本视频展示了一种在死后眼球中有效区分和解剖人玻璃体各种半透明结构的技术。
本文内容
摘要
摘要
玻璃体是一种光学透明的胶原性细胞外基质，充满眼球内部并覆盖于视网膜表面。1,2 玻璃体亚结构与视网膜之间的异常相互作用是多种玻璃体视网膜疾病的基础，包括视网膜裂孔和脱离、黄斑皱褶、黄斑裂孔、年龄相关性黄斑变性、玻璃体黄斑牵拉、增殖性玻璃体视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变以及遗传性玻璃体视网膜病。1,2 目前尚不清楚玻璃体亚结构的分子组成。由于玻璃体本身透明且手术可及性有限，因此在分子水平上研究其亚结构一直存在困难。我们开发了一种方法，用于分离并保存这些组织，以进行蛋白质组学和生物化学分析。本实验视频中的解剖技术展示了如何从人眼死后眼球中分离出玻璃体基底部、前界膜、玻璃体核心和玻璃体皮质。对每种玻璃体成分进行的一维SDS-PAGE分析表明，我们的解剖技术可获得四种不同的蛋白质谱型，分别对应人玻璃体的各个亚结构。鉴定出在不同区室中分布的蛋白质将揭示各种玻璃体视网膜疾病的潜在致病分子。
方案
1. 前节组织解剖。
- 使用15°刀片在角膜缘处切开前房（图1），然后将弯曲的角膜-巩膜剪的一叶插入前房，在角膜缘前方进行环形切割，以摘除角膜。
- 使用0.12 Colibri镊子和Westcott剪刀在睫状体前方对虹膜进行环形剪切。
- 使用0.12 Colibri镊子或超锐15°刀片取出晶状体核，用镊子清除皮质和囊膜。
2. 玻璃体核心抽吸。
- 将连接5 mL注射器的23号针头插入玻璃体中央（图1）。
- 轻柔抽吸约1 mL或更多的玻璃体核心样本。
- 将样本置于微量离心管中，随后放入液氮中。
3. 前部玻璃体后界膜分离术。
- 通过调节鹅颈显微镜光源的入射光线，可观察到呈半透明环状的前界膜。先前抽取玻璃体核心有助于将前界膜与其他结构分离，从而更易于识别。
- 使用Colibri镊或敷料镊小心将弹性组织薄片从睫状体上剥离，并用Vannas剪刀剪下。重复此操作。
- 将样本置于微量离心管中，随后放入液氮中。
4. 玻璃体基部剥离。
- 使用0.12号镊子固定眼球杯，用Westcott剪刀从睫状体向视神经乳头方向做四个等距的应力释放切口，将眼球“剪成花瓣状”。
- 使用Westcott剪刀切除每个象限中的睫状体皱褶部（图2）。
- 用镊子在锯齿缘两侧的睫状体平坦部及视网膜处夹住玻璃体基底部（图2）。
- 用镊子持续牵拉玻璃体基底部，同时用Westcott剪刀逐步剪切，可分离出呈半透明、具有“串珠样”外观的组织。
- 将样本放入微量离心管中，随后置于液氮中。
5. 玻璃体皮质去除
- 使用Westcott剪刀在锯齿缘后约3 mm处切除每个象限的睫状体平坦部（图2）。
- 在组织瓣之间，可观察到玻璃体皮质呈半透明薄膜状。
- 用0.12有齿镊夹住该弹性膜，或用Weck-Cel手术海绵依靠黏附力固定，将玻璃体皮质从视网膜上牵拉分离，并用Westcott剪刀切除（图1）。
- 将样本置于微量离心管中，随后放入液氮中。所有样本均在-80°C下保存，直至用于实验。
6. 代表性结果
组织样本可通过多种方法进行处理，以用于特定实验。在本实验中，样本被用于SDS-PAGE蛋白质分析（图3）。
图1. 人眼横截面示意图，显示玻璃体的不同亚结构。 最前部的玻璃体是一层薄的胶原层，称为前玻璃体后界膜。玻璃体核心包含玻璃体的整个中心区域。与玻璃体基底部相比，该部分含水量更高，呈液态；而玻璃体基底部则较为黏稠，可用镊子夹持，并牢固附着于下方的睫状体和视网膜。包围玻璃体核心的是一层极薄的胶原壳，称为玻璃体皮质。
图 2. 玻璃体基底部解剖结构。 玻璃体基底部是玻璃体中沿锯齿缘（白色箭头）分布的一个半透明亚结构，锯齿缘是分隔睫状体与视网膜的分界线。玻璃体基底部的前界越过睫状体的平坦部（白色实线）。其后界位于锯齿缘后方 2–3 mm 处（白色虚线）。为切除玻璃体基底部，需使用镊子夹住组织，并将其从下方的睫状体和视网膜上牵拉剥离。抬起后，使用Westcott剪刀沿基底部进行剪切。
图3. 玻璃体组分的一维SDS-PAGE分析。 前部玻璃体后界膜、玻璃体基底部、玻璃体核心和玻璃体皮质的总蛋白浓度分别为11.24、20.1、16.61、14.24 mg/mL。凝胶电泳在200 kV下进行45分钟，使用Flamingo染色剂（Bio-Rad）染色，并通过VersaDoc成像系统（Bio-Rad）进行可视化检测。不同组织的电泳图谱显示出若干相似条带，提示存在保守蛋白或交叉污染蛋白；同时也存在特异性条带（星号标记），提示为差异性定位的蛋白。
讨论
玻璃体是一种半透明凝胶，其分子组成尚不明确，尤其是其亚结构（玻璃体基底部、核心、皮质和前部玻璃体膜）的组成。玻璃体核心含有胶原蛋白II、V、IX和XI，以及硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和透明质酸1,2。玻璃体核心中的蛋白质生物标志物已被证实与糖尿病视网膜病变等疾病相关3-5。然而，这些蛋白质在各个亚结构中的差异表达情况，以及许多情况下具体的蛋白质身份仍不清楚。这些细节可能有助于揭示与特定玻璃体视网膜疾病相关的蛋白质来源，并为未来的治疗提供靶向依据。尽管目前尚未确定组织解剖的最佳死后时间间隔，但蛋白质降解可能会影响后续实验。例如，免疫组织化学在死后12小时的眼组织中已受到影响，某些特定酶活性可能在数小时内下降（未发表观察结果）。本研究中所有组织均在死亡后2至8小时内采集，此时间段内蛋白质表达无明显变化，适合进行蛋白质组学分析。本研究选择液氮冷冻法保存组织，而非固定法，以避免固定剂交联引起的蛋白质结构微小变化，此类变化已在其他组织中通过LC-MS/MS得到证实6。蛋白质组学研究依赖于精确分离玻璃体不同区室的能力，本视频实验即展示了这一解剖技术。我们已通过一维SDS-PAGE验证了该解剖技术。结果表明，玻璃体不同亚结构中存在差异表达的蛋白质。鉴定这些蛋白质将有助于更深入理解玻璃体的区室化特征。
致谢
资金由 Fight for Sight 提供。组织样本来自爱荷华州狮子会眼科库。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.12 号镊子 | Storz Ophthalmics | E1502 | |
| 5 ml 注射器 | BD Biosciences | 309603 | |
| 带齿直纹敷料镊 | Storz Ophthalmics | E1400 | |
| 23 号针头 | BD Biosciences | 305145 | |
| 蜂鸟镊 | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Castroviejo 角膜剪（弯头） | Storz Ophthalmics | E3223 | |
| Vannas 弯头囊膜剪 | Storz Ophthalmics | E3387 | |
| Weck-Cel 外科棉签 | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Westcott 弯头肌腱剪 | Storz Ophthalmics | E3320 |
参考文献
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).
- Yoshimura, T. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Azimzadeh, O. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
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