方法文章

骨骼肌的线粒体分离

DOI：

10.3791/2452

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2011年3月30日

 ,  , 
1Department of Physiology, University of Kentucky

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这个协议描述一个过程来研究从骨骼肌中分离出的线粒体呼吸。这种方法改编自Scorrano等。（2007年）。线粒体的分离过程中需要约2小时。线粒体呼吸在大约1个小时就可以完成。

摘要

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线粒体是细胞器控制细胞死亡的生命和。他们参与重要的代谢反应，合成的ATP，规范的信号级联 2,3 。过去和目前研究人员已经从大鼠和小鼠的组织，如肝，脑和心脏4,5中分离出线粒体。近年来，许多研究人员都集中在研究从骨骼肌线粒体功能。

在这里，我们描述了，我们已经成功地用于从 6骨骼肌线粒体隔离的方法。我们的程序要求，所有的缓冲液和试剂都取得了新的和需要约250-500毫克骨骼肌。我们研究了从大鼠和小鼠腓肠肌和隔膜中分离出线粒体，鼠眼外肌。线粒体蛋白浓度测定Bradford法。重要的是保持在编制和功能的研究是一个相对较短的时间（约1小时）内进行线粒体样品冰冷。线粒体呼吸是用一个克拉克型电极（Oxygraph系统）在37 ° C 7极谱。氧电极的校准是在本议定书中的关键一步，它每天必须执行。隔离线粒体（150微克）被添加到实验缓冲液（EB）0.5毫升。国家2呼吸开始，除谷氨酸（5MM）和苹果酸（2.5毫米）。然后，二磷酸腺苷（ADP）（150微米）被添加到启动状态3。寡（1μM），ATP酶合成酶阻断剂，用于估计状态4。最后，羰基氰化物的P -三氟甲氧基] -苯基腙（FCCP，0.2微米）添加到measurestate 5，或耦合呼吸 6 。呼吸控制率（RCR），状态3状态4的比例，计算后，每一个实验。 RCR≥4被认为是一个可行的线粒体准备的证据。

总之，我们目前的隔离，可用于生化（例如，研究酶的活性，免疫检测，蛋白质组学）和功能（线粒体呼吸）的骨骼肌线粒体可行的方法。

方案

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1。缓冲区的制备

  1. 开启离心机5804R，并设置为4 ° C。 Isotemp 3006D水浴，并设置转到37 ° C
  2. 肌肉隔离前的准备以下解决方案:
    • PBS:磷酸盐缓冲液（PBS）药片溶解在蒸馏水（5片/升）。拌匀。
    • PBS加10 mM的EDTA:要准备100毫升溶液，添加98毫升的PBS 2毫升500毫米EDTA。
    • 8X线粒体缓冲液:蔗糖10.28克终浓度为0.6米，400毫克的自由脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）终浓度为0.8％，为160毫米的终浓度2.08克HEPES，pH值7.4和QS至50毫升，用蒸馏水。
    • 隔离缓冲1（IB1）:加入200μL500 mM的EDTA的终浓度为10毫米，0.392克终浓度为215毫米D -甘露醇，8X线粒体缓冲液，pH 1.25毫升至7.4和QS至10毫升，用蒸馏水。
    • 隔离缓冲2（IB2）:加入终浓度为3毫米，0.392克终浓度为215毫米D -甘露醇，8X线粒体缓冲液，pH 1.25毫升至7.4和QS 60至10μL500毫米EGTA毫升，用蒸馏水。
    • 实验缓冲液（EB）:加入终浓度为100μLMgCl 2的 500毫米的终浓度为5毫米，0.392克终浓度为215毫米D -甘露醇，25微升2.5毫米KH 2 PO 4 6.25微米，2个100毫米EGTAμL终浓度为20微米，1.2....

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讨论

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我们提出了一个协议孤立可行的骨骼肌线粒体。如果收益率是一个问题，该协议可以修改孵化5毫升30分钟，在冰PBS/10mM EDTA/0.01％胰蛋白酶的孤立肌肉。为了保证胰蛋白酶完成肌肉消化，肌肉需要充分剁碎。 PBS/10mM EDTA/0.01％胰蛋白酶溶液孵育30分钟后，必须完全取代隔离缓冲区1（IB1）3毫升。此外，使用胰蛋白酶，可能会干扰线粒体呼吸协议中的一些基板。这一协议处于良好的使用胰蛋白酶时线粒体准备的结果在所有使用的基板。

对于小鼠骨骼肌，它是最好的结合两条腿腓肠肌，或使用整个隔膜。对于大鼠骨骼肌，腓肠肌或隔膜的一小部分就足够了。过度的肌肉质量，产量降低复杂的分离过程和结果。对于非常小的肌肉，如眼外肌的隔离，它是从1个多动物要池肌肉，以获得必要的的肌肉质量。

该协议是指两个不同的上清:SN1和SN2。这些上清差速离心和包含非线粒体的蛋白质。从这些上清，从最终的线粒体颗粒的蛋白质可用于免疫印迹验证线粒体制剂的纯度。利用线粒体和细胞质抗体蛋白印迹确认您的线粒体准备在最后的颗粒的纯度。

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
没有利益冲突的声明。

致谢

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这项工作是由一个由美国国家眼科研究所（R01 EY12998）授予FH安德拉德支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
95% CO2 / 5% O₂2 混合本地气体供应商
腺苷5′′二磷酸钠盐Sigma-AldrichA2754
蓝色Rizla卷烟纸Hansatech890101
Bradford 蛋白质测定伯乐（Bio-Rad）500-0006
羰基氰化对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）Sigma-AldrichC2920
Centrifuge 5804REppendorf
压缩氮气当地气体供应商
D-甘露醇Sigma-AldrichM9647
乙二醇双四乙酸（EGTA）Sigma-AldrichE3889
乙二胺四乙酸（EDTA）伯乐（Bio-Rad）161-0728
游离脂肪酸-牛血清白蛋白Sigma-AldrichA8806
谷氨酸Sigma-AldrichG5889
HEPES 钠盐Sigma-AldrichH7006
Isotemp 3006DFisher Scientific
氯化镁Sigma-AldrichM8266
雄性Sprague Dawley大鼠Harlan Laboratories300-500克
苹果酸Sigma-AldrichM9138
迷你离心机ISC BioexpressC1301P
寡霉素Sigma-AldrichO4876
氧电极圆盘HansatechS1
氧电极Hansatech
Oxygraph Plus V1.01 软件Hansatech
pH计Mettler Toledo1225506149
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichP4417
氯化钾Sigma-AldrichP3911
磷酸钾Sigma-AldrichP8416
波特-埃尔维耶姆匀浆器Fisher Scientific08-414-14A
聚四氟乙烯（0.0125 mm） × 25毫米膜HansatechS4
SKIL 3320 台式钻床五金店
蔗糖Sigma-AldrichS5016

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
  2. Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S....

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Bradford 3

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