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小鼠眼球解剖以制备视网膜色素上皮全层铺片

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DOI：

10.3791/2563

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2011年2月27日

 , 
1UT Health Science Center at San Antonio, Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology

本文内容

摘要

小鼠眼球解剖的正式演示，最终获得视网膜色素上皮的完整铺片。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）位于哺乳动物眼球后部，紧邻含有感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）的神经视网膜下方。RPE由一层单层的色素性立方细胞构成，与其上方的神经视网膜紧密相连。这种密切关联使RPE成为研究视网膜疾病的研究人员高度关注的对象。RPE也是某些眼部疾病的发病部位 体内 同源定向DNA修复检测，该 p未 检测。由于小鼠眼球尺寸较小（直径约3.5 mm）且呈球形，解剖难度较大。本文详细演示了一种解剖小鼠眼球以制备视网膜色素上皮（RPE）整体装片的实验步骤。在此方法中，我们展示了如何利用而非对抗眼球的球形结构进行操作。简要而言，首先去除眼球后部的结缔组织、肌肉和视神经；随后移除角膜和晶状体；接着进行若干关键切口，使剩余组织显著展平；最后轻柔剥离神经视网膜，暴露出完整保留的RPE，后者仍附着于脉络膜和巩膜之上。该整体装片可用于后续 p未 用于RPE组织的检测、免疫组织化学或免疫荧光评估。

方案

1. 去除眼球外部的多余组织

  1. 将1×PBS倒入35 mm培养皿的皿盖中，液面应略低于皿盖边缘。
  2. 使用直头镊子将眼球从储存管转移至35 mm培养皿中。眼球浸入PBS中有两个原因：1. 多余组织会“漂浮”离开眼球，便于观察和清除；2. 在解剖过程中，眼球在悬浮状态下能自然维持其球形结构，使操作顺应其形态而非对抗。
  3. 使用两把弯头镊子（45°和15°），尽可能轻柔地去除肌肉和结缔组织，撕扯方向应逆着组织纹理（即朝向角膜方向）。部分结缔组织可能仍会残留。操作中应尽量减少对眼球的挤压。
  4. 将15°镊子换为弹簧剪。用45°镊子固定眼球的同时，使用弹簧剪剪除残留的肌肉和结缔组织，以及视神经。*提示：用剪刀外侧边缘将组织推向纹理反方向（即朝向角膜-巩膜交界处），然后修剪。重复操作直至眼球上所有多余组织被完全清除。

2. 去除角膜和晶状体

  1. 角膜朝上，用45°镊子在角膜中央夹起一个小褶皱。
  2. 使用弹簧剪在瓣膜基部做一个小切口，然后松开瓣膜。
  3. 用镊子固定眼球，将剪刀的下刃垂直插入切口，并向角膜-巩膜交界处方向剪开。尽量使下剪刀刃位于虹膜下方，以同时剪开角膜和虹膜。注意不要一直剪到角膜-巩膜交界处。保持剪刀插入眼内。
  4. 用45°镊子小心旋转眼球，使剪刀与角膜-巩膜交界平行，进行小切口。缓慢旋转眼球360°，沿周围连续做小切口。同样，尽量保持弹簧剪的下刃在虹膜下方，以同时剪开虹膜和角膜。将虹膜和角膜从眼球其余部分上掀起并弃去。
  5. 将眼球侧向倾斜，轻轻按压眼球后半部分，使晶状体挤出，弃去晶状体。剩余眼杯的内壁由神经视网膜衬覆，应呈现光滑且不透明的外观。

3. 将所得的眼杯分为四等份，形成一个具有4个“花瓣”的花状结构

  1. 应将眼睛放置成使角膜杯开口与身体垂直。使用45°镊子固定并调整角膜杯的位置。
  2. 将弹簧剪刀持于身前，使其与身体垂直，将剪刀的下刃插入打开的眼杯顶部边缘。使用45°镊子仔细对齐眼杯，以便从角膜-巩膜分界处向视神经乳头进行一次单一、笔直的切割。所有切割均应垂直于角膜-巩膜分界，除非另有说明，切割应尽可能接近视神经乳头，但不得切入其中。
  3. 将眼杯旋转180°，同时保持其与身体的垂直关系。采用步骤3.2中的技术进行第二次垂直切割。
  4. 继续旋转眼杯，并重复步骤3.2中所述技术，再进行两次切割。四次切割应尽可能相互间隔约90°。需注意，眼球并非完全球形，因此存在一定变异。

4. 将四个“花瓣”中的每一个均切成两半，形成一个具有八个花瓣的类似花朵的结构

  1. 将四等分的眼杯从35 mm培养皿转移至干净的载玻片上。使眼杯朝上，用45°角的镊子从其下方轻轻托起，小心地将其从液体中取出，并放置在干净的载玻片上。
  2. 使用两对角镊子，轻轻展开眼球，使神经视网膜朝上。切勿移除神经视网膜——它有助于维持眼球的部分球形结构，避免操作时对抗其自然形态。此外，在后续操作中，它还能保护视网膜色素上皮（RPE）免受意外损伤。
  3. 旋转载玻片，使其中一个瓣片与身体方向垂直。
  4. 使用15°角的镊子，轻轻夹住瓣片的一角。该角应为角膜部分，而非神经视网膜或视网膜色素上皮。轻柔地提起该角，使其保持原有的曲率。
  5. 将弹簧剪刀的下部刀片插入瓣片与载玻片之间。调整剪刀位置，使其能够从角膜-巩膜分界处向视神经乳头进行一次单一、笔直且垂直的切割。尽可能靠近视神经乳头切割，但切勿切入其中。松开瓣片，使其平躺在载玻片上。
  6. 将载玻片旋转90°，使下一个瓣片与身体方向垂直。重复步骤4.5。
  7. 再重复两次步骤4.5和4.6。最终结构应呈现为一个八瓣花状。

5. 去除神经视网膜

  1. 用移液器将 100–200 μL 的 1× PBS 加入样本中。这可以防止在剥离神经视网膜时其粘附于视网膜色素上皮（RPE）。
  2. 通常情况下，神经视网膜与视网膜色素上皮（RPE）的连接较为疏松。然而，仅去除神经视网膜而不损伤 RPE 需要一定的练习和技巧。用一对弯头镊子轻轻夹住神经视网膜的一片边缘，同时用另一对弯头镊子固定（压住）眼球其余部分以保持稳定，然后将神经视网膜从眼球其余部分上轻轻拉开。重复此操作，直至整个神经视网膜被完全移除。*提示：可将 15° 镊子的尖端插入视神经乳头以固定眼球，再用 45° 镊子从神经视网膜下方扫过并将其掀起移除。通常建议从视神经乳头向角膜-巩膜分界处方向进行剥离。务必清除虹膜残留的松散组织，因为虹膜具有较强黏性，否则可能粘附于 RPE 上。
  3. 用 1× PBS 冲洗样本。向样本中加入 100–200 μL 的 1× PBS，随后吸出并弃去。根据需要重复操作，以去除灰尘和碎屑。

6. 将样本装载到载玻片上

  1. 用移液器吸取80-90 μL的90%甘油，滴加到新载玻片上，呈矩形。用移液器吸头的侧面将甘油均匀涂抹成矩形。（此操作适用于在同一张载玻片上封片两个RPE样本。）
  2. 将15°镊子的下臂插入样本下方，轻轻将样本从解剖载片上提起。
  3. 缓慢将样本放入甘油中。在将镊子从样本下方抽出时，轻轻晃动镊子。
  4. 对另一个样本重复步骤6.1–6.3。
  5. 旋转载玻片，使其长边与身体垂直。将盖玻片以45°角接触载玻片，并向甘油涂抹区域移动，直至两者接触。保持盖玻片与载玻片的接触，缓慢将盖玻片从涂抹区域移向载玻片边缘。使载玻片和盖玻片的长边对齐并保持平行。用拇指和食指捏住盖玻片的两个角。
  6. 用另一只手拿起15°镊子，将盖玻片上端（自由）边缘托在镊子弯曲处。非常缓慢地降低盖玻片。当盖玻片接触到甘油时，停止动作并等待甘油缓慢扩散。重复此“下降—等待”过程，直至RPE整体封片完全被覆盖。此操作旨在防止高黏度甘油裹入气泡。切勿按压盖玻片——否则甘油会从下方挤出，导致粘附效果极差。
  7. 用透明指甲油沿盖玻片与载玻片接触的边缘涂抹一圈密封。
  8. 将载玻片置于空支架上方，静置干燥。

7. 代表性结果：

该操作的结果应得到一个形似花朵且具有较好对称性的结构。

figure-protocol-1
图1. 野生型C67Bl/6J小鼠的完整眼底色素上皮（RPE）标本。 来自黑色或野鼠色动物的RPE应呈深棕色，表面应光滑。花瓣状结构的表面出现轻微起伏是正常现象。由于RPE及其下方脉络膜的色素密度存在差异，不同标本之间的色素沉着程度可能略有变化。白色箭头指示色素减少的“通道”，这是正常现象，由眼球下方的血管结构所致。蓝色箭头指示RPE及其下方脉络膜的物理性损伤。

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图2. 来自稀释型小鼠的完整眼底色素上皮。 从稀释型动物获取的标本颜色可从近乎透明到咖啡奶色不等，且单个标本内部通常存在色素分布差异，此处以黑色圆圈标示。总体而言，从较年轻动物获取的RPE颜色较浅，而从较年老动物获取的RPE颜色较深。黑色箭头指示部分下方的脉管结构，表现为色素减退。

figure-protocol-3
图3. 鬼笔环肽染色可用于检测视网膜色素上皮（RPE）的物理损伤。鬼笔环肽染色可清晰勾勒出细胞膜，显示上皮细胞的六边形形态。（A）来自黑鼠的示例。（B）来自稀释毛色小鼠的示例。

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图4. 来自一只稀释型小鼠的分离效果较差的视网膜色素上皮（RPE）。（A）括号标示了过宽的角膜边缘，可能导致组织起皱或折叠。黑色圆圈内可见眼后部未被清除的过量多余组织。由于样本来自一只稀释型动物，这些组织尤为明显。左下角的瓣片部分发生了折叠。（B）该整体装片呈现出风车状外观。黑色箭头指示了部分已做的切口。许多从角膜-巩膜分界处朝向视神经乳头的切口未与直径对齐。（C）黑色箭头指示切口本应如何制作：应与直径对齐，并垂直于切线方向。

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讨论

视网膜色素上皮（RPE）是pun检测的位点，该检测是一种用于检测同源定向修复的活体in vivo实验方法。pun检测已被用于研究不同DNA损伤1,2以及DNA损伤信号传导和修复相关基因3,4,5对同源定向修复频率的影响。该检测方法具有高度敏感性，可检测RPE上单个细胞水平的修复事件1，并能检测发育过程中同源定向修复事件在时间上的差异6。小鼠眼球从视神经开始呈放射状向外发育7，因此，修复事件与视神经乳头之间的相对距离可反映其发生的发育时间。

视网膜色素上皮（RPE）也受到研究视网膜发育或视网膜疾病学者的关注。尽管RPE细胞可以进行培养，但该过程存在显著局限性。成年RPE细胞为终末分化细胞，不再进行有丝分裂。7 且可预见地无法良好增殖 体外此外，那些能够生长的培养物也表现出多种改变，包括但不限于色素沉着、形态以及细胞连接的变化。8...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作由环境卫生科学国家研究所 [K22ES012264 至 A.J.R.B.] 和美国癌症协会机构研究拨款 [ACS-IRG-00-173-04] 试点项目资助 [授予 A.J.R.B.]。我们还感谢 Bishop 实验室成员对稿件的审阅以及对视频提出的建议，特别感谢 Adam Brown 提供了反面示例。感谢 Greehey 儿童癌症研究所的 Donald McEwen 博士允许我们使用其解剖显微镜/摄像系统拍摄解剖视频。感谢 Corte Instruments 的 Daron Brown 对我们的显微解剖工具进行修磨和维护。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
直镊Roboz Surgical Instruments Co.RS-4903尖端：0.08 × 0.04 mm，材质：INOX
45° 镊子Roboz Surgical Instruments Co.RS-5005尖端：0.05 × 0.01 mm，材质：INOX
15° "上弯" 镊子Roboz Surgical Instruments Co.RS-5045A尖端：0.1 × 0.06 mm，材质：INOX
弹簧剪Roboz Surgical Instruments Co.RS-5604组合式尖端宽度 0.3 mm，刃口长度 3 mm，材质：不锈钢
双目解剖显微镜Carl Zeiss, Inc.Discovery V.8使用反射光源
鬼笔环肽InvitrogenA22283Alexa Fluor 546

参考文献

  1. Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice. Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).
  2. Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice. Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).
  3. Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice. Cancer Res. 60, 395-399 (2000).
  4. Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion. J. Nucleic Acids. , (2010).
  5. Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo. Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).
  6. Bishop, A. J. p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development. Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).
  7. Bodenstein, L., Sidman, R. L. Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity. Dev Biol. 121, 192-204 (1987).
  8. Burke, J. M. Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt? Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).

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