本方案描述了一种用于研究从骨骼肌中分离的线粒体呼吸作用的方法。该方法改编自 Scorrano et al. (2007)。线粒体分离过程约需2小时，线粒体呼吸测定可在约1小时内完成。
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摘要
摘要
线粒体是控制细胞生死的细胞器，参与关键的代谢反应，合成大部分ATP，并调控多种信号级联通路2,3。过去和当前的研究人员已从大鼠和小鼠的肝脏、脑和心脏等组织中分离出线粒体4,5。近年来，许多研究人员致力于研究骨骼肌中的线粒体功能。
本文介绍了一种我们已成功用于从骨骼肌中分离线粒体的方法6。该实验流程要求所有缓冲液和试剂均需新鲜配制，并需要约250–500 mg的骨骼肌组织。我们研究了从大鼠和小鼠腓肠肌、膈肌以及大鼠眼外肌中分离得到的线粒体。线粒体蛋白浓度采用Bradford法测定。在制备过程中，必须将线粒体样品保持在冰上低温环境，并在较短时间内（约1小时）完成功能检测。线粒体呼吸作用在37°C条件下使用带有克拉克型氧电极的极谱法（Oxygraph系统）进行测定7。氧电极的校准是本方案中的关键步骤，必须每天进行。将分离得到的线粒体（150 μg）加入0.5 ml实验缓冲液（EB）中。加入谷氨酸（5 mM）和苹果酸（2.5 mM）启动状态2呼吸；随后加入二磷酸腺苷（ADP）（150 μM）以启动状态3呼吸；使用寡霉素（1 μM）——一种ATP合酶抑制剂——来评估状态4呼吸；最后加入羰基氰化对-三氟甲氧基苯腙（FCCP，0.2 μM）以测定状态5，即解偶联呼吸6。每次实验后计算呼吸控制比（RCR），即状态3与状态4的比值。RCR ≥4 被认为是线粒体制备具有活性的可靠指标。
综上所述，我们介绍了一种从骨骼肌中分离具有活性的线粒体的方法，该方法可用于生化研究（如酶活性、免疫检测、蛋白质组学）和功能研究（线粒体呼吸）。
方案
1. 缓冲液的配制
- 开启离心机 5804R 并设置温度为 4°C。开启 Isotemp 3006D 水浴锅并设置温度为 37°C。
- 在肌肉分离前，配制以下溶液：
- PBS：将磷酸盐缓冲液（PBS）片剂溶解于蒸馏水中（每升水加入 5 片），充分混匀。
- 含 10 mM EDTA 的 PBS：取 2 ml 500 mM EDTA 加入 98 ml PBS 中，配制成 100 ml 溶液。
- 8X 线粒体缓冲液：加入 10.28 g 蔗糖，终浓度为 0.6 M；400 mg 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA），终浓度为 0.8%；2.08 g HEPES，终浓度为 160 mM；用蒸馏水定容至 50 ml，并调节 pH 至 7.4。
- 分离缓冲液 1（IB1）：加入 200 μl 500 mM EDTA（终浓度为 10 mM）、0.392 g D-甘露醇（终浓度为 215 mM）、1.25 ml 8X 线粒体缓冲液，用蒸馏水定容至 10 ml 并调节 pH 至 7.4。
- 分离缓冲液 2（IB2）：加入 60 μl 500 mM EGTA（终浓度为 3 mM）、0.392 g D-甘露醇（终浓度为 215 mM）、1.25 ml 8X 线粒体缓冲液，用蒸馏水定容至 10 ml 并调节 pH 至 7.4。
- 实验缓冲液（EB）：加入 100 μl 500 mM MgCl....
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讨论
我们提供一种从骨骼肌中分离有活性线粒体的方案。如果产量较低，可通过将分离的肌肉组织在冰上用5 ml PBS/10 mM EDTA/0.01%胰蛋白酶溶液孵育30分钟来优化方案。为确保胰蛋白酶对肌肉组织的完全消化，肌肉必须充分剪碎。30分钟孵育后，必须将PBS/10 mM EDTA/0.01%胰蛋白酶溶液完全替换为3 ml线粒体分离缓冲液1（IB1）。此外，在呼吸测定实验中，胰蛋白酶的使用可能会干扰某些线粒体底物。但在本方案中，所使用的所有底物在采用胰蛋白酶处理时均能获得良好的线粒体制备结果。
对于小鼠骨骼肌，最好合并两条后肢的腓肠肌，或使用整块膈肌。对于大鼠骨骼肌，取一小段腓肠肌或膈肌即可。肌肉组织过多会增加分离操作的难度，并导致得率降低。若需分离眼外肌等非常小的肌肉，则必须合并来自多只动物的肌肉组织，以获得足够的肌肉质量。
本实验方案涉及两种不同的上清液：SN1 和 SN2。这些上清液是差速离心的产物，含有非线粒体蛋白。可将这些上清液以及最终线粒体沉淀中的蛋白质用于 Western 印迹，以验证线粒体制剂的纯度。使用线粒.......
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致谢
本工作获得了美国国家眼科研究所（R01 EY12998）向 F.H. Andrade 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O₂2 混合 | 本地气体供应商 | ||
| 腺苷5′′二磷酸钠盐 | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| 蓝色Rizla卷烟纸 | Hansatech | 890101 | |
| Bradford 蛋白质测定 | 伯乐（Bio-Rad） | 500-0006 | |
| 羰基氰化对-三氟甲氧基苯腙（FCCP） | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | ||
| 压缩氮气 | 当地气体供应商 | ||
| D-甘露醇 | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| 乙二醇双四乙酸（EGTA） | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0728 | |
| 游离脂肪酸-牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| 谷氨酸 | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| HEPES 钠盐 | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 雄性Sprague Dawley大鼠 | Harlan Laboratories | 300-500克 | |
| 苹果酸 | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| 迷你离心机 | ISC Bioexpress | C1301P | |
| 寡霉素 | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| 氧电极圆盘 | Hansatech | S1 | |
| 氧电极 | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01 软件 | Hansatech | ||
| pH计 | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| 磷酸钾 | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| 波特-埃尔维耶姆匀浆器 | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| 聚四氟乙烯（0.0125 mm） × 25毫米膜 | Hansatech | S4 | |
| SKIL 3320 台式钻床 | 五金店 | ||
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S5016 |
参考文献
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S....
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