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指尖采血法用于测定运动诱导的淋巴细胞凋亡

DOI：

10.3791/2595

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2011年2月24日

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1Department of Kinesiology, Recreation, and Sport, Western Kentucky University, 2Department of Health and Human Performance, University of Houston

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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运动能够诱导免疫细胞发生凋亡。现有的检测方法存在多种局限性，尤其是血液样本在分析前所需的分离和处理时间较长。本文展示了一种快速且微创的方法，用于分析运动诱导的淋巴细胞凋亡。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

运动是一种能够诱导免疫细胞发生凋亡的生理刺激。迄今为止，在检测这一现象时已发现多种局限性，尤其是获取血样后在评估细胞死亡前所需的分离和处理时间较长。因此，很难确定所报道的免疫细胞凋亡增加究竟是运动对机体产生的实际效应，还是仅仅反映了为获得该测量结果所必需的耗时操作过程。本文介绍了一种快速且微创的方法，用于分析运动诱导的淋巴细胞凋亡。与其他技术不同，该方法在获取样本后立即将其加入抗体组合中。经过孵育后，裂解红细胞，样本即可用于分析。采用指尖采血方式减少了所需血液体积，并最大程度降低了受试者的不适感。

方案

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1. 指尖采血取样

  1. 全血采集通常在静息状态下进行，以获得基线测量值（一般在静坐休息10-15分钟后），并在运动过程中或运动结束后立即采样，以及在运动后阶段持续采样（通常为运动停止后1-3小时内）。
  2. 按照通用预防措施，首先使用70%异丙醇对指尖进行消毒。
  3. 接着，使用自动采血针或类似装置穿刺采血部位。尽管我们采用30号采血针以提高受试者的舒适度，但也可使用更大规格的针头。
  4. 弃去第一滴血液，随后将血液收集至毛细管或含锂肝素抗凝剂的微量采血管中，以防止血液凝固。

2. 细胞表型分析与凋亡染色

  1. 在250 μL结合缓冲液中加入10 μL肝素抗凝全血至已滴定的抗体组合（见表1示意图）。我们曾成功使用1:20的稀释比例，但各实验室应自行滴定试剂以确定最佳工作浓度。
    表1. 用于检测运动诱导的白细胞亚群凋亡的抗体组合。早期凋亡通过Annexin V的表达来定义，晚期凋亡通过Annexin V与7-AAD双阳性标记来定义。坏死细胞仅指Annexin V阴性而7-AAD阳性的细胞。
    第1管第2管第3管第4管
    仅细胞对照管Annexin V - FITCAnnexin V - FITCAnnexin V - FITC
     抗人CD4 - PE抗人CD8 - PE抗人CD19 - PE
     7-AAD7-AAD7-AAD
     抗人CD45RA - APC抗人CD45RA - APC 

    7-AAD = 7-氨基放线菌素D，APC = 别藻蓝蛋白，CD4 = 辅助性T淋巴细胞，CD8 = 抑制性/细胞毒性T淋巴细胞，CD19 = B淋巴细胞，CD45RA = 初始型细胞亚群，FITC = 异硫氰酸荧光素，PE = 藻红蛋白。
  2. 室温避光孵育30分钟。
  3. 以1075 × g离心5–10分钟。
  4. 弃上清，加入300 μL红细胞裂解缓冲液，并充分涡旋混匀。
  5. 室温孵育15分钟。
  6. 加入300 μL PBS以终止红细胞裂解反应。
  7. 以1075 × g离心5–10分钟。
  8. 弃上清，将离心管置于试管架上，加入50 μL结合缓冲液。
  9. 通过流式细胞术进行分析。

建议至少使用以下对照：一个仅含细胞的管作为阴性对照，用于检测背景自发荧光；以及含有每种单独荧光染料的管，用于在流式细胞仪初始设置时调节补偿。此外，我们已成功使用补偿校准微珠来建立实验条件。

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讨论

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本研究展示了一种微创样本采集方法及其后续分析技术，可用于检测运动诱导的淋巴细胞凋亡的早期和晚期阶段。该方法还能明确排除坏死细胞，仅针对凋亡细胞进行分析。此方法克服了传统侵入性肘前静脉穿刺的局限性和不适感，无需在运动前、运动中及运动后即刻等多个时间点反复采血，也避免了在整个运动过程中留置导管的需要。从研究者角度来看，传统的静脉采血操作通常需要专门的抽血技术培训，并非所有研究人员都具备该技能。此外，采用这种微创方法有助于提高受试者的招募效率和依从性，从而在存在真实效应的情况下，提升统计检验效能，增加发现显著效应的可能性。

先前采用静脉穿刺采血的研究已报道了静息状态及运动后总体淋巴细胞的数值。利用膜联蛋白V，Simpson 等 静息状态下淋巴细胞凋亡率约为1.2%，跑步机运动后约为1.3% 1。类似地，Steensberg 等 静息状态下报告的总凋亡淋巴细胞约为1.8%，跑步2.5小时后约为2.1% 2采用本文所述指尖采血法检测的凋亡淋巴细胞结果相似，在完成递增负荷运动试验的五名受试者中，静息时观察到的凋亡...

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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本研究得到了西肯塔基大学教师奖学金委员会新进教师资助项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
流式细胞术结合缓冲液eBioscience00-4222-26
红细胞裂解缓冲液eBioscience00-4333-57
采血针具Accu Check Soft TouchRoche Group
毛细管肝素化毛细管Chase Scientific Glass, Inc.501
离心机GmC LabGilson, Inc.PMS-880
Annexin V-FITC 标记试剂Biovision Inc.K201-400-1
CD4-PE 标记试剂抗人，克隆株 RPA-T4eBioscience12-0049-42
CD8-PE 标记试剂抗人，克隆株 OKT8eBioscience12-0086-73
CD19-PE 标记试剂抗人，克隆株 HIB19eBioscience12-0199-42
7-AAD 活性染色溶液eBioscience00-6993-50
CD45RA-APC 标记试剂抗人，克隆株 HI100eBioscience17-0458-42
流式细胞仪C6Accuri

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
  2. Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
  3. Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
  4. Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
  5. Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
  6. Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
  7. Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).

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Annexin V

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