本文描述了一种准确评估细胞死亡的方法。该方案改进了传统的Annexin V/碘化丙啶（PI）检测方法，传统方法在多种动物模型的细胞系和原代细胞中可产生高达40%的假阳性事件。
本文内容
摘要
摘要
自基于流式细胞术的方法引入以来，细胞凋亡的研究受到了显著影响。碘化丙啶（PI）通常与Annexin V联合使用，通过细胞膜完整性和通透性的差异来判断细胞是否存活、发生凋亡或坏死1,2。Annexin V/PI方案是研究凋亡细胞的常用方法3。相比其他核染料，PI的使用更为广泛，因其成本低、稳定性好，并且能够基于活细胞排斥染料的特性，良好地指示细胞活力4,5。PI进入细胞的能力取决于膜的通透性；由于活细胞和早期凋亡细胞具有完整的质膜，PI无法进入并染色这些细胞1,2,6。在晚期凋亡和坏死细胞中，质膜和核膜的完整性下降7,8，使得PI能够穿过膜结构，嵌入核酸中并发出红色荧光1,2,9。然而，我们发现传统的Annexin V/PI方案会导致大量假阳性事件（高达40%），这与PI对胞质区室中RNA的染色有关10。多种动物模型中的原代细胞和细胞系均受到影响，其中大细胞（核质比<0.5）出现该现象的比例最高10。本文中，我们展示了一种改进的Annexin V/PI方法，相较于传统方法，在评估细胞死亡方面具有显著提升。该方案利用细胞固定过程中细胞通透性的变化，促进染色后RNase A进入细胞。RNase A的作用时间和浓度均已优化，以有效去除胞质RNA。结果表明，该方法显著优于传统Annexin V/PI方案（胞质PI染色事件<5%）。
方案
该实验可在500 μL硅化管或6 mL聚苯乙烯圆底FACS管中进行。当与其他实验步骤联合进行细胞活力分析时，通常使用后者。所提及的体积均针对6 mL聚苯乙烯圆底FACS管。对于500 μL硅化管，所有体积减少1/5。
流式细胞术分析的最佳浓度为每200 μL体积中含有2-4 × 106个细胞。该操作过程可能导致细胞损失，因此我们建议每个样本在操作开始时至少含有4 × 106个细胞。
1. 细胞制备
- 收集细胞——请参考相应细胞系或原代细胞分离的具体操作步骤。
- 将样品在 335 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
- 用 2 mL 1 × 磷酸盐缓冲液（PBS -/-，不含钙、不含镁）重悬细胞。
- 将样品在 335 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
- 用 1 mL 1 × Annexin V 结合缓冲液重悬细胞。
- 将样品在 335 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
- 用 100 μL 1 × Annexin V 结合缓冲液重悬细胞。
2. Annexin V/PI 染色的应用
- 根据制造商的说明加入 Annexin V [例如，5 μL Annexin V Alexa Fluor 488（Molecular Probes, A13201）]。
- 将离心管置于避光条件下，室温孵育 15 分钟。
- 向每根反应管中加入 100 μL 1× Annexin V 结合缓冲液。每管中总体积应约为 200 μL。
- 加入已用 1× Annexin V 结合缓冲液按 1:10 稀释的 PI（Sigma，货号 P-4864-10ML）4 μL（即 1 μL PI 与 9 μL 1× Annexin V 结合缓冲液混合）。此操作将使每个样品中 PI 的终浓度为 2 μg/mL。
- 将离心管置于避光条件下，室温孵育 15 分钟。
- 向每个样品中加入 500 μL 1× Annexin V 结合缓冲液以洗涤细胞。
- 以 335 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
- 用 500 μL 1× Annexin V 结合缓冲液和 500 μL 2% 甲醛重悬细胞，配制成含 1% 甲醛（固定剂）的溶液。通过轻轻弹动离心管混匀。
- 将样品置于冰上固定 10 分钟。或者，也可将样品在 4°C 避光保存过夜。若选择后者，需确保所有标记为 Annexin V/PI 的样品管（包括补偿对照）处理方式一致。
- 向每个样品中加入 1 mL 1× PBS-/-，并通过轻弹混匀。
- 以 425 × g 离心 8 分钟，弃去上清液。
- 重复步骤 2.10 和 2.11。
- 通过轻弹离心管重悬沉淀。
- 加入 16 μL 按 1:100 稀释的 RNase A（Sigma, R4642），使终浓度为 50 μg/mL。在 37°C 孵育 15 分钟。
- 加入 1 mL 1× PBS-/-，并通过轻弹轻轻混匀。
- 以 425 × g 离心 8 分钟。
- 样品现已准备好进行分析。或者，若 Annexin/PI 染色与其他实验步骤并行进行，样品也可用于后续染色步骤。
3. 典型结果：
图1展示了不同程度出现碘化丙啶（PI）假阳性染色的细胞类型和细胞系示例。为消除假阳性事件的影响，细胞经过固定后用RNase A处理。与未经RNase处理的细胞相比，该处理显著减少了假阳性事件的数量（图2B）。图2C显示了经RNase处理与未经RNase处理细胞的代表性图像对比。图3表明，通过加入固定和RNase处理步骤的改良Annexin V/PI实验方案，相较于传统方案可有效减少假阳性染色事件的发生。
图1. 传统的碘化丙啶染色方案会导致大量假阳性事件。 我们此前已评估了在多种动物模型的原代细胞以及多种细胞系中假阳性染色的程度10。代表性图像展示了三种不同细胞群体中的假阳性染色情况（一种常用细胞系——RAW巨噬细胞，以及两种原代细胞——小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMM）和金鱼原代肾巨噬细胞（PKM））。真阳性事件显示PI与DRAQ5在细胞核区域的预期共定位（黄色区域表示PI与DRAQ5的共定位）。DRAQ5是一种高膜通透性的染料，可准确地标记活细胞和死细胞的细胞核区域10,11,12。为了更直观地判断共定位情况，DRAQ5染色被赋予绿色伪彩。
图2. 提高PI核染色的准确性.（A）我们基于多种特征明确的核染料（BrdU、7-AAD 和 DAPI）与 DRAQ5 的相似程度，评估了 PI 核染色的准确性。BrdU 是一种合成核苷，可掺入增殖细胞的 DNA 中，因此仅在核区室中染色。7-AAD 对 DNA 具有高亲和力，与 PI 类似，不能穿过完整的质膜。DAPI 同样对 DNA 具有强亲和力，是荧光显微镜中最常用的核染料。相似程度的评估结果如下 >BrdU、7-AAD、DAPI 和 DRAQ5 之间的相似性达到 99%，表明它们在 RAW 264.7 巨噬细胞中均能准确地标记细胞核。相比之下，基于常规方案的细胞质 PI 染色与 DRAQ5 相比，染色相似性百分比显著降低。（B）在两种测试的原代细胞中也观察到类似结果：小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMM）和金鱼原代肾巨噬细胞（PKM）。DRAQ5 的整合应用 50 μg/mL 在染色程序的特定阶段使用RNase A可去除非核区的PI染色，从而显著提高与DRAQ5染色的相似程度。（C）原代肾巨噬细胞的代表性图像显示了经与未经RNase处理的细胞之间的相似程度。为便于直观判断处理间的差异，DRAQ5被赋予绿色。黄色区域表示BrdU与DRAQ5以及PI与DRAQ5的共定位。
图3。改良的Annexin V/PI染色法显著减少了假阳性凋亡/坏死信号。采用常规与改良Annexin V/PI染色方案对金鱼原代肾髓巨噬细胞（PKM）进行染色。散点图展示了金鱼PKM细胞的Annexin V/PI染色结果。左侧散点图为常规Annexin V/PI染色（未加RNase）的PKM细胞结果；右侧散点图为采用改良Annexin V/PI方案（含RNase）染色的PKM细胞结果。加入RNase后，由于去除了假阳性染色，PI染色信号明显减少。随后根据培养物中不同细胞群体——早期前体细胞（EP）、单核细胞（Mono）和成熟巨噬细胞（Mat mac）——对PKM细胞进行分析。由于去除了假阳性事件，PI阳性信号数量的减少在体积较大的成熟巨噬细胞中比在较小的早期前体细胞中更为显著。若依据常规染色方案得出结论，可能会错误地推断出更成熟的巨噬细胞亚群与细胞死亡之间存在正相关关系。
讨论
本文所介绍的Annexin V/PI方案是对传统方案的改进，考虑了细胞质中RNA的存在，而RNA对PI也具有高亲和力。在染色程序后期进行1%甲醛固定后加入RNase A（50 μg/mL），可显著提高细胞核PI染色的准确性。该处理对细胞核PI染色或质膜Annexin V染色均未观察到负面影响。若不进行RNase A处理，多达40%的PI染色结果可能导致假阳性事件，从而对后续结论产生潜在的显著不利影响10。
我们改进的Annexin V/PI染色方案操作简便，已成功应用于多种细胞类型（原代细胞：小鼠骨髓巨噬细胞和脾细胞；猪肺组织驻留细胞、肺泡巨噬细胞、肠系膜淋巴结分离细胞、外周血白细胞、脾细胞；鸡胚盘细胞；金鱼原代肾巨噬细胞；鲤鱼外周血白细胞；细胞系：RAW 264.7巨噬细胞、Jurkat T细胞、猪3D4/31巨噬细胞、CCL-71金鱼鳍成纤维细胞、3B11鲶鱼B细胞10）。需要注意的是，不同细胞对PI染色假阳性反应存在差异，通常原代细胞的假阳性事件更多10。这些细胞群体间PI假阳性染色的差异可能部分归因于细胞大小的不同，但也可能与RNA含量的差异有关。因此，本方案特别适用于涉及以下实验体系的研究：发生基因毒性应激的细胞、经胸腺嘧啶或羟基脲等细胞周期阻滞药物处理的细胞、病毒感染的细胞，以及胚胎细胞研究——在这些研究中，发育进程的特点是细胞RNA合成发生阶段性变化。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）研究基金和阿尔伯塔农业资助联盟基金对DRB的资助。AMR获得了NSERC范尼尔加拿大研究生奖学金、阿尔伯塔大学助教奖学金以及伊丽莎白二世研究生奖学金的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 × PBS-/- | |||
| 1 × Annexin V 结合缓冲液 | BD Biosciences | 556454 | |
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes, Life Technologies | A13201 | |
| 碘化丙啶（PI） | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL H2O 溶液 |
| 2% 甲醛 | Sigma-Aldrich | F1268 | |
| 牛胰 RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | 用 1 × PBS-/- 按 1:60 稀释 |
参考文献
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