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方法文章

从宏基因组文库中筛选生物采矿纤维素酶活性的高通量筛选方法

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DOI：

10.3791/2461

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2011年2月1日

 ,  , 
1Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

本文内容

摘要

本方案描述了一种基于宏基因组文库在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达的纤维素降解活性的高通量筛选方法。该筛选基于溶液体系，高度自动化，采用384孔微孔板中的一锅法化学反应，最终通过吸光度测定进行检测。

摘要

纤维素是地球上最丰富的有机碳来源，在工业上具有广泛的应用，尤其在生物燃料生产方面的应用日益受到重视1。化学法修饰或降解纤维素通常需要强酸和高温条件。因此，酶法在生物转化过程中逐渐占据重要地位。尽管从细菌和真菌分离物中鉴定出具有活性的纤维素酶已取得一定成效，但自然界中绝大多数微生物难以在实验室条件下培养。环境基因组学（也称为宏基因组学）筛选策略在弥补培养空白、寻找新型生物转化酶方面展现出巨大潜力。已有研究通过使用刚果红染色的羧甲基纤维素（CMC）琼脂平板（基于Teather和Wood的方法5），成功从多种环境中筛选出新型纤维素酶，包括土壤2、水牛瘤胃3和白蚁后肠4。然而，CMC方法通量有限，无法实现定量检测，且信噪比较低6。其他方法也有报道7,8，但均依赖琼脂平板检测，不适用于大片段基因组文库的高通量筛选。本文介绍一种基于显色性二硝基苯酚（DNP）-纤维二糖苷底物的溶液相筛选方法，用于检测纤维素酶活性9。我们的文库被克隆至pCC1拷贝控制型fosmid载体中，通过诱导拷贝数增加来提高检测灵敏度10。该方法在384孔微孔板中进行单管反应，最终通过吸光度测定读取结果。该检测方法具有定量性、高灵敏度和自动化优势，结合液体处理系统和带堆叠装置的酶标仪，每日通量可达100块以上384孔板。

方案

在开始本实验方案之前，您需要准备好以384孔板形式保存的宏基因组文库。在本研究中，我们采用pCC1拷贝控制型fosmid载体，并结合噬菌体T1抗性的TransforMax EPI300-T1R E. coli细胞作为文库宿主，将文库板保存于-80°C条件下11。

1. 宏基因组文库板的复制

  1. 将含有文库的平板在 37°C 下解冻约 20 分钟，或直至所有孔完全解冻。
  2. 使用 qPix2 上的紫外光灭菌功能对机器人进行 15 分钟的灭菌处理。
  3. 在 500 mL 试剂瓶中配制 LB 培养基，加入氯霉素至终浓度为 12.5 µg/mL，并加入阿拉伯糖至终浓度为 100 µg/mL。每块平板约需 20 mL，额外多配制 50 mL 以补偿死体积。
  4. 按照制造商说明设置 qFill3，将培养基瓶通过无菌管路连接至分配头。设定程序以分配适量培养基，并设置每孔加入 45 µL 体积。
  5. 使用机器人的排空功能排出管路和分配头中的空气，直至可见培养基从每个针头流出。
  6. 使用 qFill3 将 LB 培养基加入所需数量的平板中。每块平板填充时间约为 20 秒。
  7. 将文库平板和新鲜平板装载到 qPix2 机器人的相应位置。在清洗槽中加入适当的试剂：后槽加入 2% Micro90，中槽加入高压灭菌的蒸馏水，前槽加入 80% 乙醇。
  8. 使用 qPix2 的“复制”程序。在软件中选择合适的针头、源平板和目标平板的数量及类型。设置针头在每次复制之间进行清洗，通常每个槽清洗 6 个循环即可。该设备一次最多可处理 10 块平板，使用 384 针头复制全部平板约需 15 分钟（使用 96 针头则约需 50 分钟）。
    注意：软件中提供“搅拌源”或“搅拌目标”选项，但建议不要使用这些选项，因为此前使用这些功能时曾出现过问题。
  9. 平板复制完成后，将其置于湿度盒中，在 37°C 下培养 24 小时。由于添加阿拉伯糖会诱导fosmid的高拷贝数表达，克隆生长速度通常比未诱导的克隆慢。培养结束后将文库平板放回 -80°C 保存。
    注意：在湿度盒中培养可防止平板边缘孔中培养基蒸发，从而为所有孔提供均匀的培养环境。
  10. 清洁 qFill3 机器人时，先用水（约 50 mL）冲洗，再用 80% 乙醇（约 50 mL）冲洗。拆卸组件后，将瓶体、瓶盖和管路用铝箔纸包裹，清洗并进行高压灭菌处理。

2. 测量生长 E. coli 克隆

  1. 从37°C培养箱中取出培养板。移去并单独放置盖子，将培养板放置在RapidStak配备的载板平台上，最多可放置25块板。
    注意：堆叠中底部的培养板将首先被读取。请务必记录培养板的顺序，因为软件不会记录此信息。
  2. 从RapidStak中取出一个载板架，确保其为空，然后将其推入待读取的培养板堆中。握住手柄，所有培养板应全部装入载板架中。将载板架装入RapidStak。
    注意：载板架的角落有一个小螺丝，用于指示培养板的A1孔应朝向该角落。载板架在RapidStak上仅能以一种方向安装。
  3. 在连接仪器的计算机上打开SkanIt RE程序。选择“新建实验”并为其命名。选择“Corning 平底384孔板”作为培养板类型。
  4. 在“板布局”区域，点击“向导”按钮，并选择向板中添加384个未知样本。
  5. 在“实验方案”区域，选择“孔循环”选项，并输入384个孔。屏幕左侧的流程树中将出现一个“孔循环”图标。选中该图标并点击添加“光度测量”。将其设置为在600 nm处读数。
  6. 使用唯一名称保存您的实验方案，并关闭SkanIt RE程序。
  7. 在计算机上打开PolaraRS程序。
  8. 在主页面上，会有一个表格列出连接到RapidStak设备的仪器。VarioSkan应位于该表格的左侧。在VarioSkan标题下，会出现两个链接：“RunSession”和“Inkubate”。点击“RunSession”选项。
  9. 将弹出一个新窗口，即检测窗口，中间显示一个流程图。选择“RunSession”项（这应是唯一存在的项目）。屏幕右侧将出现一个下拉菜单。在此菜单中找到您已保存的SkanIt RE运行程序的名称。
    注意：此菜单的排序似乎没有规律，既不是按字母顺序，也不是按添加日期，也与协议在计算机上的保存位置无关。这意味着您必须浏览所有协议才能找到自己的协议，这非常不便。
  10. 选中您的实验方案后，在右上角点击“运行此检测”。
  11. 将弹出一个对话框，要求您指定用作来源的载板架以及空的载板架。屏幕上的下方框对应前面的载板架。[可选：它要求您输入已加载的培养板数量，以估算所需时间。此估算通常偏差很大。]
  12. 确保RapidStak和VarioSkan均已开启，然后点击“确定”。
  13. RapidStak将自动将您的培养板装入酶标仪，实现连续测量。读取25块板大约需要50分钟。
    注意：建议观察第一块板装入VarioSkan的过程，以确保仪器对齐正确。如果RapidStak未能正确装入酶标仪，请使用PolaraRS窗口右上角的“暂停此检测”按钮。
  14. 当VarioSkan完成所有培养板的读数后，取下装满的载板架并将其放回载板平台。抬起平台的外框，载板架应滑出，留下培养板在中间堆叠。将盖子重新盖回相应的培养板上。

3. 将检测混合液加入各孔板

  1. 使用预配制的裂解液10倍储存液（10% Triton X-100、100 mM ris、10 mM EDTA）在pH 5.5的50 mM醋酸钾缓冲液中配制测定混合液。用DMSO配制浓度最高达75 mg/mL的DNP-纤维二糖底物储存液，确保底物完全溶解。将DNP-纤维二糖储存液加入测定混合液中，使其终浓度为0.1 mg/mL。每块板约需20 mL溶液，并额外配制50 mL以补偿死体积。
    注意：DNP-纤维二糖在水中不易溶解，因此使用DMSO可提高其溶解度。DMSO在最终测定溶液中的存在无明显影响。
  2. 按照制造商说明设置qFill3，将试剂瓶通过无菌管路连接至分配头。设定所需培养基体积，并编程使每孔分配45 µL体积。
  3. 使用仪器的排空功能排出管路和分配头中的空气，直至从分配头每个针头可见液体流出。
  4. 使用qFill3将测定混合液加入每块板中。每块板填充时间约为20秒。
  5. 加入测定混合液后，将板置于37°C湿度盒中孵育12–16小时。
    注意：加入测定混合液后若孵育时间过长，会导致板外周孔内液体蒸发，使外周孔吸光度读数高于内孔。可通过将板置于湿度控制孵育箱中孵育以避免此现象。

4. 检测克隆的吸光度

  1. 从37°C培养箱中取出培养板。移除并妥善放置盖子，将培养板放置在RapidStak配套的载板平台上，最多可放置25块培养板。
    注意：堆叠中位于底部的培养板将首先被读取。请务必记录培养板的顺序，因为软件不会记录此信息。
  2. 从RapidStak中取出一个载板架，确认其为空，然后将其推入待读取的培养板堆叠上。握住手柄，所有培养板应自动装入载板架中。将载板架装入RapidStak。
    注意：载板架的角落有一个小螺丝，用于指示培养板的A1孔应朝向的位置。载板架在RapidStak上只能以一种方向安装。
  3. 在连接仪器的计算机上打开SkanIt RE程序。选择“新建实验”，并为其命名。选择“Corning 平底384孔板”作为培养板类型。
  4. 在“板布局”区域，点击“向导”按钮，并选择将384个未知样本添加至培养板中。
  5. 在“实验方案”区域，选择“孔循环”选项，并设置为384孔。屏幕左侧的流程树中将出现一个“孔循环”图标。选中该图标并点击添加“光度测量”。将其设置为在400 nm处读数。
  6. 使用唯一名称保存您的实验方案，并关闭SkanIt RE程序。
  7. 在计算机上打开PolaraRS程序。
  8. 主页面将显示一张表格，列出连接到RapidStak设备的仪器。VarioSkan应位于该表格的左侧。在VarioSkan标题下会出现两个链接：“RunSession”和“Inkubate”。点击“RunSession”选项。
  9. 将弹出一个新窗口，即检测窗口，中间显示流程图。选择“RunSession”项（应为唯一存在的项目）。屏幕右侧将出现一个下拉菜单。在此菜单中找到您之前保存的SkanIt RE运行文件名称。
  10. 选择实验方案后，点击右上角的“运行此检测”按钮。
  11. 将弹出一个对话框，要求您指定用作来源的载板架以及空载板架。屏幕下方的框对应前面的载板架。[可选：系统会提示您输入已加载的培养板数量，以估算所需时间。该估算通常偏差较大。]
  12. 确保RapidStak和VarioSkan均已开启，然后点击“确定”。
  13. RapidStak将自动将培养板送入酶标仪，实现对多块培养板的连续测量。
    注意：建议观察第一块培养板进入VarioSkan的过程，以确保设备对齐正确。若RapidStak未能正确加载酶标仪，请使用PolaraRS窗口右上角的“暂停此检测”按钮。
  14. 当VarioSkan完成所有培养板的读数后，取出已满的载板架并放回载板平台上。抬起平台外侧的矩形框，载板架应滑出，留下培养板堆叠在中央。培养板可按照实验室规程进行处理。
  15. 要导出吸光度读数，请打开SkanIt RE软件，选择“打开现有文件”。
  16. 选择您保存实验的目录，点击“+”图标展开列表，标题下方将显示“Container 1”至“Container N”的选项，具体数量取决于培养板数目。选择第一个需要分析的培养板。
  17. 在页面顶部的菜单栏中，选择“数据处理 > 报告/导出”
  18. 选择所需的导出选项。
    注意：我通常选择导出“板布局”和“光度测量”数据。
  19. 点击“查看报告”，然后点击“文件 > 保存”。选择目标目录。输出格式为Microsoft Excel电子表格。

5. 代表性结果

图2展示了含有阳性克隆的一个384孔板的吸光度读数示例。与未表达纤维素酶活性的克隆相比，阳性克隆的吸光度显著升高。检测时间、孔板上孔的位置或DNP浓度（可能因过滤未溶解的DNP而引入差异）等因素均可能影响绝对吸光度读数。相对吸光度读数，例如高于整板平均值或列平均值的吸光度差值，是鉴定纤维素酶阳性克隆更为可靠的方法。

在从文库板中鉴定出阳性克隆后，建议将所有阳性克隆转接至新培养板中进行二次筛选。这可以消除因孔位位置或培养板差异带来的影响，并实现对阳性克隆之间更直接的比较。

纤维素酶活性高通量筛选示意图；384孔板，大肠杆菌生长分析。
图1. 构建于大肠杆菌（E. coli）并保存于-80°C的宏基因组文库高通量检测流程图。

OD400 与孔位关系图，显示微孔板各孔的光密度数据，实验结果。
图 2. 来自一个含阳性克隆的 384 孔板的吸光度读数。纤维素酶阳性克隆可通过相较于阴性克隆显著增加的吸光度来识别。

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讨论

本实验方案描述了一种高通量筛选方法，用于快速检测在大插入片段基因组DNA宏基因组文库中于E. coli中表达的纤维素酶活性。该方法是对文献中常用的CMC/刚果红法的改进，基于溶液反应，可在384孔板中进行一体化化学反应筛选，最终通过酶标仪读取吸光度值，实现定量分析。该流程的每一步均可自动化操作，可在无人监管的情况下每小时完成超过25块384孔板的筛选。数据可轻松从软件导出至Microsoft Excel电子表格，便于使用第三方软件进行后续分析或处理。

该检测方法的一个局限性在于外源蛋白在表达潜力方面的问题 E. coli 宿主。一个宏基因组文库包含来自许多不同生物体的DNA，其中只有一部分能够被识别 E. coli 转录/翻译机制。即使外源基因得以表达，其产物也可能由于错误折叠、加工不当或表达水平不足而无法发挥功能。这些局限性可通过使用拷贝数控制系统在一定程度上得到弥补，正如先前的功能宏基因组筛选研究所示。 12此处使用的 pCC1 复制控制型fosmid可通过添加诱导剂L-阿拉伯糖进行诱导，使拷贝数从每...

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致谢

作者感谢 Steve Withers 博士和 Hong-Ming Chen 提供 DNP-纤维二糖底物。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
qPix2Genetix配备 384 针点样头
qFill3Genetix配备 384 孔歧管
VarioskanThermo Fisher Scientific, Inc.
RapidStakThermo Fisher Scientific, Inc.与 Varioskan 连接
Micro90 去垢剂Cole-Parmer18100-00用水稀释至 2%
乙醇Major Lab Supplier用水稀释至 80%
氯霉素Sigma-AldrichC0378溶于乙醇，浓度为 12.5 mg/mL
LB 培养基（Miller 配方）Fisher ScientificBP1426-225 g/L，经高压灭菌
384 孔平底板Corning3680
L-(+)-阿拉伯糖Sigma-AldrichA3256溶于水，浓度为 100 mg/mL
乙酸钾Fisher ScientificP171溶于水，浓度为 50 mM，经高压灭菌，用 HCl 调节 pH 至 5.5
吐温 X-100Fisher ScientificBP151
Trizma 盐酸盐Sigma-AldrichT3253TE 缓冲液中浓度为 100 mM
EDTA 二钠盐Sigma-AldrichE5134TE 缓冲液中浓度为 10 mM
2,4-二硝基苯基纤维二糖苷由不列颠哥伦比亚大学 Steve Withers 博士提供
二甲基亚砜Sigma-AldrichD8418

参考文献

  1. Rubin, E. M. Genomics of cellulosic biofuels. Nature. 454, 841-845 (2008).
  2. Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase. J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).
  3. Duan, C. J. Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens. J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).
  4. Zhang, Y. H. P. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).
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  8. Huang, J. S., Tang, J. Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).
  9. Tull, D., Withers, S. G. Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi. Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).
  10. Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host. PNAS. 104, 5590-5595 (2007).
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  13. Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones. Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).
  14. Johnson, E. A. Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum. Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).
  15. Stutzenberger, F. J. Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost. Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).

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宏基因组文库筛选纤维素酶活性检测DNP-纤维二糖底物384孔微孔板高通量筛选基于溶液的筛选吸光度测定酶标仪液体处理仪湿盒培养
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