采用湿法研磨、均质化和超声处理方法制备了茚地那韦、利托那韦、依非韦伦和阿扎那韦的纳米颗粒。这些纳米制剂统称为纳米制剂化抗逆转录病毒治疗（nanoART），用于评估基于巨噬细胞的药物递送。测定了单核细胞来源巨噬细胞对纳米ART的摄取、滞留及持续释放情况。这些初步研究表明，纳米ART在临床应用方面具有潜力。
方法文章
血液来源巨噬细胞携带纳米制剂抗逆转录病毒药物的方法学开发
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
纳米制剂药物可改善药效学和生物利用度，同时降低抗逆转录病毒药物（ART）的毒性。为此，本实验室应用纳米医学原理，简化ART治疗方案，从而在降低毒性的同时提高患者依从性及药物药代动力学特性。本文展示了制备纳米制剂抗逆转录病毒药物（nanoART）的简单且可靠的方法。将纯药物颗粒通过一层表面活性脂质包衣进行包裹，并利用湿法研磨或高压均质化技术将较大的药物晶体破碎成更小的颗粒。另一种方法是将游离药物悬浮于聚合物液滴中：先将药物溶解于聚合物中，再通过超声处理震荡，直至形成单个纳米级液滴。采用动态光散射和显微镜检查对颗粒的物理性质（粒径、电荷和形态）进行表征。其生物学特性（细胞摄取与滞留、细胞毒性及抗逆转录病毒活性）则通过人单核细胞来源巨噬细胞（MDM）进行测定。MDM由白细胞分离包中分离的人外周血单核细胞经离心淘析法纯化后获得。此类血液来源的巨噬细胞可用作细胞载体，将nanoART递送至人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的器官。我们认为，将临床上已有的抗逆转录病毒药物重新包装为纳米颗粒用于HIV-1治疗，有望提高治疗依从性，并对疾病转归产生积极影响。
方案
纳米药物制造
1. 采用 NETZSCH MicroCer 方法进行湿法研磨纳米抗逆转录病毒药物
- 使用分析天平称取用于制备纳米制剂的药物晶体及各种表面活性剂，并用T-18 Ultraturrax混合器将其与10 mM Hepes缓冲液（pH 7.8）混合，直至完全分散。制剂中药物的含量应介于1%至2%之间。
- 进行连续研磨时，确保冷却器和压缩机已开启。在开始研磨样品前，出口压力应约为100 PSI。
- 打开控制单元，并旋转研磨罐，以便将研磨介质装入罐中。
- 使用漏斗向研磨腔内加入50 mL珠子。确保螺纹处或研磨腔外部任何位置均无珠子，以避免机械密封处发生泄漏。
- 确认O型圈已正确安装在研磨腔上。选择合适的筛网孔径，并使用相应的盖子组件，通过拧紧螺母固定盖子。筛网孔径应至少为珠子尺寸的一半。在连续研磨过程中，应使用较大的筛网孔径，以防止产物堵塞滤网。
- 使用研磨腔顶部的旋钮将研磨腔调至水平位置，并确保产物出口管通向收集容器。
- 将含有不同量表面活性剂的药物悬浮液加入产物入口。悬浮液的最小体积应为100 mL。这可以防止研磨腔过热，并因部件磨损减少而避免珠子污染。
- 使用控制单元启动泵。根据制剂需要调节流速（约50–150 mL/min）。
- 开启搅拌器，并在控制单元上调节转速。在MicroCer设备上，转速可从620 rpm逐步增加至4320 rpm。通过安装在研磨腔顶部的温度计监测温度，确保无过热现象。
- 在不同转速和流速下研磨样品，并取出少量等分试样（约1 mL），使用Brookhaven Zetasizer动态光散射仪测定粒径和电荷（见表1）。
- 达到目标粒径后，使用控制单元停止研磨。保持泵运行，将样品收集至烧瓶中。让药物完全排入样品收集烧瓶。
- 关闭泵。为去除珠子，在设备下方放置收集盘。松开盖子组件前板上的螺母，并将珠子收集至盘中。取下前板，使用去离子水瓶冲洗，将残留珠子冲入收集盘。
- 将研磨后的悬浮液转移至50 mL离心管中，设置离心机在10,000 rpm（10,174 rcf）下离心30分钟。离心结束后，测量上清液体积，并用等量的新鲜表面活性剂溶液替换。
- 完成重悬后，将悬浮液转移回研磨腔，继续研磨10分钟。取一份等分试样（约1 mL），再次使用Zetasizer测定样品的粒径和电荷（见表1）。
- 使用去离子水和70%乙醇对MicroCer设备进行使用后的清洗。
- 采用HPLC测定纳米ART制剂的浓度。在本实验中，我们采用反相HPLC对样品进行分析：将20 μL样品三针进样至YMC Octyl C8色谱柱（Waters Inc., Milford, MA），配备C8保护柱。流动相为48%乙腈 / 52% 25 mM KH2PO4（pH 4.15），流速0.4 mL/min，紫外/可见光检测波长为272 nm。所有药物浓度的定量均通过与甲醇中配制的各游离药物标准曲线（0.025–100 μg/mL）比较确定。
2. 使用 Avestin EmulsiFlex C5 进行纳米抗逆转录病毒药物治疗制剂的均质化
- 使用分析天平称取用于制备纳米制剂的药物晶体和各种表面活性剂，并用 T-18 Ultraturrax 匀浆器将其与 10 mM Hepes 缓冲液（pH 7.8）混合，以获得完全分散的体系。
- 将悬浮液转移至均质容器中并开始循环。在启动样品均质前，确保制冷机已开启。
- 逐步升高压力，直至压力表读数达到 20,000 ± 2,000 psi，并持续均质至达到目标粒径。此过程通常需要 45–60 分钟。定期取样（约 1 mL），使用 Zetasizer 测定样品的粒径和电荷（见表 1）。
- 将均质后的悬浮液从均质机转移至 50 mL 离心管中，设置离心机转速为 10,000 rpm（10,174 rcf），离心 30 分钟。离心结束后，测量上清液体积，并用等体积的新鲜表面活性剂溶液替代。
- 重新悬浮后，将悬浮液转移至 C5 均质机中。重新启动循环，将均质压力恢复至 20,000 ± 2,000 psi，继续均质 30 分钟。使用 Zetasizer 测定制剂的粒径和电荷（见表 1）。
- 使用去离子水和乙醇作为溶剂对设备进行后续清洗。
- 采用 HPLC 测定样品的浓度。
3. 使用 Cole Parmer 超声波处理器进行超声处理
- 量取 50 mL 二氯甲烷倒入玻璃烧杯中。使用分析天平称取 6 g 聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA），加入二氯甲烷中，搅拌至完全溶解。
- 称取 1.25 g 药物晶体，加入二氯甲烷/PLGA 溶液中，搅拌至完全溶解。
- 配制 1% 聚乙烯醇（PVA）表面活性剂溶液，并用冰浴冷却。确保在加入含溶解药物的有机溶液前，表面活性剂溶液已充分冷却。
- 将药物溶液倒入 1% PVA 表面活性剂溶液中，启动超声仪，设置振幅为 50%。确保表面活性剂溶液置于冰浴中。对于样品量较小的批次，可将超声仪振幅降低至约 30%。超声处理 10 分钟。
- 取出少量等分试样（约 1 mL）用于粒径分析（表 1）。若粒子粒径大于 1.5 μm，以 2 分钟为间隔继续超声处理，总时长最多不超过 16 分钟。在 20× 显微镜下观察样品并记录观察结果（图 1A）。
- 使用磁力搅拌器使剩余悬浮液形成适当涡流，并在室温下持续搅拌过夜。
- 称取 8 g 甘露醇置于烧瓶中，加入 80 mL 反渗透（RO）水，搅拌至完全溶解，室温保存。若样品需冻干，则此溶液用于离心后的重悬。
- 24 小时后收集悬浮液，倒入 50 mL 离心管中。在 5°C 条件下以 8,000 rpm 离心 20 分钟。弃去上清液，将沉淀物的一半重悬于 75 mL 过滤后的反渗透（RO）水中，另一半重悬于 75 mL 0.5% 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）表面活性剂溶液中。
- 再次在 5°C 条件下以 8,000 rpm 离心 20 分钟，将每次离心所得沉淀物分别用总共 20 mL 甘露醇溶液重悬。
- 第二次重悬后，使用 Zetasizer 测定粒子粒径（表 1）。
- 使用合适的西林瓶转移剩余悬浮液，并将其放入冻干机中。
- 使用 HPLC 测定样品的浓度。
4. 纳米抗逆转录病毒药物形态学
- 取纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）混悬液，使用超声探针在20%振幅下短暂超声处理5秒。将10 μL该混悬液转移至装有1.5 mL反渗水（RO水）的1.7 mL微量离心管中，涡旋振荡10秒。
- 取50 μL水-纳米ART溶液样品，转移至过滤装置中，该装置由Swinnex 13聚丙烯滤器与0.2 μm聚碳酸酯核孔滤膜（Nuclepore Track-Etched）组装而成。在加入稀释药物混悬液前，先用50 μL经0.2 μm滤膜过滤的蒸馏水预润洗过滤装置。随后施加真空，直至全部溶液完全通过滤膜被抽滤。
- 待滤膜干燥后，使用双面导电碳胶带将其固定于铝制针式样品台，并溅射镀钯。随后使用本实验室的JEOL JSM6300F型低压场发射扫描电子显微镜对样品台进行成像（图2）。
5. 纳米抗逆转录病毒药物治疗可视化
- 取制备好的纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）混悬液，使用超声探头在20%振幅下超声处理10秒。
- 取显微镜载玻片盖玻片，将其置于倒置显微镜上。在盖玻片上将15 μL nanoART混悬液与100 μL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，并通过反复吹打数次混匀。使用20倍物镜观察纳米颗粒（图3）。
纳米抗逆转录病毒疗法的生物学
6. 外周血单核细胞及其衍生巨噬细胞（MDM）的分离与制备
- 通过白细胞分离术从 HIV-1 和乙肝病毒血清学阴性供者获取人单核细胞，并利用反流离心淘析法纯化细胞。采用抗 CD68 抗体（克隆株 KP-1）对瑞氏染色的细胞离心涂片进行免疫标记，评估细胞纯度。
- 在添加了10%热灭活混合人血清和1%谷氨酰胺的DMEM中培养纯化的单核细胞， 50 μg/ mL 庆大霉素， 10 μg/ mL 环丙沙星和 1000 U/mL 重组人巨噬细胞集落刺激因子（MCSF），浓度为 1×106 细胞/毫升 在 37°C 在含5% CO₂的湿润环境中2. 接种 2×106 每孔接种细胞于6孔板中，并培养7天，以诱导单核细胞分化为巨噬细胞1。（图3A）
7. 细胞摄取与收集
- 将 nanoART 与培养基（不含 MCSF）混合，使终浓度为 100 μM，并向每孔加入 1 mL 处理培养基。
- 在预定时间点，或当细胞完全摄取 nanoART 后（见图 2），吸除所有处理培养基，用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 次，以去除未被细胞摄取的颗粒。在 1 mL PBS 中，使用细胞刮刀将贴壁细胞从孔底刮下，转移至 1.7 mL 微量离心管 2-4 中。
- 在 4°C 下以 1,000 rcf 离心 10 分钟。弃去上清液，加入 200 μL 100% 甲醇。通过超声探头以 20% 振幅短暂超声（2–5 秒）使细胞裂解并溶解 nanoART。将样品储存于 -80°C，待后续分析药物含量。
8. 纳米抗逆转录病毒药物的细胞内滞留
- 按照7.1节所述处理MDM。
- 在预定时间点，按照7.2节所述洗涤细胞；但不要立即刮取细胞，而是在室温下用含3%戊二醛的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）固定细胞15分钟，并用含1%四氧化锇的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）进一步固定10分钟。
- 去除固定液，按照7.2节所述用1 mL PBS刮取细胞。同样按照7.2节所述收集并离心细胞；但不要向沉淀中加入甲醇，而是加入200 μL戊二醛固定液。
- 用超薄切片机将细胞沉淀切成80 nm的薄片。用醋酸铀和柠檬酸铅对切片进行染色。使用透射电子显微镜观察染色切片（图4）。
9. ART 释放
- 按照 7.1-7.2 步骤处理细胞；但清洗后不收集细胞，而是将 PBS 替换为 2 mL 不含 MCSF 和不含 nanoART 的细胞培养基。
- 在指定时间点，或当细胞培养基变黄时，更换一半培养基。
- 在目标时间点，按照 7.2-7.3 步骤收集 1 mL 细胞培养基及相应的细胞样本。
- 按照 7.3 步骤处理细胞。处理培养基时，取 150 μL 培养基样本加入 1 mL 100% 甲醇中，涡旋振荡 10 秒至充分混合。随后在 21,000 rcf 下离心 10 分钟。弃去沉淀，将上清液转移至新管中。使用真空离心仪蒸发甲醇，蒸发时间根据样本不同约为 1 至 4 小时。将样本储存于 -80°C，待进行药物分析时使用。
10. 共聚焦显微镜实时观察纳米抗逆转录病毒药物的摄取
- 取自步骤 6.2 获得的成熟 MDM，使用细胞标记溶液（如 Vybrant Cell Labeling Solution）对细胞进行标记，具体操作按照制造商说明书进行。用 1 mL 培养基洗涤细胞 3 次，以去除多余的染料。
- 参照步骤 7.1 的方法，将 nanoART 与培养基混合，使用荧光标记的 nanoART。
- 在共聚焦显微镜成像前，立即加入含有标记 nanoART 的处理培养基。使用 60x 物镜 5，每 30 秒采集一次图像，持续 4 小时（视频 1 和 2）。
HIV-1 感染与感染性检测
11. HIV-1ADA 感染
- 按照9.1-9.3所述处理细胞。
- 在预定时间，吸除全部培养基，更换为不含MCSF的培养基，并加入HIV-1ADA，感染复数为0.01个病毒颗粒/细胞，孵育24小时1。移除病毒培养基，更换为新鲜的无病毒培养基。继续培养细胞10天，每隔一天或根据需要更换一半培养基，以维持细胞存活（图5）6。
- 感染后第10天，从每个孔中收集10 μL培养基，置于96孔板中，于-80°C保存，直至进行逆转录病毒（逆转录酶）活性分析。
12. 逆转录酶（RT）活性检测
- 取步骤11.3中的每个10 μL样品，加入10 μL含有100 mM Tris-HCl (pH 7.9)、300 mM KCl、10 mM DTT、0.1%壬基酚聚氧乙烯醚-40 (NP-40) 和水的溶液，混匀。将混合物在37°C孵育15分钟7。
- 然后向每孔中加入25 μL含有50 mM Tris-HCl (pH 7.9)、150 mM KCl、5 mM DTT、15 mM MgCl2、0.05% NP-40、10 μg/mL 多聚腺苷酸 [poly (A)]、0.250 U/mL 寡核苷酸d(T)12-18 和10 μCi/mL 3H-TTP的溶液，在37°C孵育18小时7。
- 孵育结束后，向每孔加入50 μL预冷的10%三氯乙酸 (TCA)。将各孔内容物收集到玻璃纤维滤膜上，通过β闪烁光谱法检测滤膜上3H-TTP的掺入情况7。
13. HIV-1 p24 检测
- 用 PBS 冲洗 1 mL，重复 3 次，洗涤在步骤 11.3 中已移除逆转录病毒转录酶培养基样品的重复细胞。
- 用 4% 多聚甲醛在 4°C 下固定细胞过夜。次日早晨用 PBS 冲洗细胞 3 次。
- 使用小鼠抗 HIV-1 p24 单克隆抗体（1:10，Dako，Carpinteria，CA）检测 HIV 感染。使用 40 倍物镜在明场下观察并成像细胞（图 6）。
14. 代表性结果：
| 药物 | 粒径 (nm) | 多分散系数（PDI） | 电荷 (mV) | 表面活性剂 |
| IDV | 1052 | 0.286 | -24.58 | 0.5% P188, 5.0% SDS, 9.25% 蔗糖 |
| RTV | 233 | 0.273 | -7.47 | 0.5% P188, 9.25% 蔗糖 |
| ATZ | 840 | 0.192 | +25.47 | 0.5% P188, 0.1% mPEG 2000-DSPE, 1.0% DOTAP, 9.25% 蔗糖 |
| EFV | 347 | 0.235 | -13.52 | 1.0% PVA |
表1. 纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）的物理特性
该表格展示了使用指定表面活性剂制备的纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）制剂在物理特性方面可能具有的代表性数值。数值包括基于散射光强度测定的平均粒径、多分散系数（PDI，用于评估粒径分布的指标），以及不同纳米制剂样品测得的Zeta电位值。表中使用的缩写：IDV：茚地那韦；RTV：利托那韦；ATV：阿扎那韦；EFV：依法韦仑；PVA：聚乙烯醇；SDS：十二烷基硫酸钠；P188：泊洛沙姆188（也称为Pluronic F68）；mPEG 2000-DSPE：甲氧基-聚（乙二醇）-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺；DOTAP：(1-油酰基-2-[6-[(7-硝基-2-1,3-苯并恶二唑-4-基)氨基]己酰基]-3-三甲基铵丙烷)。
图1. 总结用于制备纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）的各种方法的流程图。
图1总结了用于制备nanoART的各种方法。该流程图包含了各方法相应关键阶段预计所需的时间分配。
图 2. 理想与非理想纳米抗逆转录病毒药物（NanoART）形态的代表性图像。通过均质化、湿法研磨和超声处理方法制备的利托那韦（RTV）纳米ART在0.2 μm聚碳酸酯滤膜上的扫描电子显微镜分析结果（放大倍数：15,000X）。所有图像中的标尺均为2.0 μm。理想的纳米ART颗粒平均尺寸较小（≤ 2 μm），呈独立完整结构，边缘光滑，形状一致或相似。非理想的纳米ART颗粒在尺寸和形状上差异较大，并可能发生融合和/或相互粘连。
图3. 理想的纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）溶液及单核源性巨噬细胞（MDM）摄取nanoART的图像。均采用20倍物镜拍摄的明场显微镜图像，显示均质化的RTV-NP及MDM摄取nanoART的情况。将10 µL RTV-NP溶液与100 µL PBS混合后滴加于玻璃盖玻片表面，可见颗粒呈沙粒样分布，仅少数较大颗粒可被单独识别（A）。经完全分化呈纺锤形的MDM在接受nanoART处理前的图像（B）。细胞摄取nanoART后，胞体变暗，且由于药物在核周区域聚集，细胞核更加明显；但细胞仍保持其纺锤形形态（C）。当细胞内nanoART过载时，细胞核变得模糊不清，细胞形态变圆，失去纺锤状结构，并可能从培养孔底部脱落（D）。
图 4. 纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）在单核细胞来源巨噬细胞（MDM）中细胞摄取的确认。透射电子显微镜（放大倍数：15,000×）显示经均质化制备的RTV-NP（A）、湿法研磨制备的RTV-NP（B）、超声处理制备的RTV-NP（C）处理的MDM中均摄取了nanoART，而未处理细胞（D）则无。在细胞内，nanoART应可通过其几何形状被轻易识别。注意对照细胞（D）中无任何明显的几何结构。每种颗粒均以轮廓标示：均质化样品为红色（A），湿法研磨样品为蓝色（B），超声处理样品为绿色（C）。颗粒结构应与扫描电镜（SEM）观察结果相似。所有图像中的标尺长度为5.0 μm。
图 5. 检测纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）抗病毒功效的方法示意图。为了检测 nanoART 抑制病毒复制的能力，需先用 nanoART 处理单核细胞来源的巨噬细胞（MDM），再使其暴露于 HIV-1ADA。与抗逆转录病毒药物释放研究类似，先将 MDM 加载 nanoART，随后洗涤以去除未被细胞内化的颗粒。随后将载有 nanoART 的 MDM 培养最多 15 天，每隔一天更换一半培养基。在此期间（通常在第 1、5、10 和 15 天），用 HIV-1ADA 攻毒 MDM。每次病毒感染后，细胞继续培养 10 天，以允许感染进展。感染后第 10 天，收集培养基样本进行逆转录酶（RT）活性分析，并对细胞进行固定和 p24 抗原染色。同时平行培养未经 nanoART 处理的 MDM（包括感染和未感染组），并检测 p24 抗原表达及 RT 活性。
图6. 通过p24染色检测纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）在HIV-1感染的单核细胞来源巨噬细胞（MDM）中的疗效。在HIV-1ADA攻击后10天，经RTV-NP处理的MDM的明场图像（20倍物镜）。当细胞在纳米抗逆转录病毒药物处理后1天受到病毒攻击时，未见感染（A）；注意大多数细胞的细胞质中存在纳米颗粒（NP）（A插图中箭头所示）。当细胞在纳米抗逆转录病毒药物处理后10天才暴露于病毒时出现感染（B），但感染程度明显低于未经纳米抗逆转录病毒药物处理的细胞（D）；注意部分细胞中仍可观察到纳米颗粒（NP）的存在（B插图中箭头所示），但数量少于纳米抗逆转录病毒药物处理后第1天（A插图）。未经纳米抗逆转录病毒药物处理也未感染的细胞图像（C）；注意细胞质内无纳米颗粒（NP）存在（C插图）。未经纳米抗逆转录病毒药物处理但暴露于HIV-1ADA的细胞图像（D）。
视频 1. 活细胞共聚焦显微镜观察显示MDM对RTV-NP的摄取效果较差。将MDM用Vybrant DiO细胞标记溶液标记为绿色，并用红色标记的RTV-NP处理。在60倍放大下，每30秒拍摄一张图像，持续4小时。点击此处观看视频
视频 2. MDM 细胞成功摄取 RTV-NP 的活细胞共聚焦显微镜观察。用 Vybrant DiO 细胞标记溶液标记为绿色的 MDM 细胞经红色标记的 RTV-NP 处理后进行荧光显微观察。在 60 倍放大下，每 30 秒采集一张图像，持续 4 小时。点击此处观看视频
讨论
纳米抗逆转录病毒疗法（NanoART）旨在改善HIV-1的治疗效果。我们提出了一种基于单核细胞-巨噬细胞的药物递送系统，作为将此类技术推向临床应用的第一步，同时也作为纳米制剂药物研发的实验室测试系统。我们以往的研究表明，该系统在该应用中具有可行性5,6。
在本报告中，我们阐述了合成常用HIV-1药物纳米颗粒（茚地那韦，IDV；利托那韦，RTV；依非韦伦，EFV；阿扎那韦，ATV）的方法。这些方法包括湿法研磨、均质化和超声处理。重要的是，我们的方法可对纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）的物理特性（如尺寸、形状和电荷）进行调控5,6。通过谨慎选择表面活性剂，可将颗粒的电荷从强负电性调节至中性，再到强正电性。通过调整处理时间和强度，可控制颗粒尺寸，使其小至≤ 200 nm，或大至≥ 3 μm。颗粒的形状也可在一定程度上进行调控，但其可控性低于其他物理特性。例如，通过聚合物辅助超声处理可制备球形颗粒，而通过湿法研磨或均质化则可产生多面几何形状的颗粒。湿法研磨和均质化所产生的颗粒形状不同，但该过程依赖于分级方法，无法直接精确控制。这些制备方法的特性使研究人员能够便捷地按照精确的设计参数生产nanoART。这一点至关重要，因为nanoART的理化性质对其稳定性和细胞相互作用具有显著影响。例如，我们已证实，尺寸约为1 μm、带有强正电荷且呈多面几何形状的nanoART被巨噬细胞摄取的速度更快，在细胞内更稳定，并可在更长时间内持续释放6。
一种用于测试纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）的方法被开发出来，该方法可简便地筛选纳米颗粒被巨噬细胞摄取、储存和释放的能力——巨噬细胞是HIV-1的主要靶细胞之一——同时评估其抑制病毒复制的能力。该方法有助于根据纳米ART的性能进行快速区分，并筛选出最有可能在后续研究中取得成功的候选制剂。 体内 因此，提高了开发用于人体的纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）的效率和速度。
已有研究表明，当小鼠骨髓巨噬细胞被加载时 离体 通过静脉注射将携带纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）并经适应性转移的人源化细胞注入HIV-1感染的小鼠体内后，这些细胞可迁移至活动性感染部位（包括中枢神经系统），并在长达两周的时间内释放药物以抑制病毒复制2-4此外，这些载有纳米抗逆转录病毒药物的细胞还能有效减少血浆、淋巴结、脾脏、肝脏和肺脏中病毒感染的细胞数量，并保护CD4+细胞2这些研究尽管尚处于初步阶段，但已表明细胞介导的纳米抗逆转录病毒药物递送系统可将具有临床意义剂量的药物分布至血液及感染组织中。由于在HIV-1感染小鼠研究中获得了令人鼓舞的初步结果，我们目前正在建立猴免疫缺陷病毒（simian immuno deficiency virus）感染的猕猴模型，以进一步评估纳米抗逆转录病毒药物在临床应用中的潜力。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助项目1P01DA028555-01A1、2R01 NS034239、2R37 NS36126、P01 NS31492、P20RR 15635、P01MH64570和P01 NS43985（授予H.E.G.）的支持。作者感谢Robin Taylor女士对稿件的审阅以及在图形设计和文字方面的出色支持。我们感谢Steve Grzelak在湿法研磨技术方面的专业知识。我们还要感谢内布拉斯加大学林肯分校电子显微镜核心设施的Han Chen博士提供扫描电镜和透射电镜图像。最后，我们感谢Megan Marquart在活细胞共聚焦显微镜技术方面的专业支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| <强>纳米ART制造 | ||||
| 硫酸茚地那韦 | 试剂 | 中国上海，Longshem 公司 | Cas # 157810-81-6 | |
| 利托那韦 | 试剂 | 中国盛达制药公司，中国 | Cas # 155213-67-5 | |
| 硫酸阿扎那韦 | 试剂 | Gyma Laboratories of America INC | Cas # 198904-31-3 | |
| 依非韦伦 | 试剂 | 印度 Hetero Labs LTD | Cas # 154598-52-4 | |
| PVA | 试剂 | Sigma-Aldrich | P 8136 | |
| SDS | 试剂 | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0301 | |
| 蔗糖 | 试剂 | Fluka | 84097 | |
| P188 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P 1300 | |
| mPEG 2000-DSPE | 试剂 | Genzyme | LP-R4-039 | |
| Dotap | 试剂 | Avanti Polar Lipid, Inc | 890890 P | |
| Hepes | 试剂 | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| PLGA 75:25 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P1941 | |
| 二氯甲烷 | 试剂 | Acros Organics | 75-09-2 | |
| 甘露醇 | 试剂 | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| CTAB | 试剂 | Sigma-Aldrich | H 9151 | |
| 分析天平 | 工具 | 丹佛仪器 | ||
| T-18 均质器 | 工具 | IKA | ||
| 超声波破碎仪 | 工具 | Cole-Parmer | ||
| 湿法研磨，MicroCer | 工具 | 耐驰细粒技术有限责任公司 | ||
| 匀浆器，EmulsiFlex-C5 | 工具 | Avestin, Inc. | ||
| Zeta电位仪 | 工具 | 马尔文仪器公司 | ||
| 气体分配系统 | 工具 | Victor Technologies | ||
| <强>体外测试 | ||||
| DMEM | 试剂 | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| 庆大霉素 | 试剂 | Invitrogen | 15710-064 | |
| 环丙沙星 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 人源MCSF | 试剂 | Miltenyi Biotec | 130-093-964 | |
| 混合正常人血清 | 试剂 | Cole-Parmer | WU-88061-68 | |
| 6孔组织培养板 | 工具 | 康宁 | 3524 | |
| 甲醇（HPLC 级） | 试剂 | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| 1.7 ml 微量离心管 | 工具 | 国家科学公司 | CN1700GT | |
| 戊二醛溶液 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 49632 | |
| 四氧化锇溶液 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Centrifuge 5417R | 工具 | Eppendorf | 022621807 | |
| F-45-30-11 固定角转子 | 工具 | Eppendorf | 022636006 | |
| HIV-1ADA | 试剂 | |||
| HIV-1 p24小鼠单克隆抗体 | 试剂 | Dako | M0857 | |
| 显微镜载玻片盖玻片 | 工具 | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
表中使用的缩写：IDV：茚地那韦；RTV：利托那韦；ATV：阿扎那韦；EFV：依法韦仑；PVA：聚乙烯醇；SDS：十二烷基硫酸钠；P188：泊洛沙姆188（又称普朗尼克F68）；mPEG 2000-DSPE：甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺；DOTAP：(1-油酰基-2-[6-[(7-硝基-2-–1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]己酰基]-3-三甲基铵丙烷）；PLGA：聚（乳酸-共-乙醇酸）；CTAB：十六烷基三甲基溴化铵；DMEM：杜尔贝科改良伊格尔培养基’s 改良型伊格尔培养基；MCSF：巨噬细胞集落刺激因子；HPLC：高压液相色谱；HIV-1：人类免疫缺陷病毒-1 |
参考文献
- Gendelman, H. E. Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes. J Exp Med. 167 (4), 1428-1441 (1988).
- Dou, H. Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery. Blood. 108 (8), 2827-2835 (2006).
- Dou, H. Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages. Virology. 358, 148-158 (2007).
- Dou, H. Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS. J Immunol. 183 (1), 661-669 (2009).
- Nowacek, A. S. Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics. J Neuroimmune Pharmacol. , (2010).
- Nowacek, A. S. NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery. Nanomed. 4 (8), 903-917 (2009).
- Kalter, D. C. Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes. J Immunol. 146 (1), 298-306 (1991).
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