本方法描述了小脑类器官培养物的制备，以及特定凋亡刺激对不同类型小脑细胞存活能力的影响。
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摘要
摘要
神经组织的器官型培养最初由 Hogue 于 1947 年提出1,2，是神经科学领域的一项重大突破。此后，该技术不断发展，目前已有多种不同的器官型培养制备方法。本文所采用的方法借鉴了 Stoppini et al. 描述的脑片制备技术以及 Gogolla et al. 描述的染色流程3,4。
该技术的一个独特之处在于，它能够以原始结构状态研究脑部不同区域，例如海马体或小脑，相较于细胞结构和神经元网络均被破坏的离体培养，具有显著优势。对于小脑而言，这一优势尤为突出，因为它使得浦肯野细胞的研究成为可能，而浦肯野细胞极难通过离体原代培养获得。该方法可用于研究小脑的某些发育特征 体外以及用于野生型和突变型小鼠的电生理学和药理学实验。
本文所述方法旨在利用TUNEL染色检测细胞凋亡，研究Fas配体等凋亡刺激因素对发育中小脑的影响。若将TUNEL染色与细胞类型特异性标记物（如针对浦肯野细胞的Calbindin）相结合，即可实现对特定细胞群体中细胞死亡的评估。此外，Calbindin染色还可用于评估小脑培养物的质量。
方案
1. 器官型小脑培养：
- 为成功建立脑切片器官型培养，应使用出生后0至3天（P0-P3）或8至12天（P8-P12）的小鼠。在本实验中，我们选用P8-P12阶段的小鼠，因为该发育时期更符合我们的研究需求。
- 准备解剖与培养用培养基：
- 脑组织解剖与切片制备需在低钠人工脑脊液（ACSF）中进行，其成分为：1 mM 氯化钙、10 mM D-葡萄糖、4 mM 氯化钾、5 mM 氯化镁、26 mM 碳酸氢钠、246 mM 蔗糖及酚红溶液（1:1000），pH值为7.3。为灭菌，需使用0.22 μm滤器过滤该溶液，并于4 °C保存。
- 小脑切片培养使用含75%最低必需培养基（MEM）、25%热灭活马血清、25 mM HEPES、1 mM 谷氨酰胺、5 mg/mL 葡萄糖、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL）的培养基。将培养基经0.22 μm滤器过滤后，于4 °C保存，最长不超过两周。
- 在预先用碳合气（95%氧气与5%二氧化碳）饱和的冰冻ACSF培养基中进行脑组织解剖。注意，碳合气饱和会导致溶液pH变化，颜色由红色变为橙色。解剖过程应尽可能迅速完成，同时注意避免损伤脑组织结构。
- 使用振动切片机将脑组织切成400 μm厚的矢状切片。
- 用剃刀在半脑上做一次矢状切口，尽量减少对小脑的切割，以提供一个平整的切面。皮层仅用于辅助固定以方便切片；但由于时间至关重要，更便捷的做法是用剃刀切除前脑半部。
- 使用氰基丙烯酸酯胶（万能胶）将脑组织固定在金属振动切片机载片板上。在涂抹胶水前，务必将载片板置于冰上冷却，并用胶管尖端将胶水均匀涂抹成薄层。若万能胶过多，当其接触ACSF时会从载片板上脱落，导致样本丢失。
- 脑组织固定后，加入足量ACSF培养基以浸没组织，并在载片板下方放置冰块以维持低温。
- 切取400 μm厚的切片，并使用塑料巴斯德移液管（将管口剪宽以避免损伤切片）将其转移至盛有冰冻ACSF的6孔细胞培养板中。
- 在解剖显微镜下，借助两支胰岛素注射器（带细径28号针头）将小脑与其他脑组织分离。部分切片边缘可能附着万能胶，此时应尝试小心去除，因其可能影响切片活性。操作时需谨慎，避免损伤小脑结构。
- 将小脑切片转移至含有30 mm、孔径0.4 μm培养插件的6孔板中。每孔加入1 mL已预温的培养基（在细胞培养箱中37°C、5% CO2条件下预孵至少2小时）。将插件置于培养基上方，确保其下方无气泡残留，再将小脑切片（每插件1–3片）放置于插件表面，确保切片完全展开且无液体覆盖。必要时吸除多余液体。将培养物置于37°C、5% CO2条件下培养，每2至3天更换一次培养基。建议每次仅更换部分培养基（例如1/2体积），因使用过的培养基中含有切片自身分泌的营养因子，对细胞存活至关重要。
2. 小脑切片的Fas处理与染色：
- 在凋亡刺激实验中，我们首先将脑片培养5天，并在第5天更换培养基 体外 3（DIV3）。在DIV5时对培养物进行处理 0.5 μg通过直接将Fas激动剂抗体Jo2加入培养基中，使其终浓度为/mL，以获得清晰的细胞死亡背景，因为换液可能在培养物中诱导部分细胞死亡。一半的孔不作处理，作为对照。
- 24小时后，用吸管吸去插入物下方的培养基。为固定脑片，在插入物下方和上方各加入1 mL冰冻的4%多聚甲醛（PFA），室温孵育10分钟。
- 10分钟后去除PFA，用冷PBS短暂清洗。
- 接着移除 PBS，向插入物下方和上方各加入 1 mL 含 20% 冰甲醇的 PBS，室温孵育 5 分钟。
- 用 PBS 再次洗涤，在插入物下方和上方各加入 1 mL 含 0.5% Triton-X-100 的 PBS 进行透化处理。于 4°C 孵育至少 12 小时 4°C.
- 透化后，在室温下用含20% BSA的PBS封闭至少4小时，或在4°C过夜 4°C此时，切片可在封闭液中于4°C保存至少3天。 4°C.
- 为了染色，小心地切下与小脑切片相连的膜插件部分，并将其转移至含有 PBS 的 24 孔板中。
- 免疫染色按顺序进行，先用TUNEL试剂孵育一小时，然后用Calbindin抗体过夜孵育。
- 吸去 PBS，然后加入 250 μL 将TUNEL试剂加入每个孔中，确保完全覆盖切片表面。在 37°C 在暗处孵育一小时。
- 1小时后移除TUNEL反应液，用PBS洗涤3次，每次10分钟。
- 最后一次洗涤后，移除 PBS 并加入 250 μL PBS 中 1/1000 稀释的 Calbindin 抗体，4℃孵育过夜 4°C 在暗处。
- 移除一抗溶液，用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
- 添加 250 μL 用 PBS 以 1:500 稀释二抗，室温避光孵育至少 3 小时。我们使用的 TUNEL 试剂盒标记为 TMR red，因此 Calbindin 的二抗偶联了 Alexa-488。
- 用 PBS 洗涤三次，每次 10 分钟，然后使用含 DAPI 的封片剂将切片封固于玻璃显微镜载片上。
- 使用共聚焦显微镜对切片进行成像，Calbindin 采用 488 nm 激发波长，TUNEL 采用 561 nm 激发波长。
3. 代表性结果：
本方案的主要挑战在于能够制备出健康的 cerebellar slice cultures，尤其是因为我们的最终检测指标是细胞死亡。健康的培养物表现为细胞层呈半透明状，在显微镜下可清晰观察到小脑的叶状结构（图1）。培养数天后，组织切片会逐渐变薄，并可见非神经元细胞从切片边缘迁移出去。培养数天后出现在切片表面的深色圆形细胞（很可能是巨噬细胞），其数量在10至14天后将逐渐减少 体外 （图2） 5切片活性的最终验证是通过不同细胞标志物染色，例如用Calbindin标记浦肯野细胞。图3显示了浦肯野细胞层的代表性共聚焦显微镜图像，其中可见多个TUNEL阳性细胞核。
需要考虑到，即使某些切片接受了凋亡刺激，其暴露时间也仅为24小时。这足以通过TUNEL染色观察到死亡细胞中的DNA片段化，但颗粒细胞层仍然清晰存在。
图1. DIV2时期的健康小脑切片。 该图像显示了健康切片中透明的细胞体层和小脑的叶状结构。
图2. 体外培养第7天的健康小脑切片。 在该图像中，仍可观察到小脑的叶状结构以及深色细胞体的出现。
图3. 经Fas处理的小脑切片代表性图像。 该共聚焦图像显示用Calbindin（绿色）染色的浦肯野细胞以及TUNEL染色阳性的凋亡细胞（红色）。浦肯野细胞并非呈单行排列，而是聚集成类似小叶的结构。
讨论
该方法描述了神经元器官型培养的多种可能应用之一，使我们能够研究凋亡刺激对野生型和突变型小脑切片的影响。
本实验最关键的步骤是能够稳定地制备出健康的的小脑脑片培养。关键因素包括解剖和切片技术，以及在尽可能短的时间内完成操作流程，同时需小心避免损伤脑片。另一个至关重要的因素是培养基的配制与成分，这类培养物非常敏感，因此我们必须测试多种培养基配方和品牌。甚至血清或其他培养基组分的不同批次都可能影响脑片的存活率。我们使用Invitrogen公司批号为#480116的马血清时获得了最佳结果。
一旦制备出小脑切片，即可用于研究小脑的发育、电生理特性、细胞存活情况，以及在凋亡刺激、兴奋性毒性或缺氧条件下的细胞反应。利用野生型和突变型小脑切片进行的比较研究，在小脑功能与发育的诸多方面已取得了富有启发性的成果。
披露
所有动物实验均按照美国实验动物管理评估和认可委员会（IACUC）制定的政策进行。索尔克研究所是一家获得AAALAC认证的机构。
致谢
本研究部分由IPSEN基金会资助。IMV是美国癌症协会分子生物学教授，并担任欧文和琼·雅各布斯卓越生命科学讲席教授。本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）、Leducq基金会、Merieux基金会、Ellison医学基金会、Ipsen/Biomeasure公司、赛诺菲安万特公司、前列腺癌基金会以及H.N.和弗朗西斯·C.贝格尔基金会的资助。PAS由麦克奈特神经科学捐赠基金和美国国家药物滥用研究所（R01 DA019022）提供资助。作者谨此感谢Mark Schmitt。图形设计由Jamie T. Simon完成。赞助由Invitrogen公司慷慨提供。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| 马血清 | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| 谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140 | |
| 超级胶水 | Krazy Glue | ||
| 6孔/24孔细胞培养板 | Corning | 3506/3527 | |
| 30 mm 培养板插件（0.4-μm 孔径） | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 纯化的NA/LE仓鼠抗小鼠CD95（Jo2） | BD Biosciences | 554254 | |
| 原位细胞死亡检测试剂盒，TMR红 | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| 兔抗钙结合蛋白D-28k抗体 | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-山羊抗兔IgG二抗 | Invitrogen | A-11008 | |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 解剖显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 振动切片机 | Leica Microsystems | ||
| 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems |
参考文献
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
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