对含有新生肽酰-tRNA的核糖体进行生化分析的主要障碍在于，同一样品中存在其他核糖体，这些核糖体并未参与待分析的特定mRNA序列的翻译。我们开发了一种简单的方法，可特异性纯化仅含有目标新生肽酰-tRNA的核糖体。
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摘要
摘要
近年来，结构生物学和生物化学研究已详细揭示了核糖体在抗生素抑制蛋白质合成以及新生多肽合成过程中发生的诸多分子事件。其中一些抗生素以及主要以肽基-tRNA形式存在的调控性新生多肽，可抑制肽键的形成或翻译终止过程1-7。这些抑制事件能够阻断核糖体的移动，该现象被称为“翻译停滞”。由抗生素或新生多肽诱导的翻译停滞已被证明可调控参与多种细胞功能的基因表达，包括细胞生长、抗生素耐药性、蛋白质转运和细胞代谢等8-13。深入了解抗生素和调控性新生多肽如何改变核糖体功能，对于我们全面理解核糖体在所有生物体翻译过程中的作用至关重要。
在此，我们介绍一种简单的方法，可用于特异性地纯化正在翻译特定mRNA并含有特定肽基-tRNA的核糖体，以供分析使用14该方法基于选择性分离与生物素标记的mRNA结合的正在翻译的核糖体。利用链霉亲和素包被的磁性微珠（SMB）和磁场（MF），可将这些翻译复合物从同一混合物中的其他核糖体中分离出来。生物素标记的mRNA通过体外转录反应合成，以PCR扩增的含有T7启动子的DNA片段作为模板。T7 RNA聚合酶能够将生物素-UTP中的生物素-16-UMP掺入RNA中；在我们的实验条件下，一条600个核苷酸、尿苷酸含量为25%的mRNA大约可掺入十个生物素-16-UMP分子。随后将这些生物素标记的mRNA纯化，并用于 体外 使用从释放因子2（RF2）耗竭的无细胞提取物中获得的翻译实验 大肠杆菌 含有野生型或突变型核糖体的菌株。由于缺乏通常负责翻译终止的RF2蛋白，翻译生物素标记mRNA序列的核糖体会在终止密码子区域停滞。通过SMB和MF分离并去除含有新合成的肽基-tRNA的停滞核糖体。这些磁珠仅结合含有生物素的mRNA分子。
分离的翻译复合物可用于分析野生型或突变型核糖体组分、肽酰-tRNA序列的结构与功能特征，以及确定核糖体与抗生素或其他分子因子的相互作用1,14-16。为了检测这些分离核糖体复合物的功能，可在抗生素嘌呤霉素存在下进行肽基转移酶活性测定1。为了研究翻译复合物的结构变化，可采用已建立的实验方法，例如：i）与特异性氨基酸交联14，和/或 ii）烷基化保护实验1,14,17。
方案
1. 细胞-free 提取物制备。
- 从对数生长期培养物中获得的2克干燥的大肠杆菌（Escherichia coli）菌体沉淀，用500 mL缓冲液A（含10 mM Tris-乙酸盐，pH 8.0，14 mM 乙酸镁，60 mM 乙酸钾，以及50 μg/mL 苯甲基磺酰氟（PMSF））洗涤两次，每次在4°C下以5000 × g离心5分钟。洗涤后，将菌体沉淀重悬于40 mL缓冲液A中。
- 使用法国压菌器（French Press）破碎细菌细胞，施加6000 psi的压力（相当于使用1英寸活塞时的600个单位）。将破碎后的悬液收集至洁净的玻璃试管（50 mL）中。
- 将破碎后的悬液加入1 mM二硫苏糖醇（DTT）处理，然后在30,000 × g下离心30分钟。离心后取上清液，再次重复离心操作。将最终获得的上清液分装至微量离心管中（每管1 mL）。最后，使用干冰-乙醇混合物或液氮速冻分装样品，并于-60°C或-80°C保存。
2. 制备去除 RF2 的无细胞提取物。
- 将4.5 mL的Protein A Sepharose 4B浆液珠与5 mL抗RF2抗血清在室温下置于旋转轮上混合，孵育1小时。以2500 × g离心，使珠子与抗血清分离。弃去上清液后，含有抗RF2抗体的珠子（抗RF2珠）用1 mL缓冲液B重悬进行洗涤，缓冲液B的成分为：35 mM Tris-乙酸盐（pH 7.8）、10 mM乙酸镁、30 mM乙酸铵、60 mM谷氨酸钾以及5 μg/mL亮抑蛋白酶肽蛋白酶抑制剂。通过与上述相同的离心条件将抗RF2珠与缓冲液B分离。该洗涤步骤重复进行两次。
- 取1 mL无细胞提取液，与150 μL抗RF2珠在4°C下置于旋转轮上混合，孵育2小时。以10,000 × g离心，使无细胞提取液与珠子分离。移除上清液后，再次加入另一份150 μL抗RF2珠进行处理。对所得的无细胞提取液再重复此步骤一次。最终的无细胞提取液分装至微量管中，每管100 μL。使用干冰-乙醇混合物或液氮将样品迅速冷冻，并储存于-60°C或-80°C。
3. DNA模板的制备。
- 通过将含有待翻译序列的质粒模板（600 飞摩尔，见图 1）与图 1 中所示的每种寡脱氧核苷酸（0.4 纳摩尔）、每种 dNTP（0.2 微摩尔）以及 50 U Taq-DNA 聚合酶在 Stratagene 公司提供的缓冲液中混合，配制 1 mL 的 PCR 反应体系。扩增反应条件如下：94°C 预变性 2 分钟，然后进行 30 个循环（94°C 变性 30 秒，55°C 退火 30 秒，72°C 延伸 1 分钟），最后 72°C 延伸 12 分钟。
- 通过加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 2 体积的预冷无水乙醇沉淀 DNA，纯化 PCR 产物。重复沉淀步骤一次。将 DNA 溶解于 100 μL 经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水中。
通常情况下，该步骤可获得约 100 μg 的 600 bp DNA 产物。 - 通过琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的完整性。
4. 生物素标记 mRNA 的制备。
- 制备一种 100 μL 体外 在经DEPC处理的水中通过混合进行转录反应 5 μg PCR 生成的 DNA 片段与 0.5 微摩尔的 ATP、CTP、GTP，0.3 微摩尔的 UTP，以及 50 纳摩尔的生物素-16-UTP 10 μL 在 Promega 公司提供的缓冲液中加入 T7 酶混合物。将反应混合物在指定温度下孵育 37°C 3小时。
为定量获得的mRNA含量，应通过加入无RNase的DNase去除DNA模板。将反应体系在 37°C 10分钟 - 通过加入1/10体积的3 M醋酸钠（pH 5.2）和2体积的冷乙醇沉淀RNA，以纯化mRNA产物。重复沉淀步骤一次。将mRNA重悬于 100 μL 经DEPC处理的水。
通常，该步骤可获得 1-2 mg 的 600 nt 生物素标记的 mRNA 产物。 - 通过琼脂糖凝胶电泳验证生物素标记的mRNA产物的完整性。
5. 分离含有肽基-tRNA 的翻译核糖体。
- 准备 500 μL 的一个 体外 在经DEPC处理的水中混合10-15 μg 使用75纳摩尔的每种十九种氨基酸（除将被放射性氨基酸取代的氨基酸外）对生物素标记的mRNA进行标记， 50 μCi 放射性氨基酸（37 MBq）以及20–50 μL 含 40 mM Tris-乙酸盐（pH 8.0）、10 mM 乙酸镁、175 mM 乙酸钾、10 mM 乙酸铵、2 mM DTT、2 mM ATP、0.5 mM GTP、30 mM 磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、0.3 U/mL 丙酮酸激酶（PK）、3.5% 聚乙二醇 8000、1 mM 精脒的缓冲反应体系中的 RF2 耗尽型无细胞提取物 20 μg/ mL 叶酸，和 250 μg/ mL tRNA 来自 E. coli. 将反应混合物在指定条件下孵育 37°C 10分钟。
反应组分的添加顺序非常重要。必须先将无细胞提取物与含有氨基酸的缓冲液混合，并将最终混合物在室温下孵育5分钟，以激活核糖体。随后加入生物素标记的mRNA。对于采用化学修饰方法进行的结构分析，无需添加放射性标记氨基酸。 - 向翻译反应混合物中加入3 mL链霉亲和素磁珠（SMB），该磁珠悬浮于缓冲液C中，缓冲液C含有35 mM Tris-乙酸盐（pH 8.0）、10 mM乙酸镁、175 mM乙酸钾、10 mM乙酸铵和1 mM DTT。将新形成的悬浮液在室温下孵育10分钟。
- 使用磁力架通过施加磁场（MF）将SMB从混合物中分离。
- 用缓冲液 C 重悬 SMB，利用磁力架（MF）再次分离磁珠。重复此洗涤步骤两次。将磁珠重悬于 500 μL 加入缓冲液C，将悬液置于冰上保存，并立即进行下一步操作。
6. 含肽基-tRNA 的分离核糖体分析。
用于肽基-tRNA
- 将10 µL SMB（悬浮于缓冲液C中）与10 µL含有50 mM Tris-HCl（pH 6.8）、2.5%（v/v）甘油、4%十二烷基硫酸钠、2 mM DTT和0.2 mg/mL溴酚蓝的上样缓冲液混合。通过在10% Tris-三羟甲基氨基甲烷聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离结合在磁珠上的组分。
- 使用真空凝胶干燥仪干燥凝胶。
- 将干燥后的凝胶曝光于X射线胶片，以验证肽基-tRNA的完整性和纯化效果。
用于核糖体 RNA
- 向10 μL珠悬浮液中加入190 μL用DEPC处理水配制的2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，以及200 μL经水饱和的苯酚。剧烈涡旋混匀悬浮液，然后在室温下以10,000 × g离心3分钟，分离无机相与有机相。收集上层水相至新的微量离心管中。
- 向水相中加入1/10体积的3 M醋酸钠（pH 5.2）、1 μL 20 mg/mL糖原溶液和2倍体积的预冷乙醇，沉淀RNA。将RNA重悬于10 μL DEPC处理水中。
- 通过琼脂糖凝胶电泳检测核糖体RNA的完整性。
通常，50 μL珠悬浮液可获得1 μg核糖体RNA。
7. 代表性结果：
图2展示了利用上述方案分离的正在翻译的核糖体的质量与功能评估的一系列分析结果。在聚丙烯酰胺凝胶中观察到一条清晰的特异性条带，表明存在与固定在SMB上的生物素标记mRNA结合的多肽（图2A）。通过该方案纯化出核糖体RNA，也证实了核糖体与这些生物素标记的mRNA相结合（图2B）。加入嘌呤霉素（一种可激活核糖体肽基转移酶活性的抗生素）后，会导致新生肽链-tRNA发生裂解1。这一现象在聚丙烯酰胺凝胶中表现为所分离多肽迁移模式的改变（图2C）。综上，这些数据表明，固定在SMB上的生物素标记mRNA携带具有肽基-tRNA的功能性核糖体。
分离含有特定肽基-tRNA的正在翻译的核糖体，可用于研究肽基-tRNA、抗生素及其他分子对核糖体功能（图3A）以及核糖体结构（图3B）的影响。本文所展示的示例中，抗生素sparsomycin和氨基酸色氨酸（Trp）可抑制RF2在分离核糖体中诱导的新生tnaC-tRNA肽基-tRNA的水解性切割（图3A）。sparsomycin或Trp与核糖体的相互作用还会引起构成正在翻译核糖体23S rRNA的某些核苷酸发生结构变化（图3B）。综上所述，通过本文所述方法获得的生物材料，有助于进一步理解核糖体在与多种分子因子相互作用时，其功能受抑制所涉及的结构接触位点。
图1. 用于制备和纯化含有肽酰-tRNA的翻译核糖体的实验步骤。长约650 bp的DNA片段，包含 tnaC 基因及其相邻区域（如图所示）被用作模板，以制备含有生物素的mRNA，即[(bio)UMP]mRNA。这些DNA片段通过PCR扩增获得，所用寡脱氧核苷酸如图顶部所示。下划线字母标示了T7启动子在核苷酸引物中的位置。粗体字母表示Shine-Dalgarno序列，该序列在翻译过程中发挥作用。 tnaC mRNA序列。DNA片段中的T7启动子可被T7 RNA聚合酶识别，并用于转录（箭头） tnaC 序列以及下游的非编码序列。当RNA聚合酶到达DNA片段3'-端后，转录终止。 rpoBC 终止子序列（rpoBC“t”）。该茎环结构的 rpoBC 终止子可保护mRNA免受无细胞提取物中存在的3'-5'外切核糖核酸酶活性的降解 体外 翻译反应。分离得到的[(生物素化)UMP]mRNA用于生成停滞的、正在翻译的核糖体，通过使用 体外 翻译实验。该 tnaC mRNA中的[(bio)UMP]序列由核糖体进行翻译，当最后一个氨基酸被掺入时，由于反应体系中缺乏释放因子（RF2），核糖体会停滞。利用链霉亲和素磁珠（SMB）分离核糖体-[(bio)UMP]mRNA复合物，SMB可特异性结合mRNA中掺入的生物素标记核苷酸。通过施加磁场（MF），将结合有核糖体-[(bio)UMP]mRNA复合物的SMB从总反应体系中提取出来。
图2. 分离复合物的结构与功能分析。A） 体外 翻译反应使用含有起始密码子的[(bio)UMP]mRNAs进行 tnaC 基因被终止密码子取代。最终产物使用链霉亲和素磁珠进行分离，如图1所示。反应产物及分离得到的分子随后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 tnaC-tRNA 和 tnaC 肽段条带已标记。B) 使用酚抽提法从停滞的复合物中分离总RNA。每种分离的RNA均通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。图中指示了核糖体RNA（rRNAs）。C) 含有分离复合物的 tnaC-tRNAs 在室温下分别与（+）或不与（-）0.02 mM 嘌呤霉素（Puro）孵育 10 分钟。 tnaC 使用[35S]-甲硫氨酸（A）或[3H]-脯氨酸（B）在翻译过程中对肽进行标记。
图 3. 含有结合抗生素斯巴霉素（sparsomycin）或氨基酸色氨酸（tryptophan）的 tnaC-tRNA 的核糖体的结构与功能分析。A) 将分离得到的含有 tnaC-tRNA 的复合物在室温下与（+）或不与（-）斯巴霉素（Spar）或色氨酸（Trp）孵育 5 分钟。随后，向混合物中加入 RF2，并在 37°C 下继续孵育 20 分钟。B) 分析分子结合核糖体内时诱导的 23S rRNA 甲基化变化。分离的复合物在 37°C 下预先与（+）或不与（-）2 mM Trp 或 Spar 孵育 5 分钟。然后加入烷基化试剂二甲基硫酸酯（dimethyl sulfate），并在室温下继续孵育 20 分钟。提取总 RNA，并使用与 23S rRNA 中位于修饰核苷酸下游 100 个核苷酸处互补的 [32P] 标记寡脱氧核苷酸进行引物延伸实验。引物延伸实验的最终产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。图中标注了受 Trp 或 Spar 存在影响的 23S rRNA 核苷酸位点。
讨论
本报告中描述的分离步骤具有高度可重复性。然而，由相同翻译序列产生的短肽基-tRNA无法方便地完全避免；这类肽基-tRNA可能占总分离材料的15–20%（图2C）。当使用较高浓度的生物素标记mRNA，或所用无细胞提取物存放时间较长或被多次重复使用时，这些污染物的浓度可能会增加。因此，严格控制各组分的质量与浓度至关重要 体外 翻译反应。或者，也可使用市售的高效重组无细胞提取物进行相同目的的实验（PURE系统）。18.
通过该方法，生物素-16-UMP 会随机掺入目标 mRNA 的全长序列中。某些含有尿苷串的开放阅读框（ORF）可能在序列中掺入了这种修饰核苷酸，从而影响其翻译。为了获得最高效的翻译效果，必须在 mRNA 合成过程中测试不同比例的生物素-16-UTP 与 UTP 的相对浓度。也可采用其他生物素标记方法，靶向 mRNA 最稳定的 5'-端。（i）可利用 3'-NH2ATP（3'-氨基-3'-脱氧腺苷三磷酸）和 T4 RNA 连接酶将生物素连接至 mRNA 的 5'-端19。（ii）也可使用 T4 RNA 连接酶将 5'-端生物素标记的寡核苷酸连接至 mRNA 的 5'-端20。（iii）还可使用与 mRNA 5'-端互补序列对应的 3'-端生物素标记的寡脱氧核苷酸来分离正在翻译的复合物。这些生物素标记的寡脱氧核苷酸可在分离前预先连接至链霉亲和素磁珠（SMB）。随后，将连接了寡脱氧核苷酸的 SMB 加入翻译反应体系中，使其与互补的 mRNA 序列发生结合。分离后，可通过 RNase H 降解杂交的 RNA-DNA 区域——即生物素标记的寡脱氧核苷酸与 mRNA 序列之间的杂交区段，从而将停滞的复合物从链霉亲和素磁珠上解离。这种替代方法可能有助于未来利用更高分辨率的技术对复合物进行结构分析。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
L.R.C.-V. 谨将本文献给已故的 Adriel D. Johnson 博士，他是一位杰出的教授，始终将学生教育置于首位。我们怀念您，Adriel。我们感谢 Jacqueline Moreno 在开展本研究所述实验过程中提供的帮助。本研究得到了美国国家科学基金会向 C.Y. 提供的资助（项目编号：MCB-0615390），以及阿拉巴马大学亨茨维尔分校向 L.R.C.-V. 提供的启动资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Tris 碱 | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| 乙酸镁 | Fluka | 63049 | |
| 谷氨酸钾 | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 乙酸铵 | Fluka | 09688 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protein A sepharose 4B 悬浮液珠 | Sigma-Aldrich | P9424 | |
| 亮抑蛋白酶肽抑制剂 | Sigma-Aldrich | L9783 | |
| Taq-DNA 聚合酶 | Stratagene, Agilent Technologies | 201223 | |
| T7 Maxiprep 试剂盒 | Promega Corp. | P1300 | |
| SMB | Promega Corp. | Z5482 | |
| 生物素-16-UTP | Roche Group | 1388908 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| PEP | Sigma-Aldrich | P7002 | |
| PK | Sigma-Aldrich | P7768 | |
| 聚乙二醇 8000 | Fluka | 81268 | |
| 亚叶酸 | Fluka | 47612 | |
| 亚精胺 | Fluka | 85558 | |
| 来自 E. coli 的 tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T5816 | |
| L-氨基酸 | Sigma-Aldrich | LAA21 | |
| DTT | Fluka | 43815 | |
| 磁力分离架 | Promega Corp. | Z5342 |
参考文献
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