Virochip 是一种泛病毒微阵列，旨在基于保守序列同源性，同时检测所有已知病毒以及新病毒。本文演示如何运行 Virochip 检测，以分析临床样本中是否存在已知和未知病毒。
本文内容
摘要
摘要
由于病毒本身具有内在的序列多样性，以及不断出现传统方法无法检测到的新型病毒病原体（如SARS冠状病毒和2009年大流行的H1N1流感病毒），许多传染性疾病的病毒病因诊断十分困难。为应对这些挑战，我们此前已开发并验证了一种名为Virochip的广谱病毒微阵列平台，该平台基于保守序列同源性，能够检测所有已知病毒以及新型变异病毒1。利用Virochip，我们已鉴定出与呼吸道感染相关的全部病毒谱系，包括住院患者中病因不明的重症病例，其检测灵敏度相当于甚至优于常规临床检测方法2-5。Virochip还被用于发现多种新型病毒，包括SARS冠状病毒6,7、一种新型鼻病毒进化枝5、XMRV（一种与前列腺癌相关的逆转录病毒）8、禽类博尔纳病毒（导致鹦鹉消耗性疾病的原因）9，以及在患有呼吸道和腹泻疾病的儿童中发现的一种新型心病毒10。截至2009年12月，当前版本的Virochip已迁移至Agilent微阵列平台，包含约36,000个探针，来源于GenBank中超过1,500种病毒。本文将演示从头到尾完成一次Virochip检测的全部步骤（约24小时周转时间），包括样本核酸提取、使用随机引物进行PCR扩增、荧光染料标记、微阵列杂交、扫描及数据分析。
方案
Virochip 检测的步骤包括：（1）从临床样本中提取核酸，（2）对提取的 RNA 进行逆转录以及 2nd-链cDNA合成，(3) 随机引物cDNA的PCR扩增，(3) 掺入Cy3荧光染料，(4) 将标记后的样本杂交至Virochip微阵列，以及(5) 扫描与分析（图1）。下述方案将演示在一名患有流感样疾病的儿童鼻拭子样本中使用Virochip检测的方法。
引物序列
引物A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3'
引物 B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3'
1. 核酸提取
- 临床样本的核酸提取应在生物安全二级（BSL-2）或更高级别的条件下进行，因为这些样本可能具有传染性。
- 鼻拭子样本需保存于病毒转运液中。取200 μL样本加入1.5 mL Eppendorf离心管中。
- 可选：将样本通过0.22 μm滤膜过滤（以纯化病毒颗粒）
- 可选：使用Turbo DNAse试剂盒（Ambion），按照制造商说明书对样本进行DNA酶预处理（以降解宿主基因组DNA，纯化被保护的、衣壳化的病毒核酸）
- 按照制造商说明书，使用Zymo ZR病毒RNA提取试剂盒或Qiagen Ultrasens病毒试剂盒提取样本。
2. 逆转录与2nd-链 cDNA 合成（“第一轮 A”）
- 加入1 μL 40 pmol/ μL 引物A加入4 μL提取的RNA中。加热至 65°C 在热循环仪（例如 GeneAmp PCR System 9700）中孵育 5 分钟，然后于室温冷却 5 分钟。
- 添加 5 μL 由一种主混合液组成，该混合液包含 2 μL 5X RT缓冲液， 1 μL 12.5 mM dNTP， 1 μL 水 0.5 μL 0.1 M DTT，以及 0.5 μL SSIII RT（Invitrogen）。37 °C孵育 42°C × 60 分钟。
- 在可编程热循环仪中加热至 94°C x 2 分钟（以终止逆转录反应），冷却至 10°C，脉冲离心，然后加入 5 μL 由Sequenase混合液组成 1 μL 5X Sequenase缓冲液， 3.8 μL 水，和 0.15 μL Sequenase（USB Corporation）。对于2nd 链合成，从...开始升温 10°C 到 37°C 超过 8 分钟，保持 8 分钟，然后加热至 94°C x 2 分钟（以灭活 Sequenase）并冷却至 10°C （保持）
- 可选 ：此时可将样品 cDNA 储存于 -20°C.
3. 随机引物cDNA的PCR扩增（“B轮”）
- 将5 μL Rd A样品加入45 μL的预混液中，预混液包含5 μL 10× PCR缓冲液、1 μL 12.5 mM dNTP、1 μL 100 pmol/μL的引物B、1 μL KlenTaq LA（Sigma）以及37 μL水。
- 运行PCR程序如下：94°C 2分钟 →（25个循环：94°C 30秒 / 50°C 45秒 / 72°C 1分钟）→ 72°C 5分钟 → 10°C（保存）
- 在1.5%琼脂糖凝胶电泳上检测Rd B样品，应观察到约200–1000 bp的弥散条带（图2A）。
4. Cy3 荧光染料的掺入
- 可选：另一个样本可用Cy5荧光染料标记，并与同一张微阵列进行杂交。
- 为掺入aa-dNTP，将5 μL Rd B样本加入45 μL的主混合液中，主混合液组成为：5 μL 10X PCR缓冲液、1 μL 12.5 mM aa-dNTP（Invitrogen）、1 μL 100 pmol/μL的引物B、1 μL KlenTaq LA（Sigma）以及37 μL水。PCR程序如下：94°C，2分钟→（15个循环：94°C，30秒 / 50°C，45秒 / 72°C，1分钟）→72°C，5分钟→10°C（保持）
- 使用DNA Clean and Concentrator-5试剂盒（Zymo Research）按照生产商说明书纯化Rd C样本，用10 μL洗脱。
- 向Rd C样本中加入1 μL 1M碳酸氢盐（Sigma）和1 μL Cy5（GE Healthcare）。
- 避光孵育1小时。
- 使用DNA Clean and Concentrator-5试剂盒（Zymo Research）按照生产商说明书纯化Cy3标记的样本，用12 μL洗脱。
5. 病毒芯片微阵列杂交
- 可选：使用 1.5 μL 样品在 Nanodrop 分光光度计上检测 cDNA 浓度及掺入的染料量（用于样品归一化）
- 在 PCR 条状管中加入 1 μL 25X 断裂缓冲液、5 μL 5X 封闭缓冲液、9.5 μL（或用于归一化的相应体积）Cy3 标记样品，并加水至总体积为 25 μL（Agilent）
- 加入 25 μL 2X GEx 杂交缓冲液（Agilent）。短暂离心以去除气泡。
- 将 40 μL 样品加载至垫圈玻片上。
- 将 Agilent 印制的 Virochip 芯片（加州大学旧金山分校 / Agilent）（标记“Agilent”的一面朝下）放置在垫圈玻片上方，并拧紧螺丝固定。
- 在 65°C、转速 10 rpm 条件下过夜杂交。
- 洗涤芯片时，先将缓冲液 2（Agilent）预热至 37°C。在缓冲液 1（Agilent）水下拆开垫圈玻片与芯片的夹心结构。用缓冲液 1 洗涤 1 分钟。用预热的缓冲液 2 洗涤 1 分钟。缓慢从缓冲液 2 中取出玻片，注意避免产生气泡（使用无尘纸吸去多余水分，注意避免直接接触芯片的活性面）
- 将玻片放入玻片架中，并插入芯片扫描仪。
6. Virochip 扫描与分析
- 根据仪器的标准扫描程序，以 5 μm 或 2 μm 对 Cy3 标记的芯片进行扫描（图 2B）。
- 通过目视检查、聚类分析或自动化的 Virochip 分析程序 E-Predict11 分析 Virochip 微阵列。这三种方法均可在鼻拭子样本（来自一名患有流感样疾病的儿童）中明确检测到流感病毒（图 2C）。
7. 代表性结果：
当实验步骤正确执行时，在Rd B步骤后，琼脂糖凝胶电泳应可见涂抹状条带（图2A）。在Agilent平台上进行的Virochip微阵列难以通过肉眼直接分析（图2B），但如果存在病毒，则应可通过目视检查、聚类分析和/或E-Predict方法轻松鉴定（图1C）。可向样本中加入已知病毒的定量核酸（例如烟草花叶病毒；MS2噬菌体）作为检测的阳性对照。
图1. Virochip微阵列处理与分析示意图。 从临床样本中提取的核酸经过随机扩增，用荧光染料标记后与Virochip微阵列进行杂交。微阵列以2 μm分辨率扫描，并利用多种计算工具（包括E-Predict）进行分析。
图2. Virochip检测的步骤。 经随机PCR扩增后，可通过凝胶电泳观察到大小为200 - 1000 bp的弥散条带 (A)。 (B) 显示了每张玻片上8个微阵列中的3个Virochip微阵列，右下角插图为其中一个微阵列的局部放大图。 (C) 使用E-Predict进行自动化的微阵列病毒分析，结果显示临床样本中存在甲型流感病毒。较高的相似性评分（s=0.55）对应接近于零的p值，表明该预测具有极高的显著性。
讨论
本文所述的Virochip实验方案较为复杂，需要由细致且技术娴熟的研究技术人员操作。PCR、标记和杂交过程中试剂的正确浓度和反应条件至关重要。可通过使用TRIzol（Invitrogen）等组织提取方法提取核酸，从而对Virochip实验方案进行简单修改，以适用于病变组织的分析。可根据需要随时增删探针，以获得理想的检测范围和覆盖广度；例如，可设计并快速添加用于检测细菌和真菌等非病毒目标的探针。目前正处于开发阶段的Virochip检测应用包括临床实验室中的广谱病毒诊断、疫情暴发调查、药物与疫苗的纯度筛查，以及新发病毒病原体的发现。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢 David Wang、Anatoly Urisman、Amy Kistler、Kael Fischer、Patrick Tang 和 Alexander Greninger 在 Virochip 实验方案的初步开发与优化中所做的贡献。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）K08 项目基金和雅培发现奖（授予 CC）以及霍华德·休斯医学研究所（授予 JLD）提供资助。
参考文献
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