入。切勿使用解剖针将滤纸推入组织，以免造成染料定位不准或组织损伤。根据需要，可插入不同波长的 NeuroVue 染料，以标记额外的神经元群。
- 插入染料并确认其位置后，将样本置于密封良好的小瓶中，加入 4% PFA，于 36°C 黑暗条件下孵育 2–14 天，具体时间取决于样本年龄及所需扩散距离（在 36°C 下约每天扩散 2 mm）。
- 可使用配备落射荧光装置的解剖显微镜评估染料是否已扩散至目标区域；若扩散不足，可将样本重新放回培养箱继续孵育。若使用无落射荧光功能的普通解剖显微镜检测扩散情况，会低估染料的实际扩散距离。此外，若染料浓度过高而可在可见光下直接观察，则在检测发射荧光时可能导致吸收猝灭现象。
- 将目标组织解剖取出后，用甘油整体封片于载玻片上，并加盖盖玻片，用于共聚焦显微镜成像。共聚焦显微镜的设置参数详见 1, 2。若组织尺寸过大而无法整体封片，则需进行连续切片（见下文）。有关组织成像前处理及染料光谱特性的更多细节，请访问：http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf
图1. 实验示意图。 暴露耳部以清晰观察所有结构。随后注射脂溶性染料并使其扩散。染料扩散后，不同神经元群体可被不同染料标记并清晰可见。接下来， 原位 杂交（Sox2）在耳组织上进行，用于标记mRNA表达。随后进行免疫组织化学染色（Myo7、Tubulin），以可视化蛋白质表达。接着进行组织学切片，同时检测两者 原位 可观察到杂交和免疫组织化学结果。
2. 原位 杂交
如果您希望从以下内容开始 原位 杂交（此后将无法使用脂溶性染料进行示踪），请参见第1部分中的组织制备。每次洗涤，除非另有说明，均在室温下使用2 mL溶液在翻转混合器上进行。务必在洁净、无RNase的环境中操作。
- 通过梯度甲醇系列对样本进行脱水，然后重新水化。
- 100% 甲醇，4°C 下处理 1 小时至过夜（可选：可在 -20°C 下将样本保存于 100% 甲醇中）
- 75% 甲醇，4°C 下处理 5 分钟
- 50% 甲醇，4°C 下处理 5 分钟
- 25% 甲醇，4°C 下处理 15 分钟（或直至组织下沉）
- 将样本转移至 2 mL 无 RNase 的离心管中。
- 用 PBS（1× PBS）洗涤三次，并开启杂交炉以备后续使用（60°C）。
- PBS 洗涤 5 分钟
- PBS 洗涤 5 分钟
- PBS 洗涤 5 分钟
- 在 2.0 mL 新鲜 PBS 中加入 2 μL 的 20 mg/mL 原液蛋白酶 K（Proteinase K，Ambion 货号 AM2546）消化组织。
实际蛋白酶 K 消化时间取决于胚胎的发育年龄。以下为大致时间估计。由于去蛋白是关键步骤，必须密切监控消化过程。消化不足会导致探针渗透不良，而过度消化则会导致组织结构完整性丧失。消化良好的一个明显标志是组织由不透明变为近乎透明。
表 1. 蛋白酶 K 对小鼠组织的消化时间 年龄（胚胎天数） 时间（分钟） E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5+ 20+ - 通过将样本在 4% 多聚甲醛（PFA）中孵育 5 分钟以终止消化。
- 用 PBS 洗涤。
- PBS 洗涤 1 分钟
- PBS 洗涤 5 分钟
- PBS 洗涤 5 分钟
- PBS 洗涤 5 分钟
- 弃去 PBS，特别注意尽可能彻底去除液体。
- 预杂交处理样本：在 60°C 下，于 1.8 mL 杂交液中在翻转仪上孵育至少 1 小时。将 IsoTemp 恒温金属浴预热至 85°C 以备后续使用。
- 当接近 1 小时时，将鲑鱼精子 DNA（Invitrogen 货号 15632-011）在 85°C 下孵育 10 分钟以变性。随后置于冰上待用。
- 预杂交至少 1 小时后，向每个样本中加入 200 μL 变性的单链 DNA 和约 100 ng 的 DIG 标记的核糖探针。在杂交炉中 60°C 下过夜杂交。
- 用 2 mL 2× SSC 替换杂交液。将 IsoTemp 恒温金属浴分别设置为 37°C 和 70°C 以备后续使用。
- 在杂交炉中 60°C 下用 2× SSC 洗涤 10 分钟
- 在杂交炉中 60°C 下用 2× SSC 洗涤 10 分钟
- 在杂交炉中 60°C 下用 2× SSC 洗涤 10 分钟
- 在 IsoTemp 恒温金属浴中 70°C 下用 2× SSC 洗涤 60 分钟
- 用 PBS 洗涤 5 分钟。将 RNase A 酶置于冰上解冻以备后续使用。
- 弃去 PBS，加入 1.0 μL RNase A 酶（Fermentas 货号 EN0531，10 mg/mL），在 IsoTemp 恒温金属浴中 37°C 下孵育 60 分钟（若探针浓度较高，建议孵育 90 分钟）。
- 弃去 PBS/RNase A 溶液，并洗涤 4 次。
- 1× 洗涤液洗涤 10 分钟
- 1× 洗涤液洗涤 10 分钟
- 1× 洗涤液洗涤 10 分钟
- 在 IsoTemp 恒温金属浴中 70°C 下用 1× 洗涤液洗涤 60 分钟
- 在 1× 封闭缓冲液中孵育 1 小时。
- 此时，为每个样本准备 2.0 mL 封闭缓冲液和 1 μL（1:2000 稀释）抗地高辛抗体。短暂翻转混匀，4°C 下静置待用。
- 1 小时后，弃去封闭缓冲液，向样本中加入 2.0 mL 预先吸附的封闭缓冲液加抗体。
- 过夜孵育。
- 弃去封闭溶液。
- 用 1× 洗涤缓冲液洗涤。
- 1× 洗涤缓冲液洗涤 5 分钟
- 1× 洗涤缓冲液洗涤 5 分钟
- 1× 洗涤缓冲液洗涤 1 小时，更换 5–6 次
- 用 1× 洗涤缓冲液过夜洗涤。
- 用 1× 检测缓冲液冲洗 10 分钟。
- 将样本连同检测缓冲液转移至多孔板中。
- 去除缓冲液，加入 BM Purple（Roche 货号 11442074001）进行显色，直至获得理想的信号强度（对于较长的探针，可能需要过夜）。BM Purple 对光敏感，需用铝箔或盒子遮盖。
- 使用前充分混匀 BM Purple。
- 确保样本处于自由悬浮状态，未粘附于孔壁。
- 1 小时后检查信号。
- 在孔中用 1× 检测缓冲液冲洗样本 5 分钟。
- 成像或将样本在 4% PFA 中 4°C 下保存。
*此阶段以及免疫组织化学步骤完成后（如下第3部分），均可对样本进行成像。
溶液：
- 无核酸酶水：将 1 mL DEPC（Sigma）与 1 L 无菌超纯水混合，高压灭菌。
- 1X PBS：将 1 包 PBS 粉剂（Sigma）溶于 1 L 无核酸酶水中，过滤除菌。
- 1X 洗涤液：将 450 mL 无核酸酶水与 50 mL 10X 洗涤液混合，过滤除菌。
- 杂交液：按体积计含 50% 甲酰胺（25 mL）；按体积计含 50% 2X SSC（25 mL）；按质量计含 6% 硫酸葡聚糖（3 g）。
- 1X 检测缓冲液：将 50 mL 10X 检测缓冲液与 450 mL 无核酸酶水混合，过滤除菌。
- 1X 封闭缓冲液：5 mL 10X 马来酸缓冲液（Roche 缓冲液套装）；40 mL 无核酸酶水；5 mL 10X 封闭缓冲液。
- 2X SSC：将 50 mL 20X SSC 与 450 mL 无核酸酶水混合，过滤除菌。
- 梯度甲醇：用无核酸酶水将 100% 甲醇稀释至 75%、50% 和 25% 浓度。
3. 免疫组织化学
如果已完成第2部分，则可以省略步骤1和步骤2。在此情况下，务必彻底清洗掉所有甘油或其他封片介质。请注意，并非所有抗体在蛋白酶K消化后仍能识别其表位。我们列出了可与此方法联合使用的抗体清单，如下： 原位 杂交在哺乳动物组织中具有特异性（见表2）。
- 使用梯度乙醇去除组织中的亲脂性染料（如果在第二部分中尚未完全完成）：50% 乙醇 5 分钟，70% 乙醇 5 分钟，95–100% 乙醇过夜或根据需要处理至达到理想效果，再用 70% 乙醇 5 分钟，50% 乙醇 5 分钟。
- 通过每隔 5–10 分钟逐步加入 PBS 对组织进行复水。
- 在摇床上，室温下用含 2.5% 正常山羊血清（NGS）和 0.5% Triton X-100 的溶液封闭组织 1 小时。
（按 1:1 混合 5% NGS 和 1.0% Triton X-100，溶于 1× PBS 中） - 将组织在封闭液中稀释的一抗溶液中孵育 48–72 小时，4°C 摇床孵育。
- 用 PBS 洗涤，每次 1 小时，共更换 3 次。
- 同第 3 步进行封闭。
- 将组织在封闭液中稀释的二抗溶液中孵育 12–24 小时，4°C 摇床孵育（使用 Invitrogen 的 Alexa Fluor® 荧光染料）。
- 同第 5 步进行洗涤。（可选：在第一次洗涤时加入 Hoechst 核染色剂进行复染，将 10 mg/mL 储存液用 PBS 稀释 1:2000。随后在摇床上用 PBS 洗涤 1 小时，更换 2–3 次，室温进行）
- 成像：此步骤中可使用透射光显微镜和落射荧光显微镜对样本进行成像，优先选用共聚焦成像系统以获得更高分辨率。常规操作中，我们将耳组织整体封片于甘油中，使用盖玻片作为间隔物以避免组织过度压扁。此外或替代该整体成像方法，也可将样本包埋于环氧树脂中并连续切片，以获得更详细的组织学信息。为充分利用整体成像与切片分析的结合优势，在共聚焦成像步骤中应避免荧光信号漂白。
溶液
- 乙醇溶液：将100%乙醇用蒸馏水稀释至终浓度为50%和70%。
- 封闭液：将5% NGS与1.0% TritonX-100按1:1比例在1x PBS中稀释（终工作浓度：2.5% NGS；0.5% TritonX-100）。
- 1X PBS：将1包PBS粉末（Sigma）溶于1 L蒸馏水中。
- 5% NGS：解冻2.5 mL NGS，加入47.5 mL 1x PBS混匀，4°C保存。
- 1.0% TritonX-100：将49.5 mL 1x PBS与0.5 mL TritonX-100混合（室温摇床上震荡1小时以充分混匀），4°C保存。
- Hoechst染色母液：每毫升1x PBS中溶解10 mg Hoechst染料。
| 表2. 可用于蛋白酶K消化组织的抗体。 | ||
| 货号 | 产品名称 | 供应商 |
| 25-6790 | Anti-Myosin-VIIA Polyclonal | Proteus Biosciences |
| 25-6791 | Anti-Myosin-VI Polyclonal | Proteus Biosciences |
| 9661 | Cleaved Caspase-3 Polyclonal | Cell Signaling |
| T7451 | Anti-Acetylated Tubulin Monoclonal | Sigma |
| PRB-238C | Prox1 polyclonal | Covance |
4. 组织学
可在第1部分之后引入组织学方法，以提高厚的整体封片（如幼体脑组织）中脂溶性染料示踪的分辨率，也可在完成第2或第3部分后进行。对于连续脑切片，我们推荐使用 Compresstome VF-700 切片机（Precisionary Instruments Inc.，美国北卡罗来纳州格林维尔）以获得均匀的切片厚度。由于切片过程中染料更容易渗漏，冷冻切片效果较差3。当整体封片或表面封片无法充分显示目标组织区域时，制备连续切片并以甘油封片4是首选的组织处理方法。组织还可进一步包埋于环氧树脂中，使用玻璃或钻石刀具进行超薄切片（厚度为1-2 μm），用于透射电镜观察。采用该技术时，大多数免疫荧光信号仍可保留，且在塑料包埋后更加稳定；然而，所有脂溶性示踪剂在此阶段将完全丢失，因其可溶于酒精和环氧树脂。需注意样品在包埋前对光敏感，应采取避光防护措施。
进行 Compresstome VF-700 切片机切片时，请遵循 Precisionary Instruments Inc. 的建议。
环氧树脂包埋/切片：
- 固定：将样品置于含 2.5% 戊二醛和 1% 多聚甲醛的 0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.4）中，固定 1 小时至过夜。
- 在玻璃样品瓶中进行组织脱水：30% 乙醇（5 分钟）、50% 乙醇（5 分钟）、70% 乙醇（5 分钟至过夜）、95% 乙醇（每次 10 分钟，共 5 次）、无水乙醇（每次 10 分钟，共 5 次）。
- 过渡溶剂：无水乙醇与丙烯酸氧化物（PO）按 1:1 比例混合，处理 5 分钟。
- 溶剂：仅使用丙烯酸氧化物（PO），每次 10 分钟，共 5 次。
- 树脂浸透：
- 将样品置于丙烯酸氧化物（PO）与树脂按 1:1 比例混合的溶液中，于摇床上孵育过夜。
- 将含有样品的溶液倒入平底包埋模具中，置于实验台上静置 4–6 小时，使丙烯酸氧化物挥发。或者，打开样品瓶盖，于摇床上继续孵育 4 小时（适用于较大组织样本）。
- 将样品转移至 100% 树脂中，孵育 4 小时。
- 将样品在带有标签的最终模具中包埋，并于 60°C 下孵育 24–48 小时以完成聚合。
- 根据需要使用剃刀片修整包埋块，以减少多余树脂。使用超薄切片机（如 Ultracut E Reichert-Jung）切取 1–2 µm 的连续切片。将切片贴附于载玻片上，并使用落射荧光显微镜进行成像。
可选步骤：如需对部分切片进行组织学染色（例如 Stevenel's blue 染色），可进行染色处理（注意：染色后切片将无法保留免疫荧光信号）。
溶液
- 乙醇溶液：将100%乙醇用蒸馏水稀释成30%、50%、70%和95%的浓度。
- 固定液：取2.5 mL 50%戊二醛、5 mL 10%多聚甲醛和42.5 mL 0.1 M pH 7.4磷酸盐缓冲液混合（终浓度：2.5%戊二醛；4%多聚甲醛）。4°C保存。
- 环氧树脂：按照Poly/Bed 812包埋介质/DMP-30试剂盒（Polysciences, Inc. #08792-1）提供的说明配制。-20°C保存。
5. 代表性结果
图2. 脂溶性染料在小鼠胚胎中的定位与成像。 注入三种不同波长的脂溶性染料并进行孵育，以可视化三叉神经（TN）、舌咽神经（GN）和迷走神经（VN）的中枢投射。A）将脂溶性染料注入三个脑神经的周围部分，使其扩散至脑干，从而可视化其中枢突起。TN 使用 NeuroVue Red 标记，GN 使用 NeuroVue Maroon 标记，VN 使用 NeuroVue Jade 标记。B）与（A）为同一只小鼠，孵育后结果。通过明场显微镜可观察到部分扩散现象。C）与（A）和（B）为同一只小鼠。后脑已解剖并平铺装片。通过明场显微镜可观察到三个标记神经中枢突起的部分染色。D）C 图的共聚焦图像。利用共聚焦显微镜可观察到特异性神经元，且使用三种不同染料可评估各神经元群彼此之间的分布关系。染料依次成像：NeuroVue Jade 的激发波长为 488 nm，发射波长为 500–550 nm；NeuroVue Red 的激发波长为 535 nm，发射波长为 550–600 nm；NeuroVue Maroon 的激发波长为 643 nm，发射波长为 650–700 nm。
图3. 实验流程示意图。暴露耳部结构以实现所有结构的可视化。随后注射脂溶性染料并使其扩散。染料扩散后，不同神经元群体可被不同染料标记而清晰可见。接着对耳部进行原位杂交（sox2），以标记mRNA表达。然后进行免疫组织化学染色（Myo7、Tubulin），以可视化蛋白质表达。最后制备组织学切片，可在其中同时观察原位杂交和免疫组织化学结果。
讨论
在本视频中，我们展示了一种结合四种技术的方法，通过在同一只动物体内关联数据（图3），以最大化数据采集量和整体一致性。该方法将减少繁育所需数量，从而缩短获得可发表数据所需的时间，同时提升对突变体共定位及关联效应的信息获取。尽管本视频使用小鼠胚胎进行实验，但这些技术同样适用于成年小鼠以及其他动物，如鸡、非洲爪蟾和斑马鱼。当使用其他物种时，蛋白酶K消化步骤可能需要调整。本实验中，我们采用不同荧光的NeuroVue染料，特异性标记最多三种目标神经元群体。这些染料的优势在于可用于突变小鼠，而仅依赖免疫组织化学时可能会因待分析突变的影响导致染色失败或不稳定；此外，这些染料可实现神经元的逆行和顺行标记。 5最近一项研究还将可同时标记的神经元群体数量增加到了六个 2随后，可使用脂溶性染料对相同的目标组织进行示踪分析 原位 杂交用于基因转录分析，随后可通过免疫组织化学分析蛋白质分布。后者可结合详细的组织学分析，以进一步完善表型特征的鉴定。 6这种多因素分析有望通过对同一只动物进行相关性分析，获得新的见解，而这些见解若通过其他方法可能难以实现，或至少需要更复杂的实验方案和小鼠繁育过程。
披露
小鼠组织的采集严格遵循爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（ACURF 0804066）制定的指南和规定。
致谢
共聚焦图像在爱荷华大学卡弗影像中心获得。本研究由美国小企业创新研究计划（SBIR）基金（MH079805）向 B.F. 提供资助。本项目小鼠繁育的额外支持由美国国家耳聋及其他沟通障碍研究所（NIDCD）（5R01DC00559007）向 B.F. 提供。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 原位 杂交： | |||
| PC DIG 洗涤 + 封闭缓冲液套装 | Roche Group | 1585762 | |
| 预混 20x SSC 缓冲液 | Roche Group | 1666681 | |
| 蛋白酶 K 20mg/ml | Ambion | AM2546 | |
| 焦碳酸二乙酯 (DEPC) | Research Products International Corp. | D43060 | |
| 甲酰胺 | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| 硫酸葡聚糖 | Research Products International Corp. | D20020 | |
| BM Purple | Roche Group | 11442074001 | |
| 抗-地高辛-碱性磷酸酶 Fab 片段 | Roche Group | 11093274910 | |
| RNase A 酶 10mg/ml | Fermentas | EN0531 | |
| RNase Away | Research Products International Corp. | 7003 | |
| 鲑鱼精 DNA 10mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stericup 滤器单元 0.22μm；500ml | EMD Millipore | SCGVU05RE | |
| 滤纸圆片 0.2μm；25mm | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS)，pH 7.4，粉剂包装 | Sigma-Aldrich | P-5368 | |
| 免疫组织化学： | |||
| 山羊血清 | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| H–chst 染料 | Polysciences, Inc. | 9460 | |
| 组织学： | |||
| Poly/Bed 812 包埋介质/DMP-30 试剂盒 | Polysciences, Inc. | 08792-1 | |
| 环氧丙烷 | Sigma-Aldrich | 110205 | |
| 戊二醛溶液 50% | Fisher Scientific | G151 | |
| DPX 封片剂 | Fluka | 44581 | |
| 摇床 | MidSci | 55D1114 | |
| 加热块 | Fisher Scientific | 11-715-125D | |
| 旋转混合仪 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 400110Q | |
| 设定为 60°C 的培养箱 | Fisher Scientific | 11-690-625D | |
| 染料示踪： | |||
| 显微剪刀 | Geuder | G-19775 | |
| 精细镊子 | E.M.S | 72680-F | |
| NeuroVue 染料：栗色、红色、翠绿色 | MTTI | FS-100(1,2,6) | |
| 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Sigma-Aldrich | P-5368 | |
| 解剖显微镜 | Leica Microsystems | M205 FA | |
| 设定为 36°C 的培养箱 | Fisher Scientific | 11-690-506DQ | |
| 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | LSM 510 | |
| 载玻片 | Surgipath | 00240 | |
| 盖玻片 | Surgipath | 00106 | |
| RPI | 甘油 | G22025-0.5 | |
| 多聚甲醛 (4% 和 0.4%) | Fisher Scientific | T353-500 |
参考文献
- Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes. Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).
- Tonniges, J. Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing. Journal of Microscopy. , (2010).
- Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis. J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).
- Gurung, B., Fritzsch, B. Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection. J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).
- Fritzsch, B., Nichols, D. H. DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice. Hear Res. 65, 51-60 (1993).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea. PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).
重印与许可
