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压力控制通气诱导小鼠急性肺损伤

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DOI：

10.3791/2525

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2011年5月5日

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Colorado

本文内容

摘要

一种用于研究急性肺损伤的呼吸机诱导肺损伤小鼠模型 体内. 本文报道了一种易于应用的 原位 使用高压机械通气诱导肺急性损伤的急性肺损伤模型。

摘要

小鼠模型被广泛用于研究不同器官系统的急性损伤（1-34）。急性肺损伤（ALI）可由长时间机械通气引发，是危重症患者发病和死亡的重要原因，针对新的遗传学或药理学靶点的研究目前正受到广泛关注（1-3, 5, 8, 26, 30, 33-36）。ALI 的特征是疾病急性发作，导致非心源性肺水肿以及随后的肺气体交换功能障碍（36）。我们已建立了一种通过压力控制通气诱导呼吸机相关性肺损伤的小鼠 ALI 模型（2）。具体方法为：对 C57BL/6 小鼠实施麻醉后行气管切开术，随后通过机械通气诱导 ALI。小鼠在压力控制模式下通气，吸气峰压为 45 mbar，持续 1 - 3 小时。评估指标包括肺水肿（湿重/干重比）、支气管肺泡灌洗液白蛋白含量、支气管肺泡灌洗液及肺组织髓过氧化物酶含量，以及肺气体交换功能（2）。利用该技术，我们已证实其可有效诱导急性肺部炎症，并能区分不同处理组或基因型之间的差异（1-3, 5）。因此，该技术可能有助于研究人员利用基因敲除小鼠模型，从遗传学角度探讨参与 ALI 的分子机制。

方案

一般注意事项：

所有操作均应在直立式解剖显微镜（Olympus，SZX10 配备 Z 轴手轮立柱和 STU2 支架臂）下进行，并使用外科凝固器（11）。实验组在年龄和体重方面应尽可能匹配，以确保结果的可比性。在整个过程中，温度、血压、麻醉和液体输注应保持稳定。

1. 麻醉与气管准备

  1. 使用至少10周大、体重为22–25 g的C57BL/6小鼠。腹腔注射戊巴比妥钠（6）诱导麻醉，剂量为70 mg/kg体重。以约10 mg/kg/h的速率维持麻醉。需谨慎避免过量，因为这可能显著降低血压。即使在数小时后追加戊巴比妥钠，也可能导致血浆浓度严重升高。
  2. 麻醉诱导后，将小鼠仰卧位固定，用胶带和缝线将四肢固定在手术台上，缝线系于踝部。同样通过牙齿将头部固定。充分的固定对于成功插管和精确控制手术过程至关重要。术前在小鼠体表涂抹矿物油，以降低小鼠毛发过敏的风险。为维持体温稳定，使用市售食品保鲜膜覆盖小鼠。
  3. 将小鼠置于温度可控的加热台上（RT，Effenberg，Munich，德国），并连接直肠温度探头至热反馈控制器，以维持体温在37°C。
  4. 手术暴露气管。分离气管两侧及背侧的结缔组织，并在气管下方分别置入两根10 cm长的3.0号丝线缝合线（Harvard apparatus，USA）。两根缝线应相距约1 cm。
  5. 使用McPherson-Vannas剪刀（8 cm，直刃；World Precision Instruments，USA）在喉部下方3–4 mm处的两个环状软骨之间小心切开气管。操作时应避免出血，因为出血可能干扰后续观察指标。
  6. 使用钝头聚乙烯导管（Insyte 22g，Beckton Dickinson，USA）进行气管插管。将聚乙烯导管尖端以85度角插入气管，随后倾斜导管使其与气管腔走行一致。缓慢将导管进一步推进气管，直至导管尖端完全进入胸廓入口。利用置于气管背侧的两根丝线缝合线将导管固定在此位置（见步骤1.4）。

2. 呼吸机相关性肺损伤技术

  1. 将导管连接至呼吸机。为诱导肺损伤，我们采用压力控制通气技术，使用 Siemens（DRE Veterinary，美国）生产的 Servo 900 C 呼吸机。动物通气参数设置为：吸气峰压 45 mbar，呼吸频率 80 次/分钟，呼气末正压 0–3 mbar，吸入氧浓度 FiO2 = 1.0。吸气与呼气时间比应为 1:1。尽管 Servo 900 C 是为人设计的呼吸机，但在压力控制通气模式下，其用于小鼠通气效果极佳。
  2. 使用心电图仪（例如 Hewlett Packard，Böblingen，德国）监测心率。确保心率不低于 400 次/分钟。当开始机械通气时，应观察到心电轴右偏，这是胸腔内压升高导致肺动脉压力升高的表现。若小鼠出现心动过缓，应检查体温及麻醉剂量/浓度。使用赛拉嗪/氯胺酮麻醉可导致心率降至 250 次/分钟，因此不推荐使用。
  3. 实施适当的液体替代治疗。应在通气前通过动脉或静脉导管以 0.1 ml/小时的速度输注生理盐水，以确保足够的静脉充盈。由于通气压力较高，静脉回心血量会受到抑制，可能导致平均动脉压显著下降。此外，术前可经腹腔给予 500 μl 生理盐水作为冲击剂量。
  4. 在颈动脉内放置导管以持续记录血压（27）。在开始分离动脉前，先将动物肢体固定于身体。通过钝性分离气管旁肌肉暴露颈动脉。进一步暴露过程中应仔细避免组织损伤（特别是迷走神经）。使用两根缝线和一个小夹钳（37）将导管插入血管，以便暴露更长的动脉节段。在颈动脉远端末端结扎一根缝线。将缝线末端固定在较大夹钳上以施加张力，或用胶带将缝线固定于操作台。在动脉周围再放置一根缝线，并向远端充分游离动脉。在此处放置一个小夹钳。使用显微剪刀在动脉上剪出一个微小的斜行切口。用精细镊子（Dumont，WPI）夹住切口，用手或镊子将合适尺寸的导管插入血管。用第二根缝线打结固定导管与动脉。松开夹钳，继续推进导管。通过多个结扎线和胶带固定导管。作为替代方案，可在实验结束时放置颈动脉导管，用于采集动脉血样进行血气分析。

3. 组织样本的回收

机械通气3小时后，采集样本以评估肺损伤程度。我们建议采集支气管肺泡灌洗液（BAL）、动脉血和肺组织。

  1. 实验结束时获取支气管肺泡灌洗液（BAL）。加深麻醉后，用1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗气管插管。液体应在气管/肺内保留三秒钟，然后通过连接的注射器回收。将回收的BAL液迅速在液氮中速冻，并在-80°C下保存以备进一步分析。请注意，回收的液体体积可能显著少于1 ml。
  2. 实验结束时进行血气分析。为此，应在胸骨下方做一切口。用镊子夹住胸骨，并沿肋骨延伸切口。接着在边缘处切开膈肌，并将其从肋骨上切除。此时可清晰观察到胸腔下口。用镊子抬起胸骨，并在左右两侧做尽可能靠外的长切口以打开胸腔，使整个前胸壁向上翻起。此操作应在实验动物仍接受机械通气时进行。使用27½G针头穿刺左心室，并使用i-STAT系统（Abbott，USA）进行动脉血气分析。如果需要进行动脉血气分析，则不应获取BAL液，因为这将对结果造成显著干扰。
  3. 作为上述方法的替代方案，可通过颈动脉导管采集动脉血样。但此操作应在获取BAL液之前完成。
  4. 通过上提心脏并切断气管的方式整块切除肺组织。准备一块组织以吸收血液，确保手术视野清晰。将心脏向腹部方向牵拉，并沿脊柱小心剪开，以游离所有胸腔器官。切断主动脉，取出胸腔器官并置于洁净的手术台上。
  5. 从组织样本上去除心脏和主要血管。确保肺组织上无残留的胸腺组织。用剪刀将左右肺分离，分别放入独立的管中并迅速冷冻。在-80°C下保存以备进一步分析。

4. 肺损伤的评估

我们建议使用以下结果参数来评估肺损伤程度：采用白蛋白ELISA（Bethyl Laboratories, USA）和髓过氧化物酶（MPO）ELISA（Hycult Biotechnology, USA）检测支气管肺泡灌洗液（BAL）中屏障功能障碍的程度以及炎性细胞的数量。同时对肺组织进行MPO ELISA检测。若需测定湿重/干重比，则不采集BAL液，且不冲洗肺循环（见3.3）。切除肺组织后，测量其湿重；随后将肺组织冷冻干燥48小时，再次称量干重。湿重/干重比以每毫克干组织所含水的毫克数（mg水/mg干组织）表示（5）。

机械通气不同时间后支气管肺泡灌洗液蛋白含量变化的柱状图，显示显著差异。
图 1. 支气管肺泡灌洗液（BAL）中蛋白含量对呼吸机诱导肺损伤（VILI）的反应。 小鼠以戊巴比妥麻醉后进行机械通气，采用压力控制通气模式（吸气压 45 mbar，呼气末正压 3 mbar，吸入氧浓度 100%）。在通气 0、1、2 和 3 小时后收集支气管肺泡灌洗液，并使用二辛可宁酸法（BCA 法）测定蛋白含量。图中显示的蛋白含量变化以通气 0 小时为基准进行归一化处理（n=4 每组，* 表示与对照组相比 p < 0.05，均值 ± 标准误 SEM）

讨论

本研究描述了一种在小鼠中建立呼吸机诱导肺损伤的技术。该模型通过高压通气可产生高度可重复的肺损伤。考虑在小鼠中研究急性肺损伤的研究人员可受益于该模型。

披露

我们无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国家心肺血液研究所资助，资助编号为R01-HL0921、R01-DK083385和R01HL098294（授予H. K. Eltzschig），1K08HL102267-01（授予T. Eckle），麻醉教育与研究基金会资助（授予T. Eckle和H. K. Eltzschig），美国心脏协会资助（授予T. Eckle和H. K. Eltzschig），以及德国研究基金会（DFG）研究奖学金（授予M. Koeppen）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
戊巴比妥钠（Fatal Plus）Vortech Pharmaceutical Ls, LtdV.P.L. 9372生理盐水中浓度为 4mg/mL
Insyte 22 GBD Biosciencesn/a
缝合线，4.0 号丝线Harvard Apparatus517698
缝合线，8.0 号 ProleneEthicon Inc.M8739可重复使用
Siemens 900°CDRE Veterinary# 336翻新设备
解剖显微镜（SZX10）Olympus Corporationn/a建议选择工作距离较大的型号
加热台Rt, Effenberger, Germanyn/a唯一供应商
血压监测设备Cyber Sense, IncBPM02
I STATAbbott Laboratoriesn/a

参考文献

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