机械操控神经元以调控轴突发育

摘要

使用经过校准的玻璃针，可高精度地对神经元施加并直接测量2-1000微达因范围内的作用力。该方法可用于控制和测量轴突发育的多个方面，包括轴突起始、轴突张力、轴突延伸速度以及力的矢量方向。

摘要

利用经过校准的玻璃微纤维可实现对细胞的操作以及神经元轴突的延伸，这些微纤维能够测量和施加10–1000 μdyne范围内的力^1,2。通过观察玻璃针的胡克弹性弯曲来获取力的测量值，其校准采用直接且经验性的方法完成³。本文详细描述了针具的制备、校准、处理及在细胞上使用的设备要求和操作步骤。此前所使用的力的范围以及已应用这些技术的不同细胞类型展示了该方法的灵活性，并作为未来研究的示例予以提供^4-6。该技术的优势在于能够连续“可视化”操作过程中产生的力，并可直接干预多种细胞事件，包括对轴突生长与回缩的直接刺激和调控⁷，以及对任何类型的培养细胞进行脱离操作和力学测量⁸。

方案

1. 制作玻璃针。

1. 使用可调节的微针拉制仪制备针尖呈锥形、长约 4 mm 的实心封闭梁结构微针。与长而柔韧的针尖相比，这种短至 4 mm 的长度可在实验过程中有效限制针尖的振动。在 4 mm 纤维的近端区域，针尖在 1 mm 范围内迅速从玻璃管的直径锥缩至 15 μm，而纤维最远端 1 mm 的直径为 2.5 μm。我们使用 R-6 玻璃毛细管（外径 0.9 mm，内径 0.6 mm，长度 8"）和 BB-CH 拉制仪。若研究者希望测量其他范围的力，则应拉制具有不同弹性性能（即不同长度或厚度）的微针。每根毛细管可拉制成四根 2" 长的微针。微针应存放于带盖的 160 mm 培养皿中，皿内放置两条造型粘土“蛇形支架”，将微针轻轻压入其中固定。
2. 玻璃微针以及下文将要描述的金属丝微针，本质上均为具有适当刚度的悬臂梁，用作测量所需力的弯曲弹簧。需注意的是，无论材料成分如何，梁的弯曲力与其长度的立方成正比。因此，在下述任何校准步骤中，若某根微针/梁的刚度不足，可通过略微缩短其长度来提高刚度（例如，缩短 10% 可使刚度增加 28%，即 0.9³）。

2. 制作和校准金属丝针头

1. 通过将一根直径为0.001英寸的铬镍合金丝插入玻璃针（第1.1节制备）内部（针尖已折断）来制作一根金属校准针。将金属丝从针尖拉出至26 mm长度，并用强力胶固定。将远端1 mm的金属丝弯成钩状。
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讨论

施加和测量细胞力的技术有着悠久的历史⁹。我们的方法最初受到Dennis Bray工作的启发，他使用类似于我们的玻璃针，通过电动液压装置以恒定速率“牵引”神经元¹⁰。目前存在多种向细胞施加力的替代方法，包括：步进电机¹¹、磁珠¹²、微加工梁¹³以及流体流动¹⁴。其中后一种方法与我们的方法类似，都是通过已知刚度的弯曲梁对细胞探针进行最终校准，并依赖光学显微镜观察来完成细胞测量。与其他方法相比，我们的方法³主要优势在于能够使用生命科学部门常见的设备（显微镜和显微操作器）同时施加并测量μdyne范围内的力。

利用这些方法，已测量出神经元生长锥前进时施加的力¹⁵。已确定轴突延伸速率对张力的力学响应关系遵循类似牛顿流体的刺激-响应关系⁷。研究表明，鸡胚中枢脑神经元对张力的相对敏感性高于外周神经元²。轴突回缩现象也已被研究⁷。对于尚未确定轴突的神经元，可通.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
R-6 毛细管	Drummond Scientific	9-000-3111	R-6 玻璃外径 0.9 mm，内径 0.6 mm，8"
BB-CH 拉针仪	Mecanex S.A.，瑞士日内瓦	BB-CH 拉针仪	使用模式 4 Alt，CP=100，PP=10，SP1=1000，SP2=1000
0.001" 铬镍合金丝	Omega Engineering, Inc.	SPCH-001-50	无护套热电偶丝，50 英尺线轴，现称为 Chromega
0.003" 康铜合金丝	Omega Engineering, Inc.	SPCI-003-50	无护套热电偶丝，50 英尺线轴
精细镊子	Fine Science Tools	91150-20	Dumont Inox #5
通用显微镜悬臂支架	Nikon Instruments	76135 或 90430	大多数品牌或类型的悬臂支架均适用于此用途
机械式显微操作器	Narishige International	M-152	三轴直驱粗调显微操作器
液压式显微操作器	Narishige International	MO-203	现可提供型号为 MMO-203，三轴可动类型
针持	Leica Microsystems	11520145	一套三个
单仪器夹持器	Leica Microsystems	11520142
双仪器夹持器	Leica Microsystems	11520143
机械式显微操作器	Leica Microsystems	39430001	立柱安装，1 个探针夹持器，RH 型号 430001
操纵杆式机械显微操作器	Leica Microsystems	11520137
Leica DM IRB	Leica Microsystems		倒置显微镜
Vibraplane 隔振台	Kinetic Systems	1200 系列	我们的型号为 1201-02-12
环形培养箱（Ringcubator）	自制（参见参考文献 19）		参考文献 19，需使用下文列出的更新版控制器
可编程温度控制器	Instrumart.com	Fuji Electric PXR3	替代已停产的 PXV3 温度控制器
Nikon Diaphot TMD	Nikon Instruments		倒置显微镜，约 1980 年产品
Nikon SMZ-10 双目解剖显微镜	Nikon Instruments		其他解剖显微镜亦可使用