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改良的 ES/OP9 共培养方案可更有效地表征造血后代

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DOI：

10.3791/2559

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2011年6月7日

 ,  , 
1Department of Medicine, Hematology-Oncology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

mStrawberry OP9 细胞可用于共培养体系中所有胚胎干细胞来源后代的完整评估。

摘要

的 体外 将胚胎干细胞向造血细胞命运分化在研究难以获取的细胞群体时具有重要应用价值 体内 并可用于鉴定参与造血过程的最早期基因，而无需处理胚胎致死性问题。ES/OP9 共培养系统最初设计用于生成造血祖细胞，同时避免巨噬细胞的过度产生，因为 OP9 基质细胞系来源于缺乏功能性 M-CSF 的骨硬化症突变小鼠的颅骨。 体外 ES/OP9 共培养系统可用于重现早期造血发育过程。当胚胎干细胞（ES细胞）在OP9基质细胞上培养时，可分化为Flk-1+血管生成母细胞、造血祖细胞，并最终生成成熟且终末分化的细胞谱系。标准的ES/OP9共培养方案包括将ES细胞接种于汇合的OP9细胞层上，并通过周期性重铺板步骤以清除陈旧且具有污染性的OP9细胞。此外，现有方案通常仅评估悬浮状态下的造血细胞，而未针对分化过程中每一天的ES细胞衍生物进行优化分析。然而，由于重铺板操作及仅收集悬浮细胞的方法，可能遗漏大量ES来源的子代细胞及正在发育的造血细胞。当需要表征与基因敲除ES细胞系相关的造血缺陷时，这一问题尤为关键。本文介绍一种改良的ES/mStrawberry OP9共培养方法，可有效去除下游实验中的污染性OP9细胞。该方法实现了对共培养各阶段所有ES来源子代细胞的全面评估，从而获得更直接对应胚胎内所观察到的造血分化模式的造血分化特征。

方案

1. ES 细胞的制备

  1. 根据您特定细胞系的标准方案培养 ES 细胞。确保准备足够的 ES 细胞，用于在第 0 天接种到 mStrawberry OP9 细胞上（第 0 天接种密度为每平方厘米 1×103 个细胞）

2. OP9 细胞的制备

  1. 在培养mStrawberry OP9细胞之前，先准备好OP9生长培养基
    OP-9 细胞培养基
     储备液最终浓度体积（mL）
    aMEM  39.5
    FBS（经OP-9测试）100%20%10
    L-谷氨酰胺100倍（200 mM）2 mM0.5
       50 mL

    4°C 下保存°C，并在配制后一周内使用
  2. 为维持mStrawberry OP9细胞的生长，需每2天更换一次培养基，并在细胞达到汇合前进行传代（传代时细胞汇合度应为70–90%）。mStrawberry OP9细胞培养物的汇合度绝不能超过90%，否则将导致其分化为脂肪细胞。参见图3。
    1. 用 PBS 洗涤细胞 2 次进行细胞传代（或先用 PBS 洗涤 1 次，再用 0.1% 胰蛋白酶-EDTA 洗涤 1 次）
    2. 添加 预热的 0.1% 胰蛋白酶-EDTA，37℃°在 C 条件下孵育 5 分钟（或直至细胞脱落）
    3. 当细胞脱落后，加入OP-9生长培养基。将细胞转移至50 mL锥形管中。
    4. 在室温下以300 × g离心5分钟，收集细胞。 弃去上清液。
    5. 在新鲜的 mStrawberry OP9 生长培养基中重悬细胞
    6. 以不低于每平方厘米10个细胞的密度接种4细胞/厘米²2
    7. 从实验第0天、第5天或第8/9天前3天开始，将mStrawberry OP9细胞培养至汇合状态，用于与胚胎干细胞共培养

3. ES/mStrawberry OP9 共培养

  1. 配制共培养分化培养基
     储备液终浓度体积 (mL)
    aMEM  39.5
    FBS100%20%10
    L-谷氨酰胺200 mM2 mM0.5
       50 mL
  2. mStrawberry OP9 细胞（第 –3 天）
    1. 务必在第 -3 天传代培养 mStrawberry OP9 细胞，以确保在共培养第 0 天时获得融合的 mStrawberry OP9 细胞层。参见图 4b。将 mStrawberry OP9 细胞以 1×104/cm2 的密度接种，以实现在第 0 天达到融合状态。务必额外传代培养部分细胞，用于第 5 天及第 8/9 天继续共培养。
  3. ES/mStrawberry OP9 共培养体系建立（第 0 天）
    1. 用 PBS 洗涤 ES 细胞 2 次
    2. 使用预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 ES 细胞，在 37°C 下孵育 5 分钟
    3. 向细胞中加入共培养分化培养基
    4. 在室温下以 400×g 离心 5–7 分钟，收集细胞沉淀，弃去上清液
    5. 用共培养分化培养基重悬细胞
    6. 移除 mStrawberry OP9 细胞中的培养基
    7. 向 mStrawberry OP9 培养瓶中加入共培养分化培养基
    8. 以 1×103 ES 细胞/cm2 的密度将 ES 细胞接种至 mStrawberry OP9 培养瓶中。将细胞置于 37°C、5% CO2 及适宜湿度条件下培养。
  4. mStrawberry OP9 细胞（第 2 天）
    1. 传代培养 mStrawberry OP9 细胞，以确保在共培养第 5 天时获得融合的 mStrawberry OP9 细胞层。将 mStrawberry OP9 细胞以 1×104/cm2 的密度接种，以实现在第 5 天达到融合状态（同步骤 3.2）。如有需要，务必额外传代培养部分细胞用于第 8/9 天（同步骤 2.2）。
  5. ES/mStrawberry OP9 共培养（第 3 天）
    1. 小心移除共培养体系中的培养基，并更换为新鲜的共培养分化培养基


  6. ES/mStrawberry OP9 共培养（第 5 天）
    1. 用 PBS 小心洗涤共培养体系 2 次
    2. 使用预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞
    3. 用共培养分化培养基将细胞从培养瓶中冲洗下来
    4. 在室温下以 400×g 离心 7 分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液
    5. 向细胞中加入共培养分化培养基。 使用 21 号钝头针重悬细胞，确保形成单细胞悬液
    6. 使用血细胞计数板计数细胞。ES 细胞数量应较第 0 天增加 100–150 倍。
    7. 将 6.48×104/cm2 至 7.76×104/cm2 的共培养细胞重新接种至一层新的融合状态的 mStrawberry OP9 细胞上
    8. 第 5 天检测——剩余的共培养细胞可用于流式细胞术分析、细胞涂片（30,000 个细胞）、ChIP 检测等。
  7. ES/mStrawberry OP9 共培养（第 8/9 天和第 12 天）
    1. 移除培养瓶中的分化培养基并保存。用 PBS 洗涤单层细胞一次，以去除悬浮的造血细胞。切勿丢弃悬浮的造血细胞。
    2. 使用预热的0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化贴壁细胞
    3. 用 ES 分化培养基将细胞从培养瓶中冲洗下来，并加入之前收集的悬浮造血细胞中=
    4. 在室温下以 400×g 离心 7 分钟，收集细胞沉淀。弃去上清液
    5. 向细胞中加入共培养分化培养基或 PBS。 使用 21 号钝头针重悬细胞，确保形成单细胞悬液，然后使用血细胞计数板计数细胞。
    6. 共培养可延续至第 14 天，通过在第 8 或第 9 天将共培养细胞重新接种至一层新的融合状态的 mStrawberry OP9 细胞上，并在第 12 天再次传代，以评估更成熟的造血祖细胞。根据检测当天所需的细胞回收量，重新接种优化后的细胞数量。
  8. ES 来源子代细胞的评估（第 1–14 天）。可在共培养的任意一天通过流式分选 mStrawberry 阴性细胞（ES 来源子代细胞）来评估其特性。
    1. 移除培养瓶中的分化培养基并保存。用 PBS 洗涤单层细胞一次，以去除悬浮的造血细胞。切勿丢弃悬浮的造血细胞。
    2. 使用预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化贴壁细胞
    3. 用共培养分化培养基将细胞从培养瓶中冲洗下来，并加入之前收集的悬浮造血细胞中
    4. 在室温下以 400×g 离心 7 分钟，收集细胞沉淀，弃去上清液
    5. 使用 21 号钝头针重悬细胞并进行计数
    6. ES 来源子代细胞（mStrawberry 阴性细胞）可从 mStrawberry 阳性的 OP9 细胞中通过流式分选获得。随后可通过流式细胞术分析、细胞涂片、ChIP 检测等方法对 ES 来源子代细胞进行表征。

4. 代表性结果：

figure-protocol-1
图1. ES/mStrawberry OP9 共培养系统 我们的实验室使用一种 体外 ES细胞共培养系统模拟造血发育。在此共培养系统中，ES细胞在第5天分化为成血管细胞，此时将其接种于汇合的mStrawberry OP9细胞层上。随着共培养的进行，第8天出现造血前体细胞，至第14天则出现终末分化的造血细胞系。箭头指示ES细胞分化后代需传代至新的汇合mStrawberry OP9细胞层的分化时间点。

figure-protocol-2
图2. 胚胎干细胞的正常分化。在第0天，将胚胎干细胞接种至融合的mStrawberry OP9细胞层上。在分化第3天，可开始观察到胚胎干细胞来源的子代细胞，表现为具有明确边界的细胞簇，或开始形成漩涡状结构。在第5天，应可见作为内皮细胞和造血细胞共同中胚层前体的成血管母细胞，表现为堆积成漩涡状的细胞团。当共培养时间超过五天时，胚胎干细胞来源的子代细胞应表现为造血细胞簇。在共培养第6至7天，应出现由两到四个细胞组成的细胞簇，并在第8至9天逐渐发育为更大的细胞簇。其他胚胎干细胞来源的子代细胞也紧密附着于贴壁的基质细胞层上。

figure-protocol-3
图3. 胚胎干细胞分化失败。 本共培养结果反映了胚胎干细胞分化异常。请注意，在第5天时，源自胚胎干细胞的后代细胞未呈现漩涡状排列。缺乏漩涡状排列的细胞表明血-血管母细胞形成异常。若血-血管母细胞不能正常发育，则继续共培养将导致造血谱系分化受阻。此类血-血管母细胞形成异常的共培养体系应予以弃用。

figure-protocol-4
图 4. mStrawberry OP9 细胞培养。（A）mStrawberry OP9 细胞在 70–90% 汇合度时进行传代培养。（B）为实现有效分化，将 ES 细胞及 ES 细胞衍生的后代细胞接种至过度汇合的 mStrawberry OP9 细胞层上。

figure-protocol-5
图5. 典型的ES/mStrawberry OP9共培养流式图谱。 所有由ES细胞衍生的子代细胞均为mStrawberry阴性细胞，可从表达mStrawberry的OP9细胞中通过流式分选获得。mStrawberry阴性细胞门控范围是通过传统的ES/OP9共培养体系确定的。

讨论

在融合的mStrawberry OP9细胞层上，胚胎干细胞（ES细胞）的适当分化可在共培养第5天产生Flk1+血管生成样细胞。血管生成样细胞应呈现为成堆的细胞漩涡状结构，如图1所示。在后续共培养过程中，可见的ES细胞来源后代应表现为造血细胞簇（图1）。在共培养第6/7天，应出现2至4个细胞簇，并在第8/9天发展为更大的细胞簇（包括贴壁生长和悬浮生长的细胞簇）。其他ES细胞来源的后代也紧密地存在于贴壁的基质细胞层内。

尽管方案中未列出，但对胚胎干细胞（ES）生长培养基、mStrawberry OP9 生长培养基以及 ES/mStrawberry OP9 分化培养基中所用的胎牛血清（FBS）进行预测试至关重要。经过适当测试的血清应能确保 mStrawberry OP9 细胞的正常生长，以及在共培养条件下胚胎干细胞直至分化第5天的正常分化。作为 mStrawberry OP9 细胞的替代或补充，OP9 细胞可在达到汇合度（7.8×104 个细胞/cm2）接种前接受 8000 rads 的照射。对 OP9 细胞进行照射可避免重复传代操作，并几乎完全消除下游实验中残留的污染性旧 OP9 细胞。

通过使用含有CMV启动子调控的mStrawberry基因的慢病毒载体（pRRLsin-CMV载体，UCLA病毒核心实验室）对OP9细胞进行转导，使OP9细胞被改造为表达mStrawberry蛋白，转导时病毒载体浓度为3 µg/mL。

标准的ES/OP9共培养方案包括将ES细胞接种至融合的OP9细胞层上，并在第5天进行重新接种，以减少传代过程中残留的老旧污染性OP9细胞。此外，仅收集悬浮状态的造血细胞用于评估ES细胞分化的子代细胞。然而，由于存在重新接种步骤且仅收获悬浮细胞，可能会遗漏大量正在发育的ES来源造血细胞。当需要表征与基因敲除ES细胞系相关的造血缺陷时，这一问题尤为关键。为克服此局限，本实验室采用了一种改良的共培养方法，即使用表达mStrawberry的OP9细胞。该方法可确保在第5天将所有ES来源的子代细胞转移至后续共培养体系，并在后续实验中收获全部ES来源的子代细胞。这一改进为评估和表征人和小鼠ES细胞系来源的造血前体细胞提供了有力工具。

该ES-mStrawberry OP9共培养模型可重现原始和定型造血过程的各个阶段。在研究造血发育的最早阶段时，许多人使用BL-CFC（类胚体集落形成细胞）检测法，以评估从胚胎干细胞发育而来的血管成血细胞。尽管BL-CFC检测法在研究早期造血发育过程中是一种有用的工具，但mStrawberry-ES共培养系统具有更高的应用价值，因为它不仅可以评估血管成血细胞，还能评估更接近成体的造血细胞谱系。

既往研究采用传统的OP9/ES和EB分化方案表明，可能需要额外因子（例如HoxB4的过表达）才能在体外获得具有长期重建造血功能的造血干细胞。in vitro。尚需进一步研究以评估经分选的mStrawberry阴性ES来源细胞群体中是否含有真正的造血干细胞。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们感谢 U. Ganapati 在建立和测试 mStrawberry OP9 细胞系方面所做的工作。此外，我们感谢 H. Shafifor 在共培养实验中的协助。H.P. 获得了美国国家心肺血液研究所（F31HL087714）提供的博士前奖学金支持（H.P.）。本研究内容仅由作者负责，不一定代表美国国家心肺血液研究所或美国国立卫生研究院（NIH）的官方观点。加州大学洛杉矶分校（UCLA）流式细胞术核心设施得到了 NIH（CA-16042 和 AI-28697）、Jonsson 癌症研究中心、UCLA 艾滋病研究所以及 UCLA 医学院的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
OP-9 细胞维持培养基储备成分
aMEMInvitrogen12571-063
FBSOmega ScientificFB01预测试
L-谷氨酰胺Cellgro25-005-C I200nM
胰蛋白酶-EDTAStem Cell Technologies07901
ES/OP-9 细胞分化培养基储备成分
aMEMInvitrogen12571-063
FBSHycloneSH30070预测试
L-谷氨酰胺Cellgro25-005-CI200mM
PBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+）Cellgro21-031-CV
胰蛋白酶-EDTAStem Cell Technologies07901

参考文献

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标签

M OP9 Flk 1

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