小鼠眼球解剖以制备视网膜色素上皮全层铺片

摘要

小鼠眼球解剖的正式演示，最终获得视网膜色素上皮的完整铺片。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）位于哺乳动物眼球后部，紧邻含有感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）的神经视网膜下方。RPE由一层单层的色素性立方细胞构成，与其上方的神经视网膜紧密相连。这种密切关联使RPE成为研究视网膜疾病的研究人员高度关注的对象。RPE也是某些眼部疾病的发病部位 体内 同源定向DNA修复检测，该 p^未 检测。由于小鼠眼球尺寸较小（直径约3.5 mm）且呈球形，解剖难度较大。本文详细演示了一种解剖小鼠眼球以制备视网膜色素上皮（RPE）整体装片的实验步骤。在此方法中，我们展示了如何利用而非对抗眼球的球形结构进行操作。简要而言，首先去除眼球后部的结缔组织、肌肉和视神经；随后移除角膜和晶状体；接着进行若干关键切口，使剩余组织显著展平；最后轻柔剥离神经视网膜，暴露出完整保留的RPE，后者仍附着于脉络膜和巩膜之上。该整体装片可用于后续 p^未 用于RPE组织的检测、免疫组织化学或免疫荧光评估。

方案

1. 去除眼球外部的多余组织

1. 将1× PBS倒入35 mm培养皿的皿盖中，液面应略低于皿盖边缘。
2. 使用直头镊子将眼球从储存管转移至35 mm培养皿中。眼球浸入PBS中有两个原因：1. 多余组织会“漂浮”离开眼球，便于观察和清除；2. 在解剖过程中，眼球在悬浮状态下能自然维持其球形结构，使操作顺应其形态而非对抗。
3. 使用两把弯头镊子（45°和15°），尽可能轻柔地去除肌肉和结缔组织，撕扯方向应逆着组织纹理（即朝向角膜方向）。部分结缔组织可能仍会残留。操作中应尽量减少对眼球的挤压。
4. 将15°镊子换为弹簧剪。用45°镊子固定眼球，同时使用弹簧剪剪除残留的肌肉和结缔组织，以及视神经。*提示：用剪刀外侧边缘将组织逆纹理方向（朝向角膜-巩膜交界处）推挤，然后修剪。重复操作直至眼球上所有多余组织被完全清除。

2. 去除角膜和晶状体

1. 角膜朝上，用45°镊子在角膜中央夹起一个小褶皱。
2. 使用弹簧剪在褶皱基部做一小切口，然后松开褶皱。
3. 用镊子固定眼球，将剪刀的下刃垂直插入切口，并向角膜-巩膜交界处方向剪开。尽量使下剪刀刃位于虹膜下方，以同时剪开角膜和虹膜。注意不要一直剪到角膜-巩膜交界处。保持剪刀插入眼内。
4. 用45°镊子小心旋转眼球，使剪刀与角膜-巩膜交界平行，进行小切口。缓慢旋转眼球360°，沿周围连续做小切口。同样，....

讨论

视网膜色素上皮（RPE）是p^un检测的位点，该检测是一种用于检测同源定向修复的活体in vivo实验方法。p^un检测已被用于研究不同DNA损伤^1,2以及DNA损伤信号传导和修复相关基因^3,4,5对同源定向修复频率的影响。该检测方法具有高度敏感性，可检测RPE上单个细胞水平的修复事件¹，并能检测发育过程中同源定向修复事件在时间上的差异⁶。小鼠眼球从视神经开始呈放射状向外发育⁷，因此，修复事件与视神经乳头之间的相对距离可反映其发生的发育时间。

视网膜色素上皮（RPE）也受到研究视网膜发育或视网膜疾病学者的关注。尽管RPE细胞可以进行培养，但该过程存在显著局限性。成年RPE细胞为终末分化细胞，不再进行有丝分裂。⁷ 且可预见地无法良好增殖 体外此外，那些能够生长的培养物也表现出多种改变，包括但不限于色素沉着、形态以及细胞连接的变化。^8.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
直镊	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4903	尖端：0.08 × 0.04 mm，材质：INOX
45° 镊子	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	尖端：0.05 × 0.01 mm，材质：INOX
15° "上弯" 镊子	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045A	尖端：0.1 × 0.06 mm，材质：INOX
弹簧剪	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5604	组合式尖端宽度 0.3 mm，刃口长度 3 mm，材质：不锈钢
双目解剖显微镜	Carl Zeiss, Inc.	Discovery V.8	使用反射光源
鬼笔环肽	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546