大鼠急性心肌梗死模型

摘要

急性心肌梗死（AMI）的大鼠模型可用于研究心肌梗死对心脏病理生理学和生理功能的影响。

摘要

由于心力衰竭是美国的主要死因（Hunt），生物医学研究对于推进心血管疾病治疗至关重要。能够模拟人类心脏疾病的动物模型，如诱发心力衰竭的心肌梗死（MI）和缺血-再灌注（IR）模型，以及通过压力超负荷（横主动脉缩窄）诱发心肌肥厚和心力衰竭的模型（Goldman 和 Tarnavski），均为研究心血管疾病的有用工具。特别是尽管已对动脉硬化等风险因素进行控制，并可通过外科干预进行治疗，心肌缺血（MI）仍是导致心血管疾病发病率和死亡率居高不下的主要原因（Thygesen）。此外，心肌缺血（MI）后心肌组织的急性丧失会导致负荷增加，进而引发梗死边缘区及远端非梗死心肌的室壁重塑。心肌细胞凋亡、坏死以及随之而来的血流动力学负荷增加，会激活多种细胞内生化信号通路，从而启动左心室扩张、肥厚、心室形态扭曲和胶原瘢痕形成。这种病理性重塑以及无法恢复正常增高的壁应力，最终导致进行性扩张、边缘区心肌被纳入瘢痕区域，并逐渐恶化心肌收缩功能（即心力衰竭）。大鼠左心室功能障碍和心力衰竭的发展过程与经历大面积心肌梗死、存活后继发心力衰竭的患者相似（Goldman）。大鼠急性心肌梗死（AMI）模型已被广泛用于模拟人类心血管疾病，特别适用于研究与心力衰竭相关的心脏信号机制，以及评估治疗策略对心力衰竭的干预效果。本报告所述方法即为大鼠急性心肌梗死（AMI）模型，该模型也被称为急性缺血性心肌病或缺血-再灌注（IR）模型；通过结扎左前降支动脉（LAD）造成30分钟急性缺血，随后松解结扎以实现组织再灌注而建立（Vasilyev 和 McConnell）。本方案将重点介绍在再灌注4小时后，使用伊文思蓝染料和三苯基四氮唑氯化物（TTC）评估梗死面积和风险区域（AAR）的方法；同时亦提供关于通过调整再灌注时间来评价心脏功能和重塑变化的补充说明。总体而言，该大鼠AMI动物模型可用于研究心肌梗死对心脏病理生理和生理功能的影响。

方案

1. 手术区域的准备

1. 首先用70%乙醇对操作表面进行消毒。
2. 所有手术器械在手术前（以及每只大鼠手术之间）均需使用热珠灭菌器进行灭菌。这些器械包括：手术剪（2把）、镊子（1把）、弯头镊子（1把）、持针器（2个）和胸腔牵开器。
3. 应备有棉纱布和棉签，以控制出血。
4. 调节恒温毯系统（加热垫）的温度，用于维持动物体温在37±1°C，以防止体温急剧下降；梗死面积的大小取决于缺血持续时间以及体温（Tarnavski et al.）。
5. 在麻醉前，每只动物应在手术前一天皮下注射一次布托啡诺（0.1–2.5 mg/kg SQ），并口服卡洛芬片剂（Rimadyl, Bioserv tablet；1片）。在手术开始前即刻，每只动物再次给予一次布托啡诺（0.1–2.5 mg/kg SQ）。
6. 注意：对于需要在一段时间内（7至28天及以上）评估心脏功能和心脏重构的研究，术后24–48小时内每6小时给予一次布托啡诺（0.1–2.5 mg/kg SQ），并每日一次提供卡洛芬口服片剂（参见“术后恢复”）。

2. 大鼠的准备与插管

1. 在麻醉诱导前，需对动物进行检查，以识别可能影响手术结果的任何既往状况；体格检查包括肉眼观察以及心率、呼吸频率、体温和体重的测量。
2. 若确定动物健康，则称量250–300克的雄性大鼠（例如Sprague Dawley），并记录其识别特征。
3. 随后使用戊巴比妥（80 mg/kg）对大鼠进行麻醉；通过按压大鼠趾甲床（足趾夹捏反射）检测肢体回缩反应，以确认适当的麻醉深度，并在手术过程中定期重复检查。
4. 手术时给予布托啡诺（0.1–2.5 mg/kg；皮下注射）。
5. 然后使用电动剃毛器剃除颈部和胸部区域的毛发。注意：对于需要在一段时间内（7至28天及以上）评估心脏功能和心脏重构的研究，必须将手术区域的毛发完全剃净，以维持无菌状态。
6. 剃毛区域需用聚维酮碘溶液擦洗并消毒，随后用70%酒精擦拭；该聚维酮碘和酒精的擦洗及消毒步骤需重复三次。
7. 将麻醉后的动物仰卧位放置于恒温毯系统（加热垫）上，以维持体温。
8. 通过在气管上方的颈部正中做一5 mm切口并分离肌肉组织，小心暴露气管，以增强插管时的视野清晰度，随后进行气管插管。
9. 此操作有助于更清晰地观察气管插管（聚乙烯管，规格90；PE 90）的插入过程，该导管边缘呈斜面，便于顺利通过喉部。
10. 在手术体视显微镜辅助下，通过小心移动舌头并观察气管及气管插管入口，将气管插管插入气管内。
11. 随后将气管插管连接至Kent Scientific呼吸机（TOPO双模式），设置呼吸频率为每分钟80次，潮气量为每100克体重1.2 ml，以实现机械通气。
12. 将无菌手术巾覆盖于大鼠身体上，仅暴露手术区域，从而最大限度减少术中污染风险。
13. 手术操作者及助手须佩戴口罩、手术衣和手套；在不同大鼠手术之间需更换手套。

3. 左前降支（LAD）动脉暂时性结扎

1. 待呼吸稳定后，使用止血钳或圆头剪刀在左侧第四肋间隙处打开胸腔，仅分离肋间组织而不切断，以减少出血风险。
2. 将胸腔牵开器置于第四肋间隙，以撑开肋骨，充分暴露左心室（LV），操作过程中需格外小心，避免损伤肺组织。
3. 随后切开心包膜，但尽可能保留其原位。
4. 在手术立体显微镜下辨认近端左前降支（LAD）动脉（图-1），并使用6-0 Prolene缝线对LAD进行短暂结扎（或使用滑结），造成30分钟的缺血期（图-1），但不将心脏外翻。
5. 为实现心脏再灌注，在LAD结扎30分钟后，使用显微外科剪刀剪断由6-0 Prolene缝线形成的结扎线（或松开滑结）。
6. 在假手术对照组大鼠中，操作步骤完全相同，但不对LAD进行短暂结扎。
7. 随后短暂（1–2秒）夹闭呼吸机的呼气端，以使肺重新充气。
8. 移除胸腔牵开器，使用2-0 Prolene缝线以间断缝合法将肋骨拉拢闭合。
9. 肋骨闭合后，再次短暂（1–2秒）夹闭呼吸机的呼气端，以确保呼吸正常。
10. 皮肤使用6-0 Prolene缝线以连续缝合法闭合。

4. 确认左前降支冠状动脉结扎成功

1. 通过观察缝合远端心肌组织变白以及前壁功能障碍，可确认左前降支（LAD）结扎成功；这与短暂性 LAD 结扎期间所观察到的现象一致。
2. 通过心肌组织恢复为红色，并观察到前壁运动部分恢复，可确认再灌注成功；此现象在短暂性 LAD 结扎后立即出现。
3. 注意：对于需要评估心脏功能及心脏重构的研究（时间范围为7至28天及以上），应在 LAD 结扎术后24小时进行超声心动图检查，以确定所诱导心肌梗死的程度。所有经超声心动图测定左心室短轴缩短率（LV FS）< 20%、且前壁运动障碍与梗死区域相符的动物，将被选入后续的心功能和心脏重构研究。假手术对照组大鼠的左心室短轴缩短率（LV FS）预期为正常范围，介于40–45%之间（del Monte et al）。

5. 术后恢复

1. 手术完成后，应移除动物身上的无菌铺巾。需持续监测动物的体温（通过直肠温度计测量）、呼吸频率（通过视觉观察）、心率（通过触诊）以及疼痛的异常表现，直至动物恢复自主活动能力。
2. 将大鼠从呼吸机上移下后，放入动物笼中，使其从麻醉状态中恢复。在该笼子中，一端将使用加热垫进行加热，以便大鼠可自行寻找温暖区域。此外，在此观察期间应为大鼠提供饮水。
3. 若术后观察到脱水迹象，需经腹腔注射（IP）0.5 ml无菌生理盐水。
4. 术后应立即皮下注射（SQ）布托啡诺（0.1–2.5 mg/kg），并在术后恢复期间继续使用。
5. 注意：对于需在一段时间内（7至28天及以上）评估心脏功能与心脏重构的研究，应在术后每6小时给予一次布托啡诺（0.1–2.5 mg/kg SQ），持续24至48小时。此外，还应提供卡洛芬口服片剂（Rimadyl, Bioserv tablet）（每日1片），至少持续术后48小时。

6. 缺血再灌注的组织学评估

1. 完成4小时再灌注期后，用80 mg/kg戊巴比妥再次麻醉大鼠，并重新结扎左前降支（LAD）（或重新扎紧滑结）（Huang等和Kaiser等）。
2. 随后向右心室腔内注射1 ml 5%伊文思蓝溶液（溶于磷酸盐缓冲液中），灌注2分钟。
3. 2分钟后，向右心室腔内注射1 ml饱和氯化钾溶液，以停止心脏跳动。
4. 迅速取出心脏，包埋于2%琼脂糖磷酸盐缓冲液中，切成1–2 mm厚的切片。
5. 将存活心肌组织用2%氯化三苯基四氮唑（TTC）染色20分钟，并拍摄每一切片的图像。随后对图像进行定量分析，以确定心肌区域面积：（1）非危险区（蓝色区域）；（2）危险区（AAR；红色与白色区域）；（3）梗死区（白色“未染色”区域）（图2）。

7. 代表性结果

对于涉及评估梗死面积和风险区域（AAR）的研究，可在再灌注4小时后采用伊文思蓝染料和氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法进行检测。通过观察结扎线远端心肌组织变白以及前壁功能障碍，可确认左前降支（LAD）结扎操作正确，这与短暂性LAD结扎期间的观察结果一致。再灌注成功可通过心肌组织恢复红色以及前壁运动部分恢复来验证，该现象应在短暂LAD结扎后立即观察到。对于需要在一段时间内（7至28天或更长）评估心脏功能及心脏重构的研究，缺血后正确结扎并完成再灌注也可通过组织变白、前壁运动功能障碍以及再灌注后组织恢复红色并伴随部分室壁运动恢复来确认。此外，可在LAD结扎术后24小时进行超声心动图检查，以评估诱发的心肌梗死程度，从而判断心脏功能是否受损。所有经超声心动图测定左心室短轴缩短率（LV FS）< 20%、且前壁运动异常符合梗死特征的动物，将被筛选出来用于后续的心功能和心脏重构研究。假手术对照组大鼠的左心室短轴缩短率（LV FS）应正常，介于40–45%之间（del Monte）。

图1. 心肌梗死及左前降支结扎示意图。（1）心肌梗死示意图，以及（2）使用缝线结扎左心室前降支（LAD）动脉，用于模拟由斑块形成引起的心肌梗死。

图2. 大鼠心肌梗死后心脏的代表性图像。该图像显示大鼠心脏中蓝色区域（非阻塞冠状动脉灌注区）、红色区域（阻塞冠状动脉灌注区，指示梗死风险区（AAR））以及白色/黄色区域（位于AAR内的梗死区域）。

讨论

大鼠的急性心肌梗死（AMI），也称为缺血-再灌注（IR）模型，常用于模拟人类心室重构并最终导致心力衰竭的过程。在动物模型（大鼠和小鼠）中，左心室功能障碍和心力衰竭的发展过程与人类心肌梗死（MI）后存活并继发心力衰竭的临床进程相似（Goldman）。本方案概述了该技术的一种实施方式，并包含描述方法学变异的附加说明。急性心肌梗死（AMI）操作的其他变异包括缺血持续时间和再灌注持续时间。此外，关于手术入路以暴露并结扎左前降支（LAD）的方法也存在差异。就缺血期持续时间而言，可通过短暂结扎LAD（30分钟至60分钟；AMI）或永久性结扎（持续性；MI）来诱导心肌梗死。至于心肌评估前的初始缺血期之后的再灌注持续时间（即随后的再灌注期），可设置为短时程（4小时至24小时），以通过伊文思蓝染色和氯化三苯基四氮唑（TTC）染色评估梗死面积和风险区域（AAR）；也可设置为长时程（7天至28天及以上），以评估心脏功能及心室重构。这种病理性心脏重构（包括凋亡、坏死和左心室功能障碍）的程度将取决于所选择的缺血和再灌注持续时间。作为另一种手术方式，除了通过第四肋间切口轻微暴露心脏而不将心脏挤出胸腔以结扎LAD（参见第3部分：短暂性左前降支动脉结扎）外，还可采用胸...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
呼吸机	Kent Scientific	TOPO	TOPO 双模式
恒温循环器 E103	Harvard Apparatus	732802
恒温毯系统	Harvard Apparatus	55-7222F
体视显微镜	Nikon Instruments	MMA36300	SMZ-645 变焦体视显微镜
电热灭菌器	Harvard Apparatus	610183
电动剃须刀	GE Healthcare
刀片和刀柄	Welch Allyn	690047-1	标准（灯式）喉镜刀片
手术剪	Fine Science Tools	14014-17
手术剪	Fine Science Tools	14072-10
镊子	Fine Science Tools	11028-15
弯头镊子	Fine Science Tools	11001-12
持针器	Fine Science Tools	12004-18
持针器	Fine Science Tools	91201-13
胸腔牵开器	Fine Science Tools	17008-07
面罩	VWR international	47730-640
纱布海绵	Dermacea	441205
无菌手套	Cardinal Health	2D7203I
PE 90 管路	BD Biosciences	427420
20 ml 注射器	BD Biosciences	301625
6-0 Prolene 缝线	Ethicon Inc.	8706H
2-0 丝线缝线	Ethicon Inc.	K873H
戊巴比妥钠注射液	OVATION Pharmaceuticals	NDC 67386-501-55
聚维酮碘	NOVAPLUS	V10-8204
布托啡诺	Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1