胶原酶的制备
- 称取胶原酶至50 ml锥形管中，加入分离缓冲液，配制成下表所示的终浓度。通过涡旋振荡溶解胶原酶。
（12只小鼠 + 2只备用小鼠 = 14只小鼠 × 5 ml/只 = 共计70 ml胶原酶溶液）
（70 ml × 0.5 mg/ml 或 0.3 mg/ml = 共需胶原酶P 35 mg 或 21 mg）
品系 周龄 胶原酶P (mg/ml) 时间 (分钟) C3H, Balb/C, B6 > 12周 0.8 17 C3H, Balb/C, B6 <= 12周 0.5 13 NOD, NOR, NON > 12周 0.8 17 NOD, NOR, NON <= 12周 0.5 17 - 将2 ml胶原酶溶液分装至每个玻璃小瓶中，并置于冰上。每支5 ml注射器中加入3 ml胶原酶溶液，安装30G针头后置于冰上（在生物安全柜中准备）。
扩张
- 解剖前，通过颈椎脱位法处死实验动物。用70%乙醇喷洒整个动物体表，使其完全湿润。从生殖器区域开始做V形切口。旋转小鼠，使其尾部背向操作者。
- 将肠管移至打开的小鼠体腔左侧，以暴露胰腺和胆总管。
- 在胆管汇入的小肠两侧放置止血钳夹，留出一个小囊袋，以便胶原酶溶液进入肠腔。
- 使用装有3 ml冷胶原酶溶液的5 ml注射器和30号针头，从胆囊开始，经胆总管向胰腺内注射以使其膨胀。
- 将胰腺从体内取出，并置于含有2 ml胶原酶溶液的硅化玻璃小瓶中。此步骤应迅速完成，并尽可能保持洁净，尽量减少脂肪和结缔组织的混入。
- 将小瓶置于冰上，并对下一只小鼠重复步骤3。
消化
- 密封每个小瓶，并将其放入37°C水浴中，孵育13-17分钟（时间根据菌株和动物年龄有所不同）。
- 孵育结束后，剧烈振荡小瓶，胰腺组织应自行解离。
- 将每份消化液通过一个大型无菌水槽滤网倒入无菌的1000 ml烧杯中，并用洗涤缓冲液强力冲洗滤网。将消化液分装至50 ml离心管中（每管含3个胰腺组织：若n=12，则使用足量洗涤缓冲液使最终体积达到200 ml，并分装至4个50 ml离心管中）。稀释操作必须迅速并在冰上进行，以避免胰岛过度消化。
- 离心：启动离心机，当转速达到1300 rpm时，关闭离心机。
- 吸除上清液，保留约5 mL。注意切勿吸走沉淀物。
- 用手剧烈轻敲管壁使沉淀重悬，然后加入50 ml洗涤缓冲液。
- 离心：启动离心机，当转速达到1300 rpm时，关闭离心机。
- 将沉淀重悬，并用5 ml洗涤缓冲液洗涤。
- 将5 ml液体转移至15 ml离心管中，按上述方法进行离心。
- 尽可能彻底地吸除上清液。（残留缓冲液可能导致Ficoll密度发生变化。）
Ficoll
请迅速操作。长期接触Ficoll对胰岛具有毒性。
- 在加入Ficoll之前，确保沉淀物已完全分散（未充分破碎的组织在Ficoll中难以重悬）。
- 用7 ml密度为1.108的Ficoll，通过剧烈涡旋重悬沉淀物。
- 按以下顺序，在每层Ficoll密度上依次叠加2 ml其余密度的溶液：1.096、1.069，然后是1.037。
- 在4°C条件下以1800 rpm离心15分钟，关闭刹车！
- 使用spoid（无菌塑料滴管）从第二层中挑取胰岛。将所有收集物转移至含有约25 mL冷缓冲液的50 ml锥形管中。
- 如上所述，用洗涤缓冲液洗涤3次（重复步骤12–15）。
- 将胰岛重悬于20 ml RPMI-1640培养基中（含10% FCS、青霉素和链霉素、HEPES、MEM-NEAA），轻轻混匀。取100 µl样品用于计数。
- 将100 µl样品转移至含有1 ml培养基和1 ml二氮杂菲（dithizone）的35 mm网格培养皿中。
- 将剩余胰岛置于RPMI 1640培养基中，在37°C、7% CO2的培养箱中孵育，使用160 mm培养皿，每皿共加入30 ml培养基。
