指尖采血法用于测定运动诱导的淋巴细胞凋亡

摘要

运动能够诱导免疫细胞发生凋亡。现有的检测方法存在多种局限性，尤其是血液样本在分析前所需的分离和处理时间较长。本文展示了一种快速且微创的方法，用于分析运动诱导的淋巴细胞凋亡。

摘要

运动是一种能够诱导免疫细胞发生凋亡的生理刺激。迄今为止，在检测这一现象时已发现多种局限性，尤其是获取血样后在评估细胞死亡前所需的分离和处理时间较长。因此，很难确定所报道的免疫细胞凋亡增加究竟是运动对机体产生的实际效应，还是仅仅反映了为获得该测量结果所必需的耗时操作过程。本文介绍了一种快速且微创的方法，用于分析运动诱导的淋巴细胞凋亡。与其他技术不同，该方法在获取样本后立即将其加入抗体组合中。经过孵育后，裂解红细胞，样本即可用于分析。采用指尖采血方式减少了所需血液体积，并最大程度降低了受试者的不适感。

方案

1. 指尖采血取样

1. 全血采集通常在静息状态下进行，以获得基线测量值（一般在静坐休息10-15分钟后），并在运动过程中或运动结束后立即采样，以及在运动后阶段持续采样（通常为运动停止后1-3小时内）。
2. 按照通用预防措施，首先使用70%异丙醇对指尖进行消毒。
3. 接着，使用自动采血针或类似装置穿刺采血部位。尽管我们采用30号采血针以提高受试者的舒适度，但也可使用更大规格的针头。
4. 弃去第一滴血液，随后将血液收集至毛细管或含锂肝素抗凝剂的微量采血管中，以防止血液凝固。

2. 细胞表型分析与凋亡染色

1. 在250 μL结合缓冲液中加入10 μL肝素抗凝全血至已滴定的抗体组合（见表1示意图）。我们曾成功使用1:20的稀释比例，但各实验室应自行滴定试剂以确定最佳工作浓度。
   表1. 用于检测运动诱导的白细胞亚群凋亡的抗体组合。早期凋亡通过Annexin V的表达来定义，晚期凋亡通过Annexin V与7-AAD双阳性标记来定义。坏死细胞仅指Annexin V阴性而7-AAD阳性的细胞。
   ....

   第1管

   第2管

   第3管

   第4管

讨论

本研究展示了一种微创样本采集方法及其后续分析技术，可用于检测运动诱导的淋巴细胞凋亡的早期和晚期阶段。该方法还能明确排除坏死细胞，仅针对凋亡细胞进行分析。此方法克服了传统侵入性肘前静脉穿刺的局限性和不适感，无需在运动前、运动中及运动后即刻等多个时间点反复采血，也避免了在整个运动过程中留置导管的需要。从研究者角度来看，传统的静脉采血操作通常需要专门的抽血技术培训，并非所有研究人员都具备该技能。此外，采用这种微创方法有助于提高受试者的招募效率和依从性，从而在存在真实效应的情况下，提升统计检验效能，增加发现显著效应的可能性。

先前采用静脉穿刺采血的研究已报道了静息状态及运动后总体淋巴细胞的数值。利用膜联蛋白V，Simpson 等 静息状态下淋巴细胞凋亡率约为1.2%，跑步机运动后约为1.3% ¹。类似地，Steensberg 等 静息状态下报告的总凋亡淋巴细胞约为1.8%，跑步2.5小时后约为2.1% ²采用本文所述指尖采血法检测的凋亡淋巴细胞结果相似，在完成递增负荷运动试验的五名受试者中，静息时观察到的凋亡.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
流式细胞术结合缓冲液		eBioscience	00-4222-26
红细胞裂解缓冲液		eBioscience	00-4333-57
采血针具	Accu Check Soft Touch	Roche Group
毛细管	肝素化毛细管	Chase Scientific Glass, Inc.	501
离心机	GmC Lab	Gilson, Inc.	PMS-880
Annexin V-FITC 标记试剂		Biovision Inc.	K201-400-1
CD4-PE 标记试剂	抗人，克隆株 RPA-T4	eBioscience	12-0049-42
CD8-PE 标记试剂	抗人，克隆株 OKT8	eBioscience	12-0086-73
CD19-PE 标记试剂	抗人，克隆株 HIB19	eBioscience	12-0199-42
7-AAD 活性染色溶液		eBioscience	00-6993-50
CD45RA-APC 标记试剂	抗人，克隆株 HI100	eBioscience	17-0458-42
流式细胞仪	C6	Accuri