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方法文章

从骨骼肌中分离线粒体

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DOI：

10.3791/2452

⸱

2011年3月30日

 ,  , 
1Department of Physiology, University of Kentucky

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于研究从骨骼肌中分离的线粒体呼吸作用的方法。该方法改编自 Scorrano et al. (2007)。线粒体分离过程约需2小时，线粒体呼吸测定可在约1小时内完成。

摘要

线粒体是控制细胞生死的细胞器，参与关键的代谢反应，合成大部分ATP，并调控多种信号级联通路2,3。过去和当前的研究人员已从大鼠和小鼠的肝脏、脑和心脏等组织中分离出线粒体4,5。近年来，许多研究人员致力于研究骨骼肌中的线粒体功能。

本文介绍了一种我们已成功用于从骨骼肌中分离线粒体的方法6。该实验流程要求所有缓冲液和试剂均需新鲜配制，并需要约250–500 mg的骨骼肌组织。我们研究了从大鼠和小鼠腓肠肌、膈肌以及大鼠眼外肌中分离得到的线粒体。线粒体蛋白浓度采用Bradford法测定。在制备过程中，必须将线粒体样品保持在冰上低温环境，并在较短时间内（约1小时）完成功能检测。线粒体呼吸作用在37°C条件下使用带有克拉克型氧电极的极谱法（Oxygraph系统）进行测定7。氧电极的校准是本方案中的关键步骤，必须每天进行。将分离得到的线粒体（150 μg）加入0.5 ml实验缓冲液（EB）中。加入谷氨酸（5 mM）和苹果酸（2.5 mM）启动状态2呼吸；随后加入二磷酸腺苷（ADP）（150 μM）以启动状态3呼吸；使用寡霉素（1 μM）——一种ATP合酶抑制剂——来评估状态4呼吸；最后加入羰基氰化对-三氟甲氧基苯腙（FCCP，0.2 μM）以测定状态5，即解偶联呼吸6。每次实验后计算呼吸控制比（RCR），即状态3与状态4的比值。RCR ≥4 被认为是线粒体制备具有活性的可靠指标。

综上所述，我们介绍了一种从骨骼肌中分离具有活性的线粒体的方法，该方法可用于生化研究（如酶活性、免疫检测、蛋白质组学）和功能研究（线粒体呼吸）。

方案

1. 缓冲液的配制

  1. 开启离心机 5804R 并设置温度为 4°C。开启 Isotemp 3006D 水浴锅并设置温度为 37°C。
  2. 在肌肉分离前，配制以下溶液：
    • PBS：将磷酸盐缓冲液（PBS）片剂溶解于蒸馏水中（每升水加入 5 片），充分混匀。
    • 含 10 mM EDTA 的 PBS：取 2 ml 500 mM EDTA 加入 98 ml PBS 中，配制成 100 ml 溶液。
    • 8X 线粒体缓冲液：加入 10.28 g 蔗糖，终浓度为 0.6 M；400 mg 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA），终浓度为 0.8%；2.08 g HEPES，终浓度为 160 mM；用蒸馏水定容至 50 ml，并调节 pH 至 7.4。
    • 分离缓冲液 1（IB1）：加入 200 μl 500 mM EDTA（终浓度为 10 mM）、0.392 g D-甘露醇（终浓度为 215 mM）、1.25 ml 8X 线粒体缓冲液，用蒸馏水定容至 10 ml 并调节 pH 至 7.4。
    • 分离缓冲液 2（IB2）：加入 60 μl 500 mM EGTA（终浓度为 3 mM）、0.392 g D-甘露醇（终浓度为 215 mM）、1.25 ml 8X 线粒体缓冲液，用蒸馏水定容至 10 ml 并调节 pH 至 7.4。
    • 实验缓冲液（EB）：加入 100 μl 500 mM MgCl2（终浓度为 5 mM）、0.392 g D-甘露醇（终浓度为 215 mM）、25 μl 2.5 mM KH2PO4（终浓度为 6.25 μM）、2 μl 100 mM EGTA（终浓度为 20 μM）、1.25 ml 线粒体缓冲液，用蒸馏水定容至 10 ml 并调节 pH 至 7.4。

2. 肌肉分离

  1. 在冰桶中放置三个 10 ml 烧杯、Potter-Elvehjem 组织研磨器以及所有其他必需的仪器/耗材，并置于冰上。整个实验过程中，所有物品必须始终保持冰冷却状态。
  2. 将 IB1 和 IB2 置于冰桶中，EB 则置于温水浴中备用。
  3. 在三个 10 ml 烧杯中应分别加入以下溶液：
    • 烧杯 1：10 ml PBS
    • 烧杯 2：10 ml PBS/EDTA
    • 烧杯 3：3 ml IB1
  4. 按照当地机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方法人道处死一只大鼠。
  5. 迅速分离 250–500 mg 骨骼肌组织，先在烧杯 1 中冲洗，然后转移至烧杯 2 中。

3. 匀浆/线粒体分离

  1. 将肌肉转移至3号烧杯，用剪刀将肌肉精细剪碎。
  2. 将溶液转移至Potter-Elvehjem匀浆器中，使用电动研杵（钻床亦可）匀浆10次，全程保持离心管置于冰上。
  3. 将匀浆液转移至预冷的2 ml 微量离心管中，在4°C下以700 g 离心10分钟。
  4. 将上清液转移至新的预冷微量离心管中，弃去沉淀。
  5. 将上清液在4°C下以10,500 g 离心10分钟。
  6. 将上清液转移至新的预冷微量离心管中，标记为SN1（上清液1号）及肌肉类型。
  7. 用500 μl IB2重悬沉淀。
  8. 在4°C下以10,500 g 离心10分钟。
  9. 将上清液转移至新的预冷微量离心管中，标记为SN2（上清液2号）及肌肉类型。
  10. 用100 μl IB2悬浮最终的线粒体沉淀。
  11. 将最终的线粒体悬液在小型离心机中短暂离心数秒。若有沉淀，将上清液转移至新的预冷微量离心管中，弃去沉淀。
  12. 采用Bradford法测定蛋白浓度8。

4. 电极校准

注意：在线粒体分离过程中完成电极校准。

  1. 向250 ml锥形瓶中加入100 ml蒸馏水。剧烈搅拌20分钟，使水与大气气体达到平衡。
  2. 向氧电极中加入几滴50% KCl溶液。
  3. 将一小片蓝色Rizla卷烟纸置于电极顶部。
  4. 将一片PTFE膜置于卷烟纸上。
  5. 使用环形安装器装入内环，然后将外环放入电极的凹槽中。
  6. 连接电极并组装其余设备：较大的塑料环底座、线粒体室和水管。
  7. 打开氧测定仪设备并启动氧测定仪软件。
  8. 将已平衡的水加入线粒体室中。
  9. 加入搅拌子，并将转速调至60。
  10. 开始一项新实验。
  11. 点击“校准”，然后选择1号箱的液相校准。将温度更改为37°C，点击“确定”两次。
  12. 当“Override”变为“OK”时，点击该按钮并打开氮气罐。
  13. 将连接氮气罐的导管插入反应室，建立零氧环境。当状态从“Override”切换后，点击“OK”。
  14. 吸去水，向线粒体室中加入500 μl EB缓冲液。
  15. 用推杆密封反应室。
  16. 若使用多个测定箱，请重复步骤11至15，完成2号箱的校准。

5. 线粒体呼吸

  1. 启动新实验，运行约1分钟以稳定信号。
  2. 向每个腔室加入足量的线粒体悬液（步骤3.11），使终浓度为150 μg，标记事件，并继续运行1分钟。
  3. 加入10 μl预热的250 mM/125 mM谷氨酸/苹果酸溶液，使终浓度为5 mM/2.5 mM。标记并运行1分钟。此阶段定义为状态2（State 2）。
  4. 加入7.5 μl的10 mM ADP溶液，使终浓度为150 μM，标记后运行30秒。此阶段定义为状态3（State 3）。
  5. 再次加入7.5 μl的10 mM ADP溶液，标记后运行1.5分钟。
  6. 加入0.5 μl预冷的10 mM寡霉素（oligomycin）溶液，使终浓度为1 μM，标记后运行3分钟。此阶段定义为状态4（State 4）。
  7. 加入1 μl预冷的0.1 mM FCCP溶液，使终浓度为0.2 μM，标记后运行3分钟。此阶段定义为状态5（State 5）。
  8. 实验结束后，停止运行并保存数据。
  9. 使用Oxygraph软件获取呼吸速率。
  10. 输入归一化因子：若加入的线粒体蛋白量为150 μg，则归一化因子为0.15。
  11. 计算不同呼吸状态下的归一化呼吸速率。
  12. 通过将状态3（State 3）除以状态4（State 4）计算呼吸控制比（Respiratory Control Ratio, RCR）。

6. 代表性结果：

线粒体呼吸图；nmol O2/ml 与时间的关系；谷氨酸/苹果酸、ADP、寡霉素、FCCP。
图 1. 显示骨骼肌线粒体耗氧量的代表性记录曲线。在电极信号稳定后，将线粒体样品加入氧电极室。加入谷氨酸和苹果酸后启动状态 2 呼吸。加入 ADP 后耗氧量增加，定义为状态 3 呼吸。加入寡霉素以抑制 ATP 合酶，获得状态 4 呼吸。最后加入 FCCP 以解偶联线粒体呼吸（状态 5）。表 1 显示了状态 2、3、4 和 5 的代表性耗氧速率。每次实验均计算呼吸控制比（RCR）。RCR ≥4 被认为是线粒体制备物具有活性的证据。

状态标准化速率
状态 234.74
状态 3153.40
状态 416.49
状态 5143.70
RCR9.30

表1. 线粒体呼吸速率。 来自骨骼肌线粒体的代表性耗氧速率。数值已根据加入呼吸室的线粒体量进行归一化处理。呼吸控制比（RCR）通过将状态3除以状态4计算得出。RCR≥4 表示线粒体制备物具有活性。

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讨论

我们提供一种从骨骼肌中分离有活性线粒体的方案。如果产量较低，可通过将分离的肌肉组织在冰上用5 ml PBS/10 mM EDTA/0.01%胰蛋白酶溶液孵育30分钟来优化方案。为确保胰蛋白酶对肌肉组织的完全消化，肌肉必须充分剪碎。30分钟孵育后，必须将PBS/10 mM EDTA/0.01%胰蛋白酶溶液完全替换为3 ml线粒体分离缓冲液1（IB1）。此外，在呼吸测定实验中，胰蛋白酶的使用可能会干扰某些线粒体底物。但在本方案中，所使用的所有底物在采用胰蛋白酶处理时均能获得良好的线粒体制备结果。

对于小鼠骨骼肌，最好合并两条后肢的腓肠肌，或使用整块膈肌。对于大鼠骨骼肌，取一小段腓肠肌或膈肌即可。肌肉组织过多会增加分离操作的难度，并导致得率降低。若需分离眼外肌等非常小的肌肉，则必须合并来自多只动物的肌肉组织，以获得足够的肌肉质量。

本实验方案涉及两种不同的上清液：SN1 和 SN2。这些上清液是差速离心的产物，含有非线粒体蛋白。可将这些上清液以及最终线粒体沉淀中的蛋白质用于 Western 印迹，以验证线粒体制剂的纯度。使用线粒...

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致谢

本工作获得了美国国家眼科研究所（R01 EY12998）向 F.H. Andrade 提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
95% CO2 / 5% O₂2 混合本地气体供应商
腺苷5′′二磷酸钠盐Sigma-AldrichA2754
蓝色Rizla卷烟纸Hansatech890101
Bradford 蛋白质测定伯乐（Bio-Rad）500-0006
羰基氰化对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）Sigma-AldrichC2920
Centrifuge 5804REppendorf
压缩氮气当地气体供应商
D-甘露醇Sigma-AldrichM9647
乙二醇双四乙酸（EGTA）Sigma-AldrichE3889
乙二胺四乙酸（EDTA）伯乐（Bio-Rad）161-0728
游离脂肪酸-牛血清白蛋白Sigma-AldrichA8806
谷氨酸Sigma-AldrichG5889
HEPES 钠盐Sigma-AldrichH7006
Isotemp 3006DFisher Scientific
氯化镁Sigma-AldrichM8266
雄性Sprague Dawley大鼠Harlan Laboratories300-500克
苹果酸Sigma-AldrichM9138
迷你离心机ISC BioexpressC1301P
寡霉素Sigma-AldrichO4876
氧电极圆盘HansatechS1
氧电极Hansatech
Oxygraph Plus V1.01 软件Hansatech
pH计Mettler Toledo1225506149
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichP4417
氯化钾Sigma-AldrichP3911
磷酸钾Sigma-AldrichP8416
波特-埃尔维耶姆匀浆器Fisher Scientific08-414-14A
聚四氟乙烯（0.0125 mm） × 25毫米膜HansatechS4
SKIL 3320 台式钻床五金店
蔗糖Sigma-AldrichS5016

参考文献

  1. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
  2. Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).
  3. Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
  4. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  5. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
  6. Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
  7. Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).

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线粒体呼吸Bradford 法极谱法离心匀浆氧电极呼吸控制比状态 3 呼吸
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