胶原酶制备<ol><li>称取50 ml锥形加隔离缓冲 ，使终浓度，如表所示的胶原酶。涡旋溶解胶原酶。 （+ 2额外的小鼠12只小鼠= 14小鼠× 5毫升/鼠标= 70毫升的总胶原酶溶液） （70毫升× 0.5毫克/毫升或0.3 mg / ml的胶原酶P总= 35毫克或21毫克） <table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%"><tbody><tr><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">应变</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">年龄</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">胶原酶P（mg / ml的） </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">时间（min） </th></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H，BALB / C，B6 </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12周</td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H，BALB / C，B6 </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12周</td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 13 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px">点头，NOR，非</td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12周</td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px">点头，NOR，非</td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12周</td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr></tbody></table> </li><li>免除到每个玻璃小瓶，置于冰上胶原酶溶液2毫升。每5毫升注射器装入3毫升胶原酶添加30克针和冰的地方准备在引擎盖。 </li></ol>腹胀<ol><li>前清扫术，颈椎脱位而牺牲的动物。喷雾用70％的ETOH全身，使其完全湿透。请在生殖器部位开始V型insision。所以尾巴正面临着远离你的鼠标旋转。 </li><li>删除打开鼠标左侧肠。这将会使胰腺和胆总管。 </li><li>广场上的小肠，胆管水渠两侧的止血钳，留下一个小口袋胶原酶溶液进入肠道。 </li><li>膨胀通过与30克针和包含3毫升冷胶原酶溶液5毫升注射器的胆管，胰腺，胆囊开始。 </li><li>从体内取出的胰腺和它放置在一个硅的含胶原酶溶液2毫升的小瓶。这一步应该很快完成，并且尽可能干净，减少脂肪和结缔组织的集合。 </li><li>放置在冰上，然后重复步骤3与下鼠标的小瓶。 </li></ol>消化<ol><li>每个小瓶密封，放入37℃水浴。孵育13-17分钟（时间与应变和动物的年龄而异）。 </li><li>时间结束后，大力摇动小瓶。胰腺土崩瓦解。 </li><li>通过大型无菌水槽滤网倒入每个消化成无菌的1000毫升烧杯中，并有力地移液器关闭屏幕，用洗涤液。分送消化到50毫升conicals管（3 pancreata/50 ml管:如果n = 12，使用足够的洗涤液，使终体积为200毫升和分配到4x50毫升管）。稀释应采取迅速和冰 ，以避免不必要的胰岛消化 。 </li><li>离心:启动离心机。当它达到1300转时，将其关闭。 </li><li>吸出上清液，留下〜5毫升。必须非常谨慎，不吸沉淀。 </li><li>用你的手大力攻悬浮颗粒，然后添加50毫升缓冲液洗。 </li><li>离心:启动离心机。当它达到1300转时，将其关闭。 </li><li> 5毫升洗涤液，重悬沉淀和洗涤。 </li><li>转让5毫升到15毫升锥形和自旋向下，如上。 </li><li>尽可能完全吸出上清液。 （剩余的缓冲区可能导致聚蔗糖密度的变化。） </li></ol>聚蔗糖 快速执行。长期聚蔗糖接触有毒的小岛。 <ol><li>确保颗粒是彻底打破了之前加入聚蔗​​糖（完整的组织是很难重悬在聚蔗糖）。 </li><li>涡旋大力7毫升的聚蔗糖，密度1.108，重悬沉淀。 </li><li>层上的每个聚蔗糖2毫升为了在这余下的密度密度:1.096，1.069，那么1.037。 </li><li> 4度在1800 rpm的旋转15分钟， 以断绝！ </li><li>选择从第二层使用spoid（无菌p胰岛lastic吸管）。将所有集合的50毫升锥形含有约25毫升冷缓冲区。 </li><li>以上，洗净，用洗涤液（重复步骤12-15）的3倍。 </li><li>悬浮胰岛在20毫升的RPMI - 1640（含10％胎牛血清和青霉素和链霉素，HEPES的MEM - NEAA），轻轻混匀。取出100 UL的样品进行计数。 </li><li>转移100 UL 35毫米网格板含1毫升媒体和1毫升双硫腙。 </li><li>的RPMI 1640培养尚存的胰岛细胞，在37 ° C，7％的CO 2培养箱，在160毫米板共30毫升媒体/板。 <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="图1" width="220" height="194"></li></ol>

小鼠胰岛隔离

您好，我是 Greg Zott，来自加州大学旧金山分校（UCSF）糖尿病中心的 Bluestone 实验室。今天我将向您展示分离小鼠胰岛的操作流程。该过程包括将胶原酶溶液注射到 C3H 品系供体小鼠的胰腺中，随后取出胰腺，进行消化处理，通过密度梯度离心纯化胰岛，然后手工挑选胰岛，最终将其移植到糖尿病 NOD 小鼠的肾包膜下，后者将作为受体小鼠。在开始此操作之前，我们将ATE溶液用改良的Hanks缓冲液稀释，并根据我们所使用的C3H小鼠品系调整了其浓度。我们发现使用每毫升含0.8 mg胶原酶的溶液进行消化效果更佳，因此将采用该溶液注入胆总管以扩张胰腺。今天进行该操作的是糖尿病中心的Pavo Codre。他将进行小鼠手术，打开腹腔，暴露肠道，然后向胆总管内注射溶液。我们将用乙醇喷洒小鼠以压平毛发，然后通过脚趾夹捏法确认小鼠已正确处死。接下来，Pavo 将通过腹中线切口打开小鼠腹腔，暴露肠道和胰腺。同时将剪开膈肌，以确认小鼠已被处死。在开始之前，我想指出一些重要的结构。胃位于此处，胰腺附着于其下方并延伸至十二指肠及上方区域。这是肝脏，我们将在这里找到胆囊和胆总管，你可以在此处清楚看到。接下来，Pavo 将分离小肠，找到胆总管进入小肠的位置。暴露肠管后，我们在胆总管两侧使用蚊式钳进行夹闭。我们发现这种方法有利于更多的胶原酶进入胰腺，而其他研究团队则尝试将夹子直接放置在胆总管上方。我们发现这种方法更有利于酶进入胰腺。这是一种轻柔的操作过程，切勿撕裂肠管。应让止血钳轻轻置于胆总管两侧。现在我们将寻找胆囊，一旦胆囊暴露出来，便以其作为引导，将胶原酶注射至胆总管中。Powell 使用的是一支30号针头，连接含有3毫升胶原酶溶液的5毫升注射器。当他进入胆总管时，会用胶原酶溶液扩张该导管，然后沿胆总管向下推进，直至接近肠道。在向下推进的过程中，酶溶液被持续泵入并注入胰腺。现在胰腺已被胶原酶溶液充盈，Powell 将移除止血钳，然后小心地将胰腺从肠管上剥离下来，并从实验小鼠体内取出。他将其从胃部取出。好的，然后以脾脏作为抓手，将胰腺提起，再沿着胆总管缓慢剪下，操作完成。胰腺被取出后，接着移除脾脏，随后他去除肠系膜组织，然后将胰腺放入含有两毫升胶原酶溶液的无菌玻璃小瓶中，并重新置于冰上。我们将分离出的胰腺放入玻璃小瓶后，现需将其置于37度水浴中约17分钟。我们将胰腺置于50毫升锥形离心管架中，以防止其上浮。水浴开始时即启动计时器，消化过程随之开始。消化时间结束后，取出小瓶，轻轻振荡并轻柔地进行破碎。一旦组织开始解体，即将小瓶置于冰上。将无菌滤网置于含有洗涤缓冲液的400 mL烧杯上方。然后将胰腺消化液小心地倒入筛网上，使其流入洗涤缓冲液中。为了演示方便，此时已关闭通风橱，并将通风橱的玻璃拉起，以便观察操作过程。一旦胰腺消化液完全倒入烧杯后，需用相同的洗涤缓冲液冲洗离心管，并将洗涤缓冲液再次倒入筛网上。我们有一个装有洗涤缓冲液的注射器。将用它用力冲洗滤网上的组织。目的是冲走所有未与基质结合的游离小孔结构，同时将膜结构和未消化的组织保留在滤网上。当完成组织清洗后，通常会在实验步骤结束时看到如下情况。将位于管底的胰腺组织转移至两个50 mL离心管中，对组织进行清洗，充分混匀后均匀分配，使每根离心管中的组织沉淀体积相等。随后用更多清洗缓冲液冲洗烧杯。冲洗管壁，以确保所有进入烧杯的组织都被回收。然后将样品等量分装至两个 50 mL 离心管中，每管 50 mL，再用洗涤缓冲液补至满管。将组织反复倒置数次，然后放入离心机中。进行短暂离心。待离心机转速达到1000 RPM后，关闭离心机。此时组织非常脆弱，眼状结构也非常敏感，切勿过度挤压。移除试管后，我们将重复此洗涤步骤三次。这是第三次洗涤的结束。将50毫升锥形管中的组分转移至15毫升锥形管中，以1000 ×g离心后停止。弃去上清液，开始FI Call的第一步操作。此时我们已获得沉淀的胰腺消化物。我们将重悬该组织，使其充分松散，避免形成紧密的沉淀。加入第一层密度梯度液，即1108，每管加入5 mL。然后将沉淀物充分混匀于每种梯度溶液中。确保在最浓的梯度中获得良好的组织分布非常重要。现在我们将加入两毫升密度为1.096的溶液。然后在上层加入两密耳厚度、密度为1 0 6 9的溶液，再在其上层加入密度为1 0 3 7的溶液。在叠加不同密度溶液时，注意不要混合各层。至此，所有液层均已加入离心管中。你可以看到这是1 1 0 8的顶部，9 1 0 9 6的顶部，1 0 6 9的顶部以及1 0 3 7的顶部。即使尚未进行离心，你也可以观察到组织已经开始向其相应的密度位置迁移。将纤维素梯度在1800 RPM条件下离心15分钟，当离心管从离心机中取出后，请记得保持刹车关闭状态。在0 0 9 6层与0 0 7层之间，可以看到一层清晰的眼状组织带，即Pablo's。现在去除0 3 7层，以清除在处理过程中可能释放的组织碎片和DNA。使用无菌塑料巴氏德吸管，将眼状组织层移除，并转移至含有25 mL洗涤缓冲液的50 mL锥形管中。此步骤需快速完成，因为fol对眼器具有毒性。我们实际上已移除整个0 6 9和0 9 6层。Pavo切割塑料移液管的顶端，并用洗涤缓冲液冲洗。然后将小孔板进行离心，离心条件与之前相同。离心机升速至1000 RPM后停止，随后吸除上清液。小孔板将用洗涤液洗涤三次。因此，我们刚刚完成了眼睑分离过程，从消化物开始，经过fol梯度分离，最终获得纯化的眼睑组织。在使用洗涤缓冲液进行第三次洗涤后，我们将眼睑组织重悬于RPMI培养基中，并将其接种到组织培养板中。这些眼睑组织现在可用于体外实验或体内制备，例如眼睑移植。

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

Murine Pancreatic Islet Isolation

University of California, San Francisco - UCSF.

胶原酶制备<ol><li>称取50 ml锥形加隔离缓冲 ，使终浓度，如表所示的胶原酶。涡旋溶解胶原酶。 （+ 2额外的小鼠12只小鼠= 14小鼠× 5毫升/鼠标= 70毫升的总胶原酶溶液） （70毫升× 0.5毫克/毫升或0.3 mg / ml的胶原酶P总= 35毫克或21毫克） <table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%"><tbody><tr><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">应变</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">年龄</th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">胶原酶P（mg / ml的） </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left">时间（min） </th></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H，BALB / C，B6 </td><td style="font-size: 12px"> > 12周</td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H，BALB / C，B6 </td><td style="font-size: 12px"> <= 12周</td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 13 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px">点头，NOR，非</td><td style="font-size: 12px"> > 12周</td><td style="font-size: 12px"> 0.8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px">点头，NOR，非</td><td style="font-size: 12px"> <= 12周</td><td style="font-size: 12px"> 0.5 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr></tbody></table> </li><li>免除到每个玻璃小瓶，置于冰上胶原酶溶液2毫升。每5毫升注射器装入3毫升胶原酶添加30克针和冰的地方准备在引擎盖。 </li></ol>腹胀<ol><li>前清扫术，颈椎脱位而牺牲的动物。喷雾用70％的ETOH全身，使其完全湿透。请在生殖器部位开始V型insision。所以尾巴正面临着远离你的鼠标旋转。 </li><li>删除打开鼠标左侧肠。这将会使胰腺和胆总管。 </li><li>广场上的小肠，胆管水渠两侧的止血钳，留下一个小口袋胶原酶溶液进入肠道。 </li><li>膨胀通过与30克针和包含3毫升冷胶原酶溶液5毫升注射器的胆管，胰腺，胆囊开始。 </li><li>从体内取出的胰腺和它放置在一个硅的含胶原酶溶液2毫升的小瓶。这一步应该很快完成，并且尽可能干净，减少脂肪和结缔组织的集合。 </li><li>放置在冰上，然后重复步骤3与下鼠标的小瓶。 </li></ol>消化<ol><li>每个小瓶密封，放入37℃水浴。孵育13-17分钟（时间与应变和动物的年龄而异）。 </li><li>时间结束后，大力摇动小瓶。胰腺土崩瓦解。 </li><li>通过大型无菌水槽滤网倒入每个消化成无菌的1000毫升烧杯中，并有力地移液器关闭屏幕，用洗涤液。分送消化到50毫升conicals管（3 pancreata/50 ml管:如果n = 12，使用足够的洗涤液，使终体积为200毫升和分配到4x50毫升管）。稀释应采取迅速和冰 ，以避免不必要的胰岛消化 。 </li><li>离心:启动离心机。当它达到1300转时，将其关闭。 </li><li>吸出上清液，留下〜5毫升。必须非常谨慎，不吸沉淀。 </li><li>用你的手大力攻悬浮颗粒，然后添加50毫升缓冲液洗。 </li><li>离心:启动离心机。当它达到1300转时，将其关闭。 </li><li> 5毫升洗涤液，重悬沉淀和洗涤。 </li><li>转让5毫升到15毫升锥形和自旋向下，如上。 </li><li>尽可能完全吸出上清液。 （剩余的缓冲区可能导致聚蔗糖密度的变化。） </li></ol>聚蔗糖 快速执行。长期聚蔗糖接触有毒的小岛。 <ol><li>确保颗粒是彻底打破了之前加入聚蔗​​糖（完整的组织是很难重悬在聚蔗糖）。 </li><li>涡旋大力7毫升的聚蔗糖，密度1.108，重悬沉淀。 </li><li>层上的每个聚蔗糖2毫升为了在这余下的密度密度:1.096，1.069，那么1.037。 </li><li> 4度在1800 rpm的旋转15分钟， 以断绝！ </li><li>选择从第二层使用spoid（无菌p胰岛lastic吸管）。将所有集合的50毫升锥形含有约25毫升冷缓冲区。 </li><li>以上，洗净，用洗涤液（重复步骤12-15）的3倍。 </li><li>悬浮胰岛在20毫升的RPMI - 1640（含10％胎牛血清和青霉素和链霉素，HEPES的MEM - NEAA），轻轻混匀。取出100 UL的样品进行计数。 </li><li>转移100 UL 35毫米网格板含1毫升媒体和1毫升双硫腙。 </li><li>的RPMI 1640培养尚存的胰岛细胞，在37 ° C，7％的CO 2培养箱，在160毫米板共30毫升媒体/板。 <img title="figure-protocol-1" src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="figure-protocol-1" width="220" height="194"></li></ol>

小鼠胰岛隔离

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