本方案描述了从膜蛋白在立方相脂质中的重组开始，获得可用于衍射分析的晶体所需的关键步骤，包括利用LCP-FRAP预结晶实验筛选初始条件、设置LCP结晶试验以及晶体的收获。
本文内容
摘要
摘要
膜蛋白在活细胞中执行与信号转导、物质运输和能量转换相关的关键功能，因此与多种功能障碍和疾病密切相关。然而，相较于可溶性蛋白，人们对膜蛋白在结构与功能方面的理解仍严重滞后，这主要归因于其在增溶以及获得可用于衍射分析的高质量晶体方面存在诸多困难。in meso 结晶法（也称为介晶相结晶或LCP结晶）是一种极具前景的技术，已成功应用于获得微生物视紫红质、光合作用蛋白、外膜β桶蛋白以及G蛋白偶联受体的高分辨率结构。该方法利用了类似天然的膜环境，通常与传统去污剂溶液结晶相比，所获得的晶体溶剂含量更低、有序性更好。该技术本身并不复杂，但需要掌握脂质相行为的相关知识，并具备操作黏稠介晶相材料的经验。本文演示了一种使用注射器混合器制备LCP并将在脂质双分子层中重建膜蛋白的简单高效方法，随后将纳米量级的LCP样品分配至检测板或结晶板中，开展结晶前检测，并从LCP基质中收获晶体。这些方案为开展in meso结晶实验提供了基本指导；然而，与所有结晶实验一样，仍需进行广泛的条件筛选和优化，且不能保证一定获得成功结果。
方案
图11,2展示了一项in meso结晶实验的典型流程。预结晶LCP-FRAP实验为可选步骤；然而，该步骤可显著加快初始结晶条件的筛选过程，尤其适用于难以结晶的膜蛋白3。
1. 蛋白质在LCP中的重构
- 在去垢剂溶液中纯化目标膜蛋白，并将蛋白/去垢剂复合物浓缩至约 10 - 20 mg/mL，注意避免过度浓缩去垢剂1,4。
- 将约 25 mg 的 LCP 宿主脂质（通常为单油精）或脂质混合物转移至 1.5 mL 塑料离心管中，在 40 °C 下孵育数分钟，直至脂质熔化。
- 将一个连接器接头安装到一支 100 μL 耐压气密性注射器上。
- 使用可调移液器将熔融脂质吸入注射器中。记录注射器中脂质的体积。
- 用蛋白溶液以 2/3（v/v）的体积比装填另一支 100 μL 注射器。
- 通过连接器接头将两支注射器连接在一起。
- 交替推动注射器推杆，使脂质和蛋白在接头内针中来回移动，直至脂质介相变得均匀。LCP 在机械混合过程中自发形成，蛋白则被重组至 LCP 的脂双层中。可通过其透明且呈凝胶状的性状，以及在配备交叉偏振器的显微镜下观察无双折射现象来验证 LCP 的形成；如条件允许，也可通过小角 X 射线衍射进行验证1。
2. LCP-FRAP 预结晶实验
LCP-FRAP 实验旨在测量膜蛋白在不同筛选条件下于 LCP 中重组后的扩散特性3。膜蛋白在 LCP 中的长距离扩散对于成功结晶至关重要；然而，LCP 的微观结构会限制大分子蛋白或寡聚蛋白聚集体的扩散。in meso 结晶实验失败的常见原因之一是蛋白快速聚集，导致扩散能力丧失。已有研究表明，蛋白的聚集行为取决于特定的蛋白构建体、宿主脂质以及筛选溶液的组成3。
- 以荧光染料（Cy3 或类似物）标记蛋白质，蛋白质与染料的比例约为 100:1，去除未反应的染料后将蛋白质浓缩至约 1 mg/mL。可选择标记游离胺基或游离巯基。当标记游离胺基时，使用 pH 7–7.5 的条件以优先标记蛋白质的游离 N 末端。需注意，胺基标记也可能标记与蛋白质共纯化的脂质。2,3.
- 按照第1)节所述，将标记的蛋白质在LCP中重悬。
- 按照第3)节所述设置检测板，但使用LCP-FRAP筛选溶液代替结晶筛选溶液2.
- 将培养板置于培养箱中孵育 20 °C 在黑暗中静置至少12小时，以达到平衡状态。
- 将其中一块培养板置于LCP-FRAP工作站上，使用10x物镜对准第一个孔并调焦。
- 获取5张荧光图像以记录初始的漂白前状态。
- 触发激光。应调整激光功率和脉冲次数，使标记的蛋白质在漂白区域中心被漂白约30%–70%。
- 激光激发后立即开始以最快速度连续采集约200帧的快速漂白后图像序列。
- 随后记录约50张慢速漂白后图像序列，根据蛋白质的扩散速率选择每帧图像之间的时间间隔为1-20秒。
- 在所有帧中积分漂白区域内的强度，并通过将漂白区域内的强度除以激光漂白区域外参考区域的平均强度，校正采集过程中发生的漂白效应和光照强度波动。
- 将校正后的强度进行归一化处理，使漂白前的强度等于1，初始漂白时的强度等于0。
- 拟合归一化强度随时间变化的曲线， F(t)，使用以下公式5:
F(t) = M × exp(-2T/t) x (I0(2T/t) + I1(2T/t)), (公式1)
其中，M 为扩散分子的移动比例，T 为特征扩散时间， t 是每个记录帧的实际时间，I0 我1 是 0th 和 1st 修正贝塞尔函数的阶数 - 根据以下公式计算扩散系数 D：
D = R2/4T, (Eq.2)
其中 R 为漂白区域的半径。 - 移至下一个孔，重复步骤 2.5) - 2.13)。
- 比较不同筛选条件下获得的移动组分比例和扩散系数。根据促进蛋白质扩散的组分设计新的结晶筛选条件，并排除未观察到蛋白质扩散的条件。如果蛋白质在所有筛选条件下均未发生扩散，可考虑扩大筛选范围或尝试新的蛋白质构建体。
3. 设置LCP结晶实验
- 按照第1节所述方法在LCP中重悬蛋白质。
- 将含有蛋白质的LCP转移至连接在重复性注射器分配器上的10 μL气密注射器中。
- 在10 μL注射器上安装一根短的可拆卸针头（规格26，长度10 mm）。
- 在四个相邻孔的表面分别分配200 nL的LCP液滴，形成2×2方阵。
- 在每个LCP液滴上覆盖1 μL相应的结晶筛选溶液。
- 用一块18 mm的方形玻璃盖玻片封盖四个已加样孔。轻轻按压盖玻片以密封各孔。
- 对下一组四个孔重复步骤3.4)–3.6)，直至整块板全部加样完毕。
- 将该板在恒定温度下孵育，并定期检查晶体形成与生长情况。
4. 从LCP中收获晶体
- 将装有蛋白质晶体的晶体板置于配备可变变焦功能的体视显微镜下，显微镜需配置线性旋转偏振器和分析器。
- 使用低倍变焦聚焦于目标孔，使整个孔位于视野范围内。
- 使用陶瓷毛细管切割石的锋利边缘，在盖玻片玻璃上沿孔壁内侧划四道，形成一个方形刻痕。
- 使用尖锐的镊子在划痕边缘施加压力，使划痕穿透盖玻片玻璃的整个厚度。
- 在已划线的正方形对角处打两个小孔。
- 注射少量 μL 通过其中一个孔加入沉淀剂溶液，以减少后续步骤中的脱水现象。
- 使用带角度的锐利针头探针，沿一侧或两侧划破玻璃，以分离出切割出的方形区域。
- 小心抬起玻璃方片，观察立方相团块。如果团块粘附在盖玻片上，则将玻璃方片翻转并置于孔的底部。
- 多加几毫升 μL 沉淀剂溶液，并根据需要在孔中暴露的立方相团块上方添加防冻剂。
- 增加显微镜的放大倍数，并聚焦于晶体。
- 调节偏振器与分析器之间的角度，以增强双折射晶体与背景之间的对比度，同时保留足够的光线以便观察 harvesting loop。
- 选择与晶体尺寸相匹配直径的 MiTeGen MicroMount，然后通过将晶体直接舀入 MicroMount 的方式从 LCP 中收获晶体。
- 将收获的晶体连同MicroMount一起在液氮中进行闪冻，并送往同步辐射光源线站进行X射线数据收集6.
5. 代表性结果：
在杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中表达了一种经基因改造的人源β2肾上腺素能G蛋白偶联受体（β2AR-T4L），并在十二烷基麦芽糖苷（DDM）/胆固醇半琥珀酸酯（CHS）去垢剂溶液中纯化，该受体与部分逆向激动剂卡拉唑洛尔结合7。将该蛋白用Cy3 NHS酯标记后，用于LCP-FRAP结晶前检测（图2）。基于LCP-FRAP检测结果所选定的多个条件进行粗筛网格实验，获得了初步的类晶体信号（图3）。进一步优化沉淀剂条件后，得到了可用于衍射的高质量晶体（图4）。
图1. 典型LCP结晶实验的流程图。灰色框中的步骤在本实验方案中未作描述。
图2. 基于单油酸甘油酯LCP中β2AR-T4L/卡拉唑ol的LCP-FRAP实验。A) 以自动高通量模式进行的LCP-FRAP实验结果，其中96孔板中的每个样品依次进行漂白，并在30分钟孵育后测量荧光恢复。所获得的荧光恢复值代表各样品中的移动分数，并对全部96个样品作图显示。筛选溶液包含0.1 M Tris（pH 8）、30 % v/v PEG 400，并联合48种不同盐类在两种不同浓度下的组合。B) 若干代表性条件下的荧光恢复曲线。实线曲线为使用公式1拟合的结果。移动分数和扩散系数通过公式1和公式2确定。含氯化钠样品中低于10%的快速恢复，是由于与蛋白共纯化的荧光标记脂质所致。
图3. 通过围绕LCP-FRAP鉴定出的最有希望条件进行粗略网格筛选获得的β2AR-T4L/卡维地洛初始晶体（含硫酸钠（A图）和甲酸钠（B图））。蛋白质用Cy3 NHS酯标记，荧光图像使用543 nm激发光和605 nm发射光采集。
图4. β2AR-T4L/卡维地洛优化后的晶体。在硫酸钠（图A和B）和甲酸钾（图C和D）存在下生长的晶体图像，分别在明场模式（图A和C）和交叉偏振光下（图B和D）拍摄。
讨论
本实验方案为进行in meso结晶实验的主要步骤提供了基本的可视化指导。有关这些实验方案的更深入细节，包括可能存在的陷阱、局限性或替代方法，可参见其他文献1,2。在早期阶段，可选择性地采用LCP-FRAP实验，以帮助筛选最具前景的蛋白质构建体、LCP宿主脂质和脂质添加剂，并缩小可能的沉淀剂和缓冲条件的范围3。一旦获得初步的结晶结果，应进一步优化以获得质量更高的晶体。对in meso结晶条件的优化，基本类似于可溶性蛋白质结晶条件的优化，但需额外考虑与LCP组成相关的参数1。在脂质介相中生长的膜蛋白晶体通常比在去垢剂溶液中获得的晶体更小，但结构更为有序，因此能显著受益于现代同步辐射光源配备的微聚焦光束线6。
与原位结晶相关的许多步骤，包括设置结晶或检测板、进行LCP-FRAP检测以及晶体观察，已实现半自动或全自动1,2,8,9，可在消耗少量蛋白质和脂质的情况下筛选大量条件。然而，蛋白质在LCP中的重组以及晶体 harvesting 仍为手动操作，较为繁琐，因此亟需改进。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 GM073197 和 RR025336。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 μL 气密性注射器 | Hamilton Co | 7656-01 | 需要 2 支注射器 |
| 10 μL 气密性注射器 | Hamilton Co | 7653-01 | |
| 注射器连接头 | Hamilton Co | 7770-02 30902 | 连接头可使用现有部件自制，具体方法见参考文献 10 |
| 重复式注射器分配器 | Hamilton Co | 83700 | 可通过改装重复式注射器分配器，使分配体积减少约 3 倍11 |
| 短型（0.375”）平头可拆卸针头（3 型针尖，26 号规格） | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96 孔玻璃三明治板 | Marienfeld | 08 900 03 | 对于手动操作，使用标准显微镜载玻片和带有打孔的双面胶带组装玻璃三明治板更为方便1,2,12。 |
| 玻璃盖玻片 | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| 单油精（monoolein） | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| 结晶筛选试剂盒 | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | 大多数市售的结晶筛选试剂盒均可用于初步筛选。对于持续破坏脂立方相（LCP）的条件，可将其稀释 2 倍以提高兼容性13。 | |
| 毛细管切割石 | Hampton Research | HR4-334 | |
| 精细尖头镊子 | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| 带角度的尖锐探针 | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | 选择与晶体尺寸匹配的 MicroMount 直径 |
参考文献
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重印与许可
