一个Biomining从宏基因组库的纤维素酶的活性高通量筛选

摘要

该协议描述了一种在大肠杆菌中表达了宏基因组文库的纤维素活动的高通量筛选。屏幕解决方案的基础和高度自动化，并采用一锅煮化学与最后一个测吸光度读数在384孔板。

摘要

纤维素，有机碳在这个星球上最丰富的来源，具有广泛的工业应用日益重视生物燃料^生产 1 。修改或降解纤维素的化学方法通常需要强酸和高温。因此，酶的方法已经成为突出的生物转化过程中。虽然已经有点有效识别来自细菌和真菌菌株的积极纤维素酶，微生物在自然界中的绝大多数抵制实验室培养。环境基因组学，又称宏基因组，筛选方法有很大的希望，在弥合在培育新型生物转化酶的搜索差距。宏基因组筛选方法已成功地从环境恢复新颖纤维素酶作为土壤^2，水牛瘤胃³和白蚁后肠⁴使用羧甲基纤维素钠（CMC）的琼脂板用刚果红染料^（5 Teather和木材的方法的基础上）染色不同。然而，中央军委的方法是在吞吐量有限，不定量，并表现出低^信号信噪比6。其他方法已经^7,8报道，但每次使用的琼脂平板为基础的检测，这是为大型插入基因组文库的高通量筛选的不良。在这里，我们提出了一个解决方案，基于纤维素酶的活动，使用显色二硝基苯酚^{（DNP）cellobioside}基板9屏幕。我们的资料库，克隆到fosmid增加检测的灵敏度，通过拷贝数^诱导 10 pCC1复制控制。该方法使用一锅煮化学作为测吸光度提供的最终读数384孔板。定量，灵敏，吞吐量高达每天100X 384孔板使用液体处理和附有堆垛系统酶标仪自动读数。

方案

本议定书开始之前，您将需要您的宏基因组文库在384孔板格式存储。在我们的研究中，我们结合使用噬菌体T1耐TransforMax EPI300 - T1 ^ř 大肠杆菌 pCC1复制fosmid矢量控制大肠杆菌细胞库的主机和存储我们的板在^-80℃11。

1。复制的宏基因组文库板

1. 除霜板包含您的图书馆在37℃，约20分钟，或者直到所有的水井都解冻。
2. 消毒15分钟的机器人上qPix2使用的紫外灯灭菌功能。
3. 100ug/mL 12.5ug/mL和阿拉伯糖的终浓度在500毫升的试剂瓶，准备与氯霉素LB培养基。每个板块将使用约20ML，再加上作出额外的50毫升，让死体积。
4. 设置连接通过媒体瓶无菌管歧管生产商的说明qFill3。适量的媒体计划，并设置它填补了在每孔45uL体积。
5. 清除空气中使用清除功能的机器人，直到媒体可见来自歧管的每一个引脚从油管和多方面的。
6. 用LB媒体使用qFill3填写所需数量的板块。每盘大约需要20秒，以填补。
7. 装入适当的qPix2机器人领域的库板和新鲜的板块。填写相应的试剂清洁浴缸; 2％，在后方浴Micro90，蒸压在中间浴蒸馏水，80％的乙醇在前面浴。
8. 使用"复制"计划的qPix2。在软件中，选择适当的头，源盘和目标板的数量和类型。还成立....

讨论

在大肠杆菌中表达了一个高通量筛选，从一个大的插入基因组DNA的宏基因组文库的快速检测纤维素活动大肠杆菌是在本议定书。这个方法是在CMC /刚果红在文献中常用的检测改善。这是解决方案为基础，并允许一锅煮化学筛选与定量分析，使读者从板块的吸光度读数最终输出384孔板。在这个过程的每一步自动化允许超过25每小时384板无监督检查。从软件中的数据可以很容易地导出到Microsoft Excel电子表格，或通过第三方软件进行分析处理。

这个实验的一个局限在大肠杆菌表达外源蛋白的潜力存在大肠杆菌主机。一个宏基因组库的一个子集，其中包含来自许多不同生物的DNA，可以确认的大肠杆菌大肠杆菌转录/翻译机器。即使表示，外源基因的产品可能无法实现的功能，由于不当的折叠，加工，或表达水平的不足。这些限制，可以部分抵消通过复制控制系统的利用率，在以前的功能的宏基因组筛查^研究 。 12。 pCC1复制控制fosmid用在这里可以通过诱导L -阿拉伯糖诱导此外，从一个增加拷贝数，每个.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
qPix2	Genetix		，带 384 针网格头
qFill3	Genetix		，带 384 孔歧管
Varioskan	Thermo Fisher Scientific， Inc.
RapidStak	Thermo Fisher Scientific， Inc. 公司		连接到 Varioskan
Micro90 去污剂	Cole-Parmer	18100-00	在水中稀释至 2%
乙醇	主要实验室供应商		，在水中稀释至 80%
氯霉素	Sigma-Aldrich	C0378	12.5mg/mL，溶于乙醇
LB 肉汤，Miller	Fisher Scientific	BP1426-2	25g/L，高压灭菌
384 孔平底板	康宁	3680
L-（+）-阿拉伯糖	Sigma-Aldrich	A3256	100 mg/mL 水溶液
乙酸钾	Fisher Scientific	P171	50 mM 水溶液，高压灭菌，用 HCl
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
盐酸 Trizma	Sigma-Aldrich	T3253	在 TE 缓冲溶液中，100 mM
EDTA 二钠盐	Sigma-Aldrich	E5134	在 TE 缓冲溶液中，由
Steve Withers 博士提供的	2,4-二硝基苯纤维二糖苷
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D8418