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离体骨骼肌的肌-机械分析

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DOI：

10.3791/2582

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2011年2月22日

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1Cardiovascular Research Institute, University of California San Francisco, 2Department of Pediatrics, University of California San Francisco, 3Department of Biology, San Francisco State University, 4Department of Medicine, University of California San Francisco , 5Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine & Stem Cell Research, University of California San Francisco

本文内容

摘要

为了评估治疗干预措施对肌肉疾病的体内效应，需要采用能够定量测定治疗后肌肉力量生成和疲劳性的方法。本文详细介绍了一种用于评估离体小鼠后肢肌肉肌械性能的方法。该分析为定量评估基因修饰对肌肉功能的影响，以及比较不同疗法在肌肉疾病小鼠模型中的效果提供了可靠的技术途径。

摘要

为了评估治疗性干预措施在治疗肌肉疾病中的体内效果1,2,3，需要采用定量方法来测量经处理肌肉的力生成能力和疲劳性。本文详细描述了一种用于评估小鼠新鲜离体后肢肌肉肌-机械特性的方法。我们介绍了小鼠趾长伸肌（extensor digitorum longus）的无创性取材过程，将肌肉安装至肌肉条测力仪（Model 820MS；Danish Myo Technology），并使用方波刺激器（Model S48；Grass Technologies）测量最大单收缩张力和强直收缩张力、收缩时间以及半舒张时间。基于这些测量数据，我们展示了如何计算标准化至肌肉横截面积的比单收缩张力和比强直收缩张力、单收缩与强直收缩张力比值、力-频率关系曲线以及低频疲劳曲线4。该分析方法可用于在肌肉疾病小鼠模型中对不同治疗干预措施进行定量比较1,2,3,5，也可用于比较基因修饰对肌肉功能的影响6,7,8,9。

方案

本方案已获得加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 小鼠解剖 趾长伸肌 （EDL）肌肉

  1. 所有动物操作均须按照机构指南进行。
  2. 在肌肉采集前，采用 200 mg/kg 剂量的戊巴比妥钠腹腔注射或颈椎脱位法处死动物10。解剖操作应熟练进行，确保在处死动物后 15 分钟内完成肌肉的采集并安装至张力传感器上。
  3. 将尸体仰卧位置于解剖托盘上，并用针固定腿部。
  4. 在解剖显微镜下切开皮肤，小心分离筋膜（图1A），从踝部向上剥离胫骨前肌以暴露趾长伸肌（EDL）（图1B）。采集过程中使用数滴乳酸林格液保持肌肉湿润并维持缓冲环境。
  5. 取出趾长伸肌（EDL），尽可能保留两端的肌腱，并将其放入盛有乳酸林格液的培养皿中。在肌肉两端的肌腱上分别结扎缝线（图1C）。解剖过程中必须避免触碰或扰动肌纤维。

2. 小鼠EDL在肌肉条测力仪中的安装

  1. 进行这些研究时，需要一个组织浴槽，在保持肌肉固定的同时，使其浸浴于恒温且持续供氧的生理溶液中。该浴槽需连接张力传感器，以测量肌肉张力。本实验采用丹麦Myo Technology公司生产的集成化肌条肌动图浴槽（DMT Model 820MS）。此外，还需方波电刺激器（Grass Model S48）以及数据采集平台（ADInstruments PowerLab数据采集系统与LabChart软件），分别用于诱发、记录和分析肌肉力学反应。DMT 820MS的腔室盖上集成了铂电极，位于肌条中段两侧。其他类型的肌动图仪可能需要特别注意电极的放置位置。
  2. 向肌动图浴槽中加入5 mL Krebs Henseleit溶液11。将溶液加热至25°C，并在使用前以O2/CO2混合气体（95%/5%）持续鼓泡15分钟。
  3. 使用缝合线将EDL肌条固定于肌动图仪的夹具之间，并将EDL肌肉的肌腱牢固固定在夹具之间（图1D,E）。注意避免直接夹住肌肉组织本身。
  4. 将肌动图浴槽温度维持在25°C。

3. 肌肉力学分析

A. 收缩张力

  1. 调整浴液中的初始长度，使肌肉无松弛现象。
  2. 通过调节电压确定最大刺激强度（持续时间 0.5 ms），以获得最大单收缩张力，然后将刺激强度设定为比最大值高 20%（以达到超强刺激）。在我们的研究中，通常在 40 伏输出时即可达到超强刺激。
  3. 使用示波器验证刺激器的输出。
  4. 通过逐渐拉伸肌肉，直至单收缩张力不再增加，确定最佳长度。
  5. 让肌肉平衡 3 分钟。
  6. 在最佳长度下，使用 Grass S44 电子刺激器施加超强方波刺激（0.5 ms），并记录输出结果。
  7. 记录：单收缩张力曲线（Pt 随时间变化；图 2A）。

B. 破伤风张力

  1. 让肌肉休息 3 分钟。
  2. 使用 Grass S44 电子刺激器，在最佳长度下以 150 Hz 的频率施加持续 300 毫秒的超最大刺激脉冲串，并记录输出结果。
  3. 记录：强直收缩张力曲线（Po 随时间变化；图 2B）。

C. 刺激频率-收缩力关系

  1. 让肌肉休息 3 分钟。
  2. 频率-张力关系：以 30、60、100、140 和 160 Hz 的频率施加超最大刺激串，每次刺激之间休息 3 分钟（图3）。或者，为了在较低频率范围内获得更高的分辨率（在此范围内张力变化显著），可采用 15、25、35、45、55、65、75、100、140 和 160 Hz 的刺激频率序列。
  3. 绘图：绘制张力-频率关系曲线（最大张力百分比 vs. 刺激频率）。

D. 疲劳

  1. 施加短暂强直刺激序列：60 Hz，持续 300 ms（或调整频率以产生峰值力的 50%），每 3 秒一次，持续 10 分钟。至 10 分钟时，强直收缩力应下降至初始值约 15% 的稳定水平（图 4）。
  2. 作图：低频疲劳（最大力的百分比 vs 时间）。

E. 协议结束时的额外数据收集

  1. 在将肌肉从肌力仪上取下之前，根据步骤 III.A.4 确定的最优长度调整肌肉长度，并使用显微镜目镜或游标卡尺测量其直径。计算横截面积（μm2）。
  2. 通过移除缝合线并称量肌肉，测量肌肉质量（mg）。
  3. 称量小鼠以评估其体质量（gm）。

4. 计算

  1. 肌肉与体重比 =
    肌肉质量 / 体重
  2. 单收缩张力，Pt（mN） =
    单收缩期间产生的最大张力
  3. 比单收缩张力（N/cm2） =
    单收缩张力（mN）/横截面积（μm2） × 105 N/mN•μm2/cm2
  4. 达峰时间（ms） =
    从收缩开始至达到最大张力的时间
  5. 半松弛时间（ms） =
    从峰值张力下降至峰值张力50%所需的时间
  6. 强直收缩张力，PO（mN） =
    强直收缩期间产生的最大张力
  7. 比强直收缩张力（N/cm2） =
    强直收缩张力（mN）/横截面积（μm2） × 105 N/mN•μm2/cm2
  8. 强直收缩张力最大上升速率（N/s） =
    强直收缩张力上升期间张力增加的最大速率，即强直收缩张力曲线的最大斜率（或 dPO/dt）
  9. 强直收缩半松弛时间（ms） =
    刺激停止后至张力降至刺激终止时张力50%所需的时间
  10. 单收缩张力与强直收缩张力比值，Pt/PO =
    最大单收缩张力 / 最大强直收缩张力
  11. 疲劳指数 =
    低频疲劳刺激两分钟后张力与最大等长收缩张力的比值

5. 代表性结果

肌肉解剖与测试装置；胫骨前肌、趾长伸肌位置；张力装置；生物力学分析。
图1. 趾长伸肌的解剖。A，后肢肌肉的暴露。TA，胫骨前肌。B，趾长伸肌（extensor digitorum longus）的暴露。C，将缝线连接至趾长伸肌的肌腱。D，张力换能器浴槽（侧视图）。E，肌肉置于浴槽中（俯视图）。为便于说明，图中肌肉未完全浸入缓冲液；实际操作中，应确保肌肉完全浸没，以防干燥。

显示张力（mN）随时间（t）变化的心肌收缩曲线，示出峰值张力和半松弛时间。
图2. 张力曲线示例。A，单次收缩张力曲线示例，显示最大单收缩张力（Pt）、收缩时间（CT）和半松弛时间（HRT）。标尺，1秒。B，强直收缩张力曲线示例，显示最大强直收缩张力（Po）和强直半松弛时间（HRTT）。标尺，1秒。

肌肉刺激图；不同赫兹频率对力量的影响分析；实验结果。
图3. 刺激频率-收缩力关系分析示例。A， 不同刺激频率递增产生的张力。B, 30MHz 脉冲序列示例. 80毫秒，标尺 C, 140 MHz 脉冲序列示例。标尺：80 毫秒。 D, 由所示数据得出的力-频率曲线示例 A力-频率曲线的形状是肌肉力量的特征性表现，可用于比较不同动物来源肌肉之间的差异。

显示肌肉力量随时间衰减的曲线图，子图 B-D 展示力量-时间曲线及数据分析。
图4. 低频疲劳分析示例。A， 低频刺激期间产生的递减性张力。所示时间点的脉冲序列示例（B、C、D如下所示。 E, 由所示数据得出的低频疲劳曲线示例 A低频疲劳曲线的形状是肌肉力量的特征性表现，可用于比较不同动物来源肌肉之间的差异。

讨论

我们介绍了一种详细评估小鼠离体后肢肌肉力学特性的方法。由于EDL肌位于后部，位置较深，解剖难度较大， 胫骨前肌 肌肉，比……更容易评估 胫骨前肌 因其在踝关节和膝关节处具有显著的肌腱附着点，这些肌腱便于在肌肉条测力仪中进行固定。相比之下，更易获取的 胫骨前肌 在膝关节处具有宽阔且近乎腱性的附着，这使得在不损伤肌肉的情况下进行解剖极为困难，同时也难以将其牢固地安装在肌动仪上。我们还需强调，在生理缓冲液、含氧环境及适宜温度条件下迅速将肌肉安装至浴槽中，对于维持肌肉的机械特性至关重要。我们发现，在上述条件下，该分析过程可重复进行长达30分钟，且肌肉反应无显著变化。最后，必须注意在解剖和安装过程中避免触碰肌纤维，因为任何接触均可能对肌肉功能产生不利影响，并导致对肌机械力的低估。遵循上述操作步骤，该方法可为评估基因修饰对肌肉功能的影响提供一种可靠的定量分析手段 6,7,8,9，以及在肌肉疾病小鼠模型中对不同治疗干预措施的比较 1,2,3,5.

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究得到了美国国家心肺血液研究所（NHLBI）公共卫生服务基金（HL086513）对 P.E.O. 的资助，以及加州再生医学研究所（RC1-00104）综合研究基金、美国国家心肺血液研究所（NHLBI）公共卫生服务基金（HL085377）和波林基金会捐赠对 H.S.B. 的资助。

S.C. 获得了加州再生医学研究所干细胞研究桥梁项目（TB1-01194）对旧金山州立大学的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-0 丝线缝合线绿洲MV682普通外科
Dupont #5 镊子WPI500233普通外科
直型止血钳WPI501241普通外科
虹膜镊WPI15914普通外科
Lab Chart 软件ADInstruments版本 7数据分析
肌肉条描记仪DMT820MS张力转导
手术剪WPI501754普通外科
示波器EZOS-5020张力刺激
戊巴比妥钠SigmaP3761安乐死
PowerLab ADInstruments8/30数据采集
方波刺激器Grass Tech.S48张力刺激
Vannas弹簧剪WPI14003普通外科

溶液与培养基

乳酸林格液

  • 100 mM NaCl
  • 30 mM CH3CH(OH)COONa（乳酸钠）
  • 4 mM KCl
  • 1 mM CaCl2 2H2O（二水合氯化钙）
    • 调节 pH 至 6.75

克雷布斯-亨塞尔特溶液

  • 118 mM NaCl
  • 4.7 mM KCl
  • 1.25 mM CaCl2
  • 1.2 mM MgCl2
  • 1.2 mM KH2PO4
  • 25 mM NaHCO₃3
  • 11 mM 葡萄糖
    • 通过与 O 平衡将 pH 调整至 7.2–7.42/CO2 (95%/5%) 气体

戊巴比妥

  • 5 mg/mL 无菌水工作液

参考文献

  1. Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).
  2. Messina, S. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).
  3. Danieli-Betto, D. Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue. Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).
  4. MacIntosh, B. R., Willis, J. C. Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).
  5. Hayes, A., Williams, D. A. Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming. J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).
  6. Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).
  7. Danieli-Betto, D. Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).
  8. Chan, S. A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).
  9. Personius, K. E. Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice. J Appl. , Forthcoming (2010).
  10. Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).
  11. Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II. Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).

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