血液来源巨噬细胞携带纳米制剂抗逆转录病毒药物的方法学开发

摘要

采用湿法研磨、均质化和超声处理方法制备了茚地那韦、利托那韦、依非韦伦和阿扎那韦的纳米颗粒。这些纳米制剂统称为纳米制剂化抗逆转录病毒治疗（nanoART），用于评估基于巨噬细胞的药物递送。测定了单核细胞来源巨噬细胞对纳米ART的摄取、滞留及持续释放情况。这些初步研究表明，纳米ART在临床应用方面具有潜力。

摘要

纳米制剂药物可改善药效学和生物利用度，同时降低抗逆转录病毒药物（ART）的毒性。为此，本实验室应用纳米医学原理，简化ART治疗方案，从而在降低毒性的同时提高患者依从性及药物药代动力学特性。本文展示了制备纳米制剂抗逆转录病毒药物（nanoART）的简单且可靠的方法。将纯药物颗粒通过一层表面活性脂质包衣进行包裹，并利用湿法研磨或高压均质化技术将较大的药物晶体破碎成更小的颗粒。另一种方法是将游离药物悬浮于聚合物液滴中：先将药物溶解于聚合物中，再通过超声处理震荡，直至形成单个纳米级液滴。采用动态光散射和显微镜检查对颗粒的物理性质（粒径、电荷和形态）进行表征。其生物学特性（细胞摄取与滞留、细胞毒性及抗逆转录病毒活性）则通过人单核细胞来源巨噬细胞（MDM）进行测定。MDM由白细胞分离包中分离的人外周血单核细胞经离心淘析法纯化后获得。此类血液来源的巨噬细胞可用作细胞载体，将nanoART递送至人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的器官。我们认为，将临床上已有的抗逆转录病毒药物重新包装为纳米颗粒用于HIV-1治疗，有望提高治疗依从性，并对疾病转归产生积极影响。

方案

纳米抗逆转录病毒药物制造

1. 采用耐驰 MicroCer 方法进行纳米药物的湿法研磨

1. 使用分析天平称取用于制备纳米制剂的药物晶体和各种表面活性剂，并用T-18 Ultraturrax混合器将其与10 mM Hepes缓冲液（pH 7.8）混合，直至完全分散。制剂中药物的百分比应为1–2%。
2. 进行连续研磨时，确保冷却器和压缩机已开启。开始研磨样品前，出口压力应约为100 PSI。
3. 打开控制单元，并旋转研磨罐，使研磨介质可装入罐中。
4. 使用漏斗向研磨腔内加入50 mL研磨珠。确保螺纹处或研磨腔外部无研磨珠残留，以避免机械密封处发生泄漏。
5. 确认O型圈已正确安装在研磨腔上。选择合适的筛网孔径，并使用相应的盖组件，通过拧紧螺母固定盖子。筛网孔径应至少为研磨珠尺寸的一半。在连续研磨过程中，应选用较大的筛网孔径，以防止产品堵塞滤网。
6. 使用研磨腔顶部的旋钮将研磨腔调至水平位置，并确保产品出口管通向收集容器。
7. 将含有不同量表面活性剂的药物悬浮液加入产品入口。悬浮液的最小体积应为100 mL。这可以防止研磨腔过热，并减少部件磨损，从而避免研磨珠污染。
8. 使用控制单元启动泵。根据制剂需要调节流速（约50–150 mL/min）。
9. 开启搅拌器，并在控制单元上调节转速。在MicroCer设备上，转速可从620 rpm调节至4320 rpm。通过研磨腔顶部安装的温度计监测温度，确保无过热现象。
10. 在不同转速和流速下进行研磨，并取出少量等分试样（约1 mL），使用Brookhaven Zetasizer动态光散射仪测量粒径和电荷（见表1）。
11. 达到目标粒径后，使用控制单元停止研磨。保持泵运行，将样品收集至烧瓶中。确保药物完全排入样品收集烧瓶。
12. 关闭泵。为回收研磨珠，在设备下方放置收集托盘。松开盖组件前板上的螺母，将研磨珠收集至托盘中。取下前板，使用去离子水瓶冲洗，将残留研磨珠冲入托盘。
13. 将研磨后的悬浮液转移至50 mL离心管中，设置离心机以10,000 rpm（10,174 rcf）离心30分钟。离心结束后，测量上清液体积，并用等体积的新鲜表面活性剂溶液替换。
14. 完成重悬后，将悬浮液转移回研磨腔，继续研磨10分钟。取等分试样（约1 mL），再次使用Zetasizer测量样品的粒径和电荷（见表1）。
15. 使用去离子水和70%乙醇对MicroCer设备进行使用后清洗。
16. 采用HPLC测定纳米ART制剂的浓度。在本研究中，我们采用反相HPLC进行样品分析，将20 μL样品三份注入YMC Octyl C8色谱柱（Waters Inc., Milford, MA），配备C8保护柱。流动相为48%乙腈/52% 25 mM KH₂PO₄（pH 4.15），流速0.4 mL/min，紫外/可见光检测波长为272 nm。所有药物浓度测定均通过与甲醇中配制的标准曲线（0.025–100 μg/mL）比较确定。

2. 使用 Avestin EmulsiFlex C5 进行纳米抗逆转录病毒药物制剂的均质化

1. 使用分析天平称取用于制备纳米制剂的药物晶体和各种表面活性剂，并使用T-18 Ultraturrax混合器将其与10 mM Hepes缓冲液（pH 7.8）混合，以获得完全分散的体系。
2. 将悬浮液转移至均质化容器中并开始循环。在启动样品均质化前，确保冷却器已开启。
3. 逐步增加压力，直至压力表读数达到20,000 ± 2,000 psi，并持续均质化直至达到目标粒径。此过程通常需要45至60分钟。定期取样（约1 mL），使用Zetasizer测量样品的粒径和电荷（见表1）。
4. 将均质化后的悬浮液从均质机转移至50 mL离心管中，设置离心机转速为10,000 rpm（10,174 rcf），离心30分钟。离心程序完成后，测量上清液体积，并用等体积的新鲜表面活性剂溶液替换。
5. 重新悬浮后，将悬浮液转移至C5均质机中。重新启动循环，将均质压力恢复至20,000 ± 2,000 psi，继续均质30分钟。使用Zetasizer测量制剂的粒径和电荷（见表1）。
6. 使用去离子水和乙醇作为溶剂，对设备进行后续清洗。
7. 使用HPLC测定样品的浓度。

3. 使用 Cole Parmer 超声波处理器进行超声处理

1. 用量筒量取 50 mL 二氯甲烷倒入玻璃烧杯中。使用分析天平称取 6 g 聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA），加入二氯甲烷中，并搅拌至完全溶解。
2. 称取 1.25 g 药物晶体，加入二氯甲烷/PLGA 溶液中，搅拌至完全溶解。
3. 配制 1% 聚乙烯醇（PVA）表面活性剂溶液，并将其置于冰浴中冷却。确保在加入含溶解药物的有机溶液前，表面活性剂溶液已充分冷却。
4. 将药物溶液倒入 1% PVA 表面活性剂溶液中，启动超声仪，设置振幅为 50%。确保表面活性剂溶液始终置于冰浴中。对于较小批次的样品，可将超声仪振幅降低至约 30%。超声处理样品 10 分钟。
5. 取出少量等分试样（约 1 mL）用于粒径分析（表 1）。若颗粒粒径大于 1.5 μm，以每次 2 分钟的间隔继续超声处理，总时长最多不超过 16 分钟。在 20 倍显微镜下观察样品并记录观察结果（图 1A）。
6. 使用磁力搅拌器使剩余悬浮液形成适当涡流，并在室温下持续搅拌过夜。
7. 称取 8 g 甘露醇置于锥形瓶中，加入 80 mL 反渗透（RO）水，搅拌至完全溶解，并于室温下保存。若样品需冻干，则此溶液将用于离心后的重悬。
8. 24 小时后收集悬浮液，倒入 50 mL 离心管中。在 5°C 条件下以 8,000 rpm 转速离心 20 分钟。弃去上清液，将其中一半样品重悬于 75 mL 过滤后的反渗透（RO）水中，另一半重悬于 75 mL 0.5% 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）表面活性剂溶液中。
9. 再次在 5°C 条件下以 8,000 rpm 转速离心 20 分钟，并将每份沉淀物分别重悬于总共 20 mL 甘露醇溶液中。
10. 第二次重悬后，使用 Zetasizer 测定颗粒粒径（表 1）。
11. 使用合适的西林瓶转移剩余悬浮液，并将其放入冷冻干燥机中。
12. 采用高效液相色谱法（HPLC）测定样品浓度。

4. 纳米抗逆转录病毒药物的形态学

1. 取纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）混悬液，使用超声探针在20%的振幅下短暂超声5秒。将10 μL混悬液转移至装有1.5 mL反渗透水（RO水）的1.7 mL微量离心管中，涡旋振荡10秒。
2. 取50 μL水-纳米ART溶液样品，转移至过滤装置中，该装置由Swinnex 13聚丙烯滤器与0.2 μm聚碳酸酯核孔滤膜（Nuclepore Track-Etched）组装而成。在加入稀释的药物混悬液之前，先用50 μL经0.2 μm滤膜过滤的蒸馏水预润洗过滤装置。随后对装置施加真空，直至全部溶液完全通过滤膜被抽滤。
3. 待滤膜干燥后，使用双面导电碳胶带将其固定在铝制针式样品台上，并溅射镀钯。然后使用本实验所用的JEOL JSM6300F低压场发射扫描电子显微镜对样品台进行成像（图2）。

5. 纳米抗逆转录病毒药物治疗的可视化

1. 取制备好的纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）混悬液，使用超声探头在20%振幅下超声处理10秒。
2. 取显微镜载玻片盖玻片，将其置于倒置显微镜上。在盖玻片上将15 μL nanoART混悬液与100 μL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，通过反复吹吸数次混匀。使用20倍物镜观察纳米颗粒（图3）。

纳米抗逆转录病毒疗法的生物学

6. 外周血单核细胞及其衍生巨噬细胞（MDM）的分离与制备

1. 通过白细胞单采术从 HIV-1 和乙肝血清学阴性供者获取人单核细胞，并利用逆流离心淘析法纯化细胞。采用抗 CD68 抗体（克隆株 KP-1）对瑞氏染色的细胞涂片进行免疫标记，以评估细胞纯度。
2. 在添加了10%热灭活混合人血清、1%谷氨酰胺和50的DMEM培养基中培养纯化的单核细胞 μg/mL 庆大霉素，10 μg/mL 环丙沙星和 1000 U/mL 重组人巨噬细胞集落刺激因子（MCSF），浓度为 1×10⁶ 细胞/ mL，37℃°在含5% CO₂的湿润环境中于37°C培养₂. 接种 2×10⁶ 每孔接种细胞于6孔板中，培养7天，使单核细胞分化为巨噬细胞1。（图3A）

7. 细胞摄取与收集

1. 将纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）与培养基（不含MCSF）混合，使其终浓度为100 μM，并向每孔加入1 mL处理培养基。
2. 在预定时间点，或当细胞完全摄取纳米抗逆转录病毒药物后（见图2），移除所有处理培养基，用1 mL PBS洗涤细胞3次，以去除未被细胞摄取的颗粒。加入1 mL PBS，使用细胞刮刀将贴壁细胞从孔底刮下，转移至1.7 mL微量离心管中（编号2-4）。
3. 在4°C条件下，以1,000 rcf离心10分钟。弃去上清液，加入200 μL 100%甲醇。通过超声探头在20%振幅下短暂超声（2–5秒）使细胞裂解并溶解纳米抗逆转录病毒药物。将样品储存于-80°C，待后续分析药物含量时使用。

8. 纳米抗逆转录病毒药物的细胞内滞留

1. 按照7.1所述方法处理MDM。
2. 在预定时间点，按照7.2所述方法洗涤细胞；但不要立即刮取细胞，而是在室温下用含3%戊二醛的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）固定细胞15分钟，并用含1%四氧化锇的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）进一步固定10分钟。
3. 去除固定液，按照7.2所述方法用1 mL PBS刮取细胞。同样按照7.2所述方法收集并离心细胞；但不要向沉淀中加入甲醇，而是加入200 μL戊二醛固定液。
4. 用超薄切片机将细胞沉淀切成80 nm的薄片。用醋酸铀和柠檬酸铅对切片进行染色。使用透射电子显微镜观察染色切片（图4）。

9. ART 释放

1. 按照7.1-7.2所述处理细胞；但洗涤后不收集细胞，而是将PBS替换为2 mL不含MCSF和不含nanoART的细胞培养基。
2. 在指定日期，或当细胞培养基变黄时，更换一半培养基。
3. 在目标时间点，按照7.2-7.3所述方法收集1 mL细胞培养基及相应的细胞样本。
4. 按照7.3所述方法处理细胞。处理培养基时，取150 μL培养基样品加入1 mL 100%甲醇中，涡旋振荡10秒。然后以21,000 rcf离心10分钟。弃去上清液，并将其转移至新管中。使用真空离心浓缩仪蒸发甲醇，蒸发时间根据样品不同可能需要1至4小时。将样品储存于-80°C，直至进行药物分析。

10. 共聚焦显微镜实时观察纳米抗逆转录病毒药物的摄取

1. 取步骤6.2中获得的成熟MDM，使用细胞标记溶液（如Vybrant Cell Labeling Solution）按照制造商说明书对细胞进行标记。用1 mL培养基将细胞冲洗3次，以去除多余的染料。
2. 参照步骤7.1的方法，将荧光标记的nanoART与培养基混合。
3. 在共聚焦显微镜成像前立即加入含有标记nanoART的处理培养基。使用60倍物镜5，每30秒采集一次图像，持续4小时（视频1和视频2）。

HIV-1 感染与感染性检测

11. HIV-1_ADA 感染

1. 按照9.1-9.3所述处理细胞。
2. 在指定时间，吸除全部培养基，更换为不含MCSF的培养基，并加入HIV-1_ADA，感染复数为0.01个病毒颗粒/细胞，孵育24小时1。移除病毒培养基，更换为新鲜的无病毒培养基。继续培养细胞10天，每隔一天或根据需要更换一半培养基，以维持细胞存活（图5）6。
3. 感染后第10天，从每个孔中收集10 μL培养基，置于96孔板中，于-80°C保存，直至进行逆转录病毒（反转录酶）活性分析。

12. 逆转录酶（RT）活性检测

1. 取步骤11.3中的每份10 μL样品，加入10 μL含有100 mM Tris-HCl（pH 7.9）、300 mM KCl、10 mM DTT、0.1%壬基酚聚氧乙烯醚-40（NP-40）和水的溶液，混匀。将该混合物在37°C孵育15分钟7。
2. 然后向每个孔中加入25 μL含有50 mM Tris-HCl（pH 7.9）、150 mM KCl、5 mM DTT、15 mM MgCl₂、0.05% NP-40、10 μg/mL poly(A)、0.250 U/mL oligo d(T)_12-18和10 μCi/mL ³H-TTP的溶液，在37°C孵育18小时7。
3. 孵育结束后，向每个孔中加入50 μL预冷的10%三氯乙酸（TCA）。将各孔内容物收集到玻璃纤维滤膜上，通过β闪烁光谱法检测滤膜上³H-TTP的掺入情况7。

13. HIV-1 p24 检测

1. 用1 mL PBS冲洗在步骤11.3中已移除逆转录病毒转录酶培养基样本的重复培养细胞，共冲洗3次。
2. 用4%多聚甲醛在4°C下固定细胞过夜。次日早晨用PBS冲洗细胞3次。
3. 使用小鼠抗HIV-1 p24单克隆抗体（1:10，Dako，Carpinteria，CA）检测HIV感染。使用40倍物镜在明场下观察并成像细胞（图6）。

14. 代表性结果：

药物	粒径 (nm)	多分散系数（PDI）	电荷 (mV)	表面活性剂
IDV	1052	0.286	-24.58	0.5% P188, 5.0% SDS, 9.25% 蔗糖
RTV	233	0.273	-7.47	0.5% P188, 9.25% 蔗糖
ATZ	840	0.192	+25.47	0.5% P188, 0.1% mPEG 2000-DSPE, 1.0% DOTAP, 9.25% 蔗糖
EFV	347	0.235	-13.52	1.0% PVA

表1. 纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）的物理特性
本表列出了使用指定表面活性剂制备的纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）制剂在物理特性方面可能具有的代表性数值。数值包括基于散射光强度测定的平均粒径、多分散系数（PDI，用于评估粒径分布的指标），以及不同纳米制剂样品测得的泽塔电位（zeta potential）值。表中所用缩写：IDV：茚地那韦；RTV：利托那韦；ATV：阿扎那韦；EFV：依法韦仑；PVA：聚乙烯醇；SDS：十二烷基硫酸钠；P188：泊洛沙姆188（也称为Pluronic F68）；mPEG 2000-DSPE：甲氧基-聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺；DOTAP：(1-油酰基-2-[6-[(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]己酰基]-3-三甲铵基丙烷)。

图1. 总结用于制备纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）的各种方法的流程图。
图1总结了用于制备纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）的各种方法。该流程图包含了每种方法各个关键阶段预计所需的时间分配。

图2. 理想与非理想纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）形态的代表性图像。通过均质化、湿法研磨和超声处理制备的利托那韦（RTV）纳米抗逆转录病毒药物在0.2 μm聚碳酸酯滤膜上的扫描电子显微镜分析结果（放大倍数：15,000X）。所有图像中的标尺均为2.0 μm。理想的纳米抗逆转录病毒药物平均表现为粒径小（≤ 2 μm）、结构完整、边缘光滑的颗粒，且形状相同或相似。非理想的纳米抗逆转录病毒药物在大小和形状上差异较大，并可能发生融合和/或相互粘连。

图3. 理想的纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）溶液及单核细胞来源巨噬细胞（MDM）摄取nanoART的图像。采用明场显微镜拍摄的图像（均使用20倍物镜获取），显示均质化的RTV-NP及MDM摄取nanoART的情况。将10 μL RTV-NP溶液与100 μL PBS混合后滴加于玻璃盖玻片上，可见颗粒呈沙样分布，仅有少数较大颗粒可被单独识别（A）。经完全分化呈纺锤形的MDM在接受nanoART处理前的图像（B）。细胞摄取nanoART后，胞体变暗，且由于药物在核周区域分布，细胞核变得更加明显；但细胞仍保持其纺锤形的形态（C）。当细胞内nanoART过载时，细胞核变得模糊不清，细胞形态转为圆形，失去纺锤状结构，并可能从培养孔底部脱落（D）。

图 4. 纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）在单核细胞来源巨噬细胞（MDM）中的细胞摄取验证。透射电子显微镜图像（放大倍数：15,000×）显示经均质化制备的RTV-NP（A）、湿法研磨制备的RTV-NP（B）、超声处理制备的RTV-NP（C）处理的MDM中均存在nanoART的摄取，而未处理细胞（D）中无此现象。细胞内的nanoART可通过其几何形状清晰识别。注意对照细胞（D）中无明显几何结构存在。每种颗粒的示例已标出轮廓：均质化颗粒为红色（A），湿法研磨颗粒为蓝色（B），超声处理颗粒为绿色（C）。颗粒结构应与扫描电镜（SEM）观察结果相似。所有图像中的标尺长度为5.0 μm。

图5. 检测纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）疗效的方法示意图。为了检测nanoART抑制病毒复制的能力，首先需用nanoART处理单核细胞分化的巨噬细胞（MDM），随后使其接触HIV-1_ADA。类似于ART释放研究，先将MDM加载nanoART，然后洗涤以去除未被内化的颗粒。将含有nanoART的MDM培养至多15天，每隔一天更换一半培养基。在此期间（通常在第1、5、10和15天），用HIV-1_ADA攻击MDM。每次病毒感染后，细胞继续培养10天，以允许感染进展。感染后第10天，收集培养基样本进行逆转录酶（RT）分析，并对细胞进行固定和p24抗原染色。同时平行培养未经nanoART处理的MDM（包括感染与未感染组），检测p24抗原的存在及RT活性。

图6. 通过p24染色检测纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）在HIV-1感染的MDM细胞中的疗效。在HIV-1_ADA攻击后10天，经RTV-NP处理的MDM的明场图像（20倍物镜）。当细胞在纳米抗逆转录病毒药物治疗后1天受到病毒攻击时，未见感染（A）；注意大多数细胞的细胞质中存在纳米颗粒（NP）（A插图中箭头所示）。当细胞在纳米抗逆转录病毒药物治疗后10天暴露于病毒时出现感染（B），但感染程度明显低于未经纳米抗逆转录病毒药物处理的细胞（D）；注意部分细胞中仍可见纳米颗粒（NP）（B插图中箭头所示），但数量少于纳米抗逆转录病毒药物治疗后第1天（A插图）。未经纳米抗逆转录病毒药物处理且未感染的细胞图像（C）；注意细胞质中无纳米颗粒（NP）（C插图）。未经纳米抗逆转录病毒药物处理但暴露于HIV-1_ADA的细胞图像（D）。

视频 1. MDM 细胞对红色标记的 RTV-NP 摄取能力差的活细胞共聚焦显微镜观察。MDM 细胞用绿色 Vybrant DiO 细胞标记溶液标记，并与红色标记的 RTV-NP 共同孵育。在 60 倍放大下，每 30 秒采集一次图像，持续 4 小时。点击此处观看视频

视频 2. MDM 细胞成功摄取红色标记 RTV-NP 的活细胞共聚焦显微镜观察。MDM 细胞用绿色 Vybrant DiO 细胞标记溶液标记，并与红色标记的 RTV-NP 共同孵育。在 60 倍放大下，每 30 秒采集一次图像，持续 4 小时。点击此处观看视频

讨论

纳米抗逆转录病毒疗法（NanoART）旨在改善HIV-1的治疗效果。我们提出了一种基于单核细胞-巨噬细胞的药物递送系统，作为将此类技术推向临床应用的第一步，同时也作为纳米制剂药物研发的实验室测试系统。我们以往的研究表明，该系统在该应用中具有可行性^5,6。

在本报告中，我们阐述了合成常用HIV-1药物纳米颗粒（茚地那韦，IDV；利托那韦，RTV；依非韦伦，EFV；阿扎那韦，ATV）的方法。这些方法包括湿法研磨、均质化和超声处理。重要的是，我们的方法可对纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）的物理特性（如尺寸、形状和电荷）进行调控^5,6。通过谨慎选择表面活性剂，可将颗粒的电荷从强负电性调节至中性，再到强正电性。通过调整处理时间和强度，可控制颗粒尺寸，使其小至≤ 200 nm，或大至≥ 3 μm。颗粒的形状也可在一定程度上进行调控，但其可控性低于其他物理特性。例如，通过聚合物辅助超声处理可制备球形颗粒，而通过湿法研磨或均质化则可产生多面几何形状的颗粒。湿法研磨和均质化所产生的颗粒形状不同，但该过程依赖于分级方法，无法直接精确控制。这些制备方法的特性使研究人员能够便捷地按照精确的设计参数生产nanoART。这一点至关重要，因为nanoART的理化性质对其稳定性和细胞相互作用具有显著影响。例如，我们已证实，尺寸约为1 μm、带有强正电荷且呈多面几何形状的nanoART被巨噬细胞摄取的速度更快，在细胞内更稳定，并可在更长时间内持续释放6。

一种用于测试纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）的方法被开发出来，该方法可简便地筛选纳米颗粒被巨噬细胞摄取、储存和释放的能力——巨噬细胞是HIV-1的主要靶细胞之一——同时评估其抑制病毒复制的能力。该方法有助于根据纳米ART的性能进行快速区分，并筛选出最有可能在后续研究中取得成功的候选制剂。 体内 因此，提高了开发用于人体的纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）的效率和速度。

已有研究表明，当小鼠骨髓巨噬细胞被加载时 离体 通过静脉注射将携带纳米抗逆转录病毒药物（nanoART）并经适应性转移的人源化细胞注入HIV-1感染的小鼠体内后，这些细胞可迁移至活动性感染部位（包括中枢神经系统），并在长达两周的时间内释放药物以抑制病毒复制^2-4此外，这些载有纳米抗逆转录病毒药物的细胞还能有效减少血浆、淋巴结、脾脏、肝脏和肺脏中病毒感染的细胞数量，并保护CD4+细胞²这些研究尽管尚处于初步阶段，但已表明细胞介导的纳米抗逆转录病毒药物递送系统可将具有临床意义剂量的药物分布至血液及感染组织中。由于在HIV-1感染小鼠研究中获得了令人鼓舞的初步结果，我们目前正在建立猴免疫缺陷病毒（simian immuno deficiency virus）感染的猕猴模型，以进一步评估纳米抗逆转录病毒药物在临床应用中的潜力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>纳米ART制造
硫酸茚地那韦	试剂	中国上海，Longshem 公司	Cas # 157810-81-6
利托那韦	试剂	中国盛达制药公司，中国	Cas # 155213-67-5
硫酸阿扎那韦	试剂	Gyma Laboratories of America INC	Cas # 198904-31-3
依非韦伦	试剂	印度 Hetero Labs LTD	Cas # 154598-52-4
PVA	试剂	Sigma-Aldrich	P 8136
SDS	试剂	伯乐（Bio-Rad）	161-0301
蔗糖	试剂	Fluka	84097
P188	试剂	Sigma-Aldrich	P 1300
mPEG 2000-DSPE	试剂	Genzyme	LP-R4-039
Dotap	试剂	Avanti Polar Lipid, Inc	890890 P
Hepes	试剂	Sigma-Aldrich	83264
PLGA 75:25	试剂	Sigma-Aldrich	P1941
二氯甲烷	试剂	Acros Organics	75-09-2
甘露醇	试剂	Sigma-Aldrich	M9546
CTAB	试剂	Sigma-Aldrich	H 9151
分析天平	工具	丹佛仪器
T-18 均质器	工具	IKA
超声波破碎仪	工具	Cole-Parmer
湿法研磨，MicroCer	工具	耐驰细粒技术有限责任公司
匀浆器，EmulsiFlex-C5	工具	Avestin, Inc.
Zeta电位仪	工具	马尔文仪器公司
气体分配系统	工具	Victor Technologies
<强>体外测试
DMEM	试剂	Mediatech, Inc.	10-013-CV
庆大霉素	试剂	Invitrogen	15710-064
环丙沙星	试剂	Sigma-Aldrich	17850
人源MCSF	试剂	Miltenyi Biotec	130-093-964
混合正常人血清	试剂	Cole-Parmer	WU-88061-68
6孔组织培养板	工具	康宁	3524
甲醇（HPLC 级）	试剂	Fisher Scientific	A452SK-4
1.7 ml 微量离心管	工具	国家科学公司	CN1700GT
戊二醛溶液	试剂	Sigma-Aldrich	49632
四氧化锇溶液	试剂	Sigma-Aldrich	75632
Centrifuge 5417R	工具	Eppendorf	022621807
F-45-30-11 固定角转子	工具	Eppendorf	022636006
HIV-1ADA	试剂
HIV-1 p24小鼠单克隆抗体	试剂	Dako	M0857
显微镜载玻片盖玻片	工具	Fisher Scientific	12-548-5P
表中使用的缩写：IDV：茚地那韦；RTV：利托那韦；ATV：阿扎那韦；EFV：依法韦仑；PVA：聚乙烯醇；SDS：十二烷基硫酸钠；P188：泊洛沙姆188（又称普朗尼克F68）；mPEG 2000-DSPE：甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺；DOTAP：(1-油酰基-2-[6-[(7-硝基-2-–1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]己酰基]-3-三甲基铵丙烷）；PLGA：聚（乳酸-共-乙醇酸）；CTAB：十六烷基三甲基溴化铵；DMEM：杜尔贝科改良伊格尔培养基’s 改良型伊格尔培养基；MCSF：巨噬细胞集落刺激因子；HPLC：高压液相色谱；HIV-1：人类免疫缺陷病毒-1