我们描述了一种通过荧光显微镜对活神经元中的线粒体进行长时间成像的实验方案。通过慢病毒介导表达线粒体靶向的荧光蛋白，并结合使用本实验室设计和构建的低成本载台式培养箱，可实现对样本的长期连续成像。
方法文章
神经调节与线粒体运输：对海马神经元进行长时间活体成像
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
为了理解线粒体运输与神经元功能之间的关系，长时间观察活体培养神经元中的线粒体行为至关重要1-3。如今，借助活细胞染料和荧光蛋白，可以对活细胞中的细胞骨架成分、细胞器及其他结构进行标记，并通过动态荧光显微镜进行可视化观察，从而实现这一目标。例如，在鸡胚交感神经元中，曾使用活细胞染料罗丹明123来表征线粒体的运动4。在另一项研究中，通过转染线粒体靶向的eYFP，在大鼠前脑神经元中实现了线粒体的可视化5。然而，对原代神经元进行数分钟、数小时甚至数天的成像仍面临诸多挑战。其中最主要的问题包括：1）在长时间成像过程中维持培养环境的温度、湿度和pH等条件；2）获得强而稳定的荧光信号，以确保所获取图像的质量，并在图像分析过程中准确测量信号强度；3）在图像采集过程中限制曝光时间，以尽量减少光漂白并避免光毒性。
本文介绍了一种可在高时间分辨率及最佳生命维持条件下，对培养的海马神经元中线粒体运动进行观察、可视化和分析的实验方案。我们构建了一种经济实惠的载物台式培养箱，能够实现良好的温度控制和气体流通，同时减少培养基蒸发，从而确保稳定的pH值和渗透压。该培养箱通过进气和出气软管连接至标准组织培养箱，后者可提供恒定的湿度环境以及5-10% CO2/空气的气体环境。该设计相较于昂贵得多的显微镜专用培养箱更具成本效益，而后者并不一定能保证细胞在数小时甚至数天内的存活状态。为实现线粒体的可视化，我们使用编码靶向线粒体的红色荧光蛋白的慢病毒感染细胞。这种方法可产生强而持久的荧光信号，结合稳定的氙灯光源，使我们在图像采集过程中能够缩短曝光时间，几乎完全避免光漂白和光毒性。载物台培养箱顶部设有两个注射端口，可用于快速施加神经递质及其他旨在调节线粒体运动的试剂。综上所述，通过慢病毒介导的细胞器靶向红色荧光蛋白表达，结合本载物台培养箱、常规倒置荧光显微镜、CCD相机和氙灯光源，我们能够对活神经元中线粒体运输进行长时间的延时成像，其持续时间远超使用传统活体染料和现成生命支持系统的以往研究。
方案
1. 自制台式培养箱的描述
在显微镜载物台上长时间维持细胞存活面临三大主要挑战：1）环境温度的控制与调节；2）湿度控制，即维持周围环境中的水分含量；3）培养基中pH值的稳定维持。这些“生命支持”问题对于需要长期观察培养神经元的实验尤为关键，因为神经元对温度和pH值的变化特别敏感。下文我们将介绍一种由实验室自行设计和搭建的载物台式培养箱，用于在较长时间内对神经元进行活细胞成像。该培养箱通过闭合回路连接至一台标准组织培养箱（Thermo Scientific，Asheville，NC），后者可提供稳定的加热环境（37°C）以及含10% CO2/90%空气的湿润气体氛围。
- 培养箱外壳：培养箱的主体部分（图1（I，II）；A) 在计算机化 C 上制造&由黑色聚甲醛塑料整块铣削而成的C型铣床，尺寸为97.74 mm（长）×73.60 mm（宽）×28.58 mm（高），内部尺寸为96.74 mm×72.60 mm×27.58 mm，提供约19,370 cm³的封闭容积3在围栏两端各钻一个孔，并安装带螺纹的黄铜接头，用于连接组织培养孵育箱的进液和出液软管。在围栏顶部铣出一个尺寸为70.0 mm × 43.0 mm的矩形开口，以便安装聚碳酸酯塑料窗图1（I，II）；B）。培养箱的底部（图1(I, II, III)；C；左上角为顶视图和侧视图的详细示意图），由3/16英寸铝材加工而成，尺寸为159.77 mm（长）× 109.86 mm（宽）× 3.175 mm（厚），设计用于嵌入徕卡电动三板载物台（Leica motorized 3-plate stage，型号11-522-068，Leica GmBh，德国莱比锡）的插槽中。底座四角通过齐平安装的沉头螺钉固定四个带内螺纹的钢制支柱，为培养箱外壳提供稳固的连接点，外壳四角已钻孔以适配这些支柱（图1(II, III)；D）。使用 Sorbothane 垫圈（McMaster Carr, Inc., Elmhurst, IL）裁剪并适配于底座，以在 enclosure/底座接口处提供密封。使用四个螺纹与支柱匹配的黄铜手拧螺钉将 enclosure 固定到底座上（图1(II, III)；D在培养箱底座中央切割一个直径为35.1 mm并带有细小内凹边缘的孔，用于容纳35 mm的GBM图1(III)；E；左上角细节）；已设计额外的底座以适配其他尺寸的培养皿。
- 加热元件：两个10 kΩ散热电阻（Digi-Key Corp.，Thief River Falls, MN）固定在培养箱外壳的内壁上。这些电阻连接至一个9 V直流、500 mA的变压器，该变压器接入Alife 1000 W爬虫类饲养箱温控器（Carolina Pet Supply，Irmo, SC）。将一根有线探头穿过培养箱外壳聚碳酸酯窗口的密封垫圈，用于检测内部环境温度，并据此调节流向电阻的电流。结合组织培养用培养箱使用时，这些电阻可进一步增强环境温度的控制能力。
- 封闭式循环气体系统：提供恒定的加湿和加热的10%CO₂气体环境290% 空气条件下，通过进气和出气软管将载物台培养箱连接图1(I)；F，G)，放入标准的水套式组织培养孵育箱中（图1(I)；H）；Forma Scientific 型号 3154；Thermo Scientific, Inc.，Asheville, NC）。在即将连接至载台式培养箱前，将进液管（图1(I)；F）连接至一个标准的水族箱泵（图1(I)；I；Lifegard QuietOne 型号 1200，Pentair Aquatics，El Monte，CA）置于密封的 ABS 塑料盒内（图1(I)；J；Model 1150，Pelican Products, Inc.，Torrance, CA）以维持闭合回路。该泵可促进气流从组织培养孵育箱持续流向载台孵育箱。泵之后，进气管连接至一个1500 ml的锥形瓶（图1(I)；K）作为消音器，以最大限度减少振动从泵传递到载台式培养箱。 一个出水软管（图1(I)；G）从载台式培养箱通向组织培养箱（图1(I)；H) 配备了一个封闭式计算机风扇（图1(I)；L），与泵类似，其设计目的也是促进持续的气流。
- 35mm GBM专用PFTE膜盖：在将神经元培养物放入载台式培养箱进行成像之前，需为35mm GBM装配一种特殊的膜盖（图1(II, IV)；M；细节见右上角）以允许气体交换，同时最大限度减少培养基的蒸发。该盖子由一个聚甲醛（delrin）塑料环和一张预先裁剪的聚四氟乙烯（PFTE）膜（Teflon；American Durafilm 公司，Holliston，MA）组成，PFTE膜被拉伸固定在塑料环上，并通过嵌入delrin塑料环侧面凹槽中的氟橡胶（viton）垫圈加以固定。
- 注射口：在聚碳酸酯窗口上钻了两个孔（图1(II)，中心细节，靠近B图中孵育箱顶部的黄色箭头所示位置。这些装置配有不锈钢Hamilton注射器端口，用于在实验过程中注入5-HT、DA、各种受体激动剂和拮抗剂以及其他试剂。
2. 原代海马神经元培养的制备
所有操作均在生物安全二级（BSL2）层流罩或层流工作台中进行。原代海马神经元根据标准方案从E18大鼠胚胎中分离获得6-7，并在经原代皮层星形胶质细胞条件化处理的无血清培养基中培养。胶质细胞的制备参照已发表的方法7。该条件培养基由低糖DMEM组成，添加脯氨酸（1.76 µg/ml）、天冬酰胺（0.83 µg/ml）、维生素B12（0.34 µg/ml）、葡萄糖（20 mM）、富含脂质的BSA（0.5 mg/ml）以及2% B278-10。培养基中不添加抗生素，因其可能干扰神经元基因的转录。
- 在35 mm玻璃底培养皿（GBM）的中央玻璃盖玻片区域覆盖多聚-D-赖氨酸（0.05 mg/ml PBS溶液），于37°C孵育2小时。吸除多聚-D-赖氨酸溶液，于生物安全二级（BSL2）超净台中干燥20分钟。在已包被多聚-D-赖氨酸的盖玻片区域加入层粘连蛋白（0.01 mg/ml PBS溶液），作用至少40分钟后吸除多余溶液，静置20分钟备用。
- 从E18大鼠胚胎脑中分离海马组织，并按照《神经科学最新实验方案》6 中所述方法进行解离。
- 将解离后的细胞用生长培养基稀释，使每块GBM接种密度为110,000个细胞。根据拟制备的GBM数量，计算主混合液中所需的细胞浓度。
- 将接种后的GBM置于培养箱中，设置温度为37°C，气体环境为10% CO2/90%空气。
- 根据神经元的生长状况，在接种后3至5天，向培养物中加入阿糖胞苷C（0.14 ng/ml），以抑制胶质细胞增殖。
- 继续培养两周后再进行慢病毒感染。在此期间，每隔三天更换每块GBM中三分之一体积的培养基。更换量不得超过此比例，以免引起渗透压休克和细胞死亡。
3. 编码红色荧光蛋白的重组慢病毒的制备
对于无法获得重组慢病毒制备设施的研究人员而言，可选择由商业机构定制生产，例如 System Biosciences（Mountain View, CA）。
一种线粒体靶向的红色荧光蛋白基因（MitoTurboRFP；Axxora LLC，San Diego，CA）被插入到一种自我失活的重组猫免疫缺陷病毒中，该基因的转录由巨细胞病毒主要立即早期基因启动子的增强子控制11。重组慢病毒通过瞬时转染293T细胞进行生产。
- 以约 75,000 个细胞/cm² 的密度接种 293T 细胞2，次日使用PolyJet（SignaGen Laboratories，Gaithersburg，MD）将编码重组病毒载体、FIV gag和pol基因以及水疱性口炎病毒G糖蛋白基因的质粒共转染至细胞中。总DNA量为12 μg（4.8 μg 病毒载体 4.8 μg gagpol 质粒，以及 2.4 μg VSV G 质粒）每 10 cm 培养皿的 293T 细胞使用一次。
- 24小时后，吸去培养基，用不含酚红的Hanks平衡盐溶液洗涤细胞，以去除残留的DNA。加入10 ml添加有血清的神经基础培养基 50μg/ml 富含脂质的 BSA 和 Glutamax
- 次日，收集上清液，经0.2微米低蛋白结合滤膜过滤后，加入Vivaspin 20聚醚砜超滤管（Sartorius，Concord，USA）。使用前依次以70%乙醇、组织培养级水和磷酸盐缓冲液洗涤Vivaspin管。在1500×g离心30分钟，将含病毒的上清液浓缩约50倍。分装病毒制剂，保存于液氮中2.
- 通过将浓缩病毒的一部分加入大鼠B104细胞中进行感染，并在72小时后通过流式细胞术检测荧光蛋白表达，来估算病毒量。阳性细胞的百分比可提供病毒量的估计值，即为在特定数量的原代神经元中获得荧光蛋白表达所需的浓缩病毒体积。
4. 培养神经元的感染
14天时感染海马神经元培养物 体外 通过流式细胞术数据估算出的病毒感染量（该剂量可感染不超过50%的神经元）直接加入培养物中，不使用polybrene。培养3天后检测荧光蛋白表达。若信号过弱，则将培养物重新放回组织培养孵箱，数天后再次检测。
5. 密闭回路生命支持系统的常规维护
- 为保持适当的湿度，需定期检查培养箱的水套，并在必要时加水。务必在培养箱内放置一个不锈钢或铝制托盘，其中加入少量水（深25 mm）并添加除藻剂。
- 必要时，通过排空集水管中积聚的水来清理培养箱气体循环系统的进气和出气软管。定期用70%乙醇冲洗软管。
6. 将膜盖应用于玻璃体基底膜及放置于载物台培养箱
- 在将GBM放入载物台顶部培养箱之前，需在组织培养罩内用覆有膜的盖子替换塑料盖。完成此操作后，即可将带盖的GBM转移至显微镜下。
- 将带膜盖的GBM小心地放入载物台顶部培养箱底座的凹陷开口中。为避免震动GBM，请确保底座已预先固定在显微镜载物台上；由于底座与载物台卡接较为困难，建议在底座就位后再放置GBM。
- 将培养箱外壳与底座上的钢柱对齐，并将外壳缓缓下放至底座上。拧紧手拧螺钉，直至外壳与底座之间形成良好密封。
7. 图像采集
请注意，目前大多数可用的成像软件平台在各类显微镜及相关硬件上均具有相似的功能。市面上有多种图像采集与分析软件平台可供选择，包括 MetaMorph，以及针对特定品牌显微镜设计的程序，例如 Leica Application Suite、Nikon 的 NIS-Elements 和 Carl Zeiss 的 AxioVision。在本实验方案中，我们以 Slidebook 5（Intelligent Imaging Innovations，Denver，CO）为例，描述所采用的图像采集与分析操作流程。然而，本方案中所述各项操作的具体步骤均可轻松适配于其他多种软件平台。
倒置荧光显微镜、滤光片配置、CCD相机、氙灯光源及成像软件的说明：
为对海马神经元中线粒体运输进行动态成像，我们使用徕卡DMI-6000B倒置荧光显微镜和型号为11-522-068的电动载物台（Leica Microsystems CMS GmbH，德国韦茨拉尔），配备 Cooke Sensicam EQ CCD相机（The Cooke Corporation，美国密歇根州罗穆卢斯）、Sutter Lambda 10-2滤光轮及控制器（Sutter Instrument Company，美国加利福尼亚州诺瓦托）以及Sutter DG-4 300 W氙灯光源。为观察经MitoTurbo Red荧光蛋白标记的线粒体，我们在DG-4光源处使用555 nm滤光片进行激发，在显微镜和滤光轮处分别使用600 nm（峰值；Sedat Quad分光镜型号86100bs，适配徕卡DM系列滤光镜盒，Chroma Technology Corp.，美国佛蒙特州贝尔斯福尔斯）和617 nm滤光片进行发射光采集。
在图像采集与分析中，我们使用数字显微成像软件包 Slidebook 5。该软件是一个综合性平台，可在图像采集过程中实现对显微镜、载物台、滤光轮、相机和光源的全自动控制，同时提供多种图像处理与分析模块。
以下，我们提供使用 Slidebook 5 获取荧光标记神经元中运动线粒体延时图像的具体分步操作说明。
- 确保在打开 Slidebook 5 之前，显微镜、滤光轮控制器、光源和 CCD 相机均已开启。
- 为进行线粒体的活体成像，切换至63倍油镜物镜，将物镜转盘降低至足够位置，以便接触显微镜载物台下方（及载物台顶部培养箱下方）的物镜，并小心地将镜油直接滴加到物镜表面。通过点击Slidebook工具栏上的“对焦窗口”图标打开对焦窗口。在对焦窗口中，滑动标有“lamp”的滑块以打开明场光源，并将明场光强调节至合适水平。对准细胞视野并调焦，找到目标细胞。
- 在“范围”选项卡下，选择“CY3”荧光。使用目镜，在荧光照明下找到经 Mito TurbRed 蛋白标记的细胞中线粒体的焦平面。通过目镜获得清晰焦点后，切换至 CCD 相机，必要时重新对焦。
- 单击 Slidebook 工具栏上的“图像采集”图标以打开图像采集窗口。以 100ms 的初始曝光时间开始，使用“测试”和“查找最佳”按钮确定最佳曝光时间；或者，您也可以使用“单次”按钮。请注意，曝光时间应在最短持续时间内（例如 200-800ms）使整个图像区域的强度分布充足（例如 0-2500；由图像采集窗口底部的直方图指示）。
- 开始延时图像采集前，在图像采集窗口内点击“高级”选项卡以打开“高级”窗口。找到“对焦”选项卡，勾选“在延时/多点采集期间自动对焦”选项，并调整延时图像采集的自动对焦设置。通常我们使用以下自动对焦参数：每2-3帧更新一次焦点；选择用于成像标记线粒体的荧光通道作为自动对焦通道，即CY3；在63倍放大下总搜索范围为2 μm。
- 在“采集”窗口的“采集类型”框中，勾选“时间序列”选项，并在“时间序列采集”选项下选择所需的成像时间间隔和成像持续时间。在我们研究神经调节剂对线粒体运输影响的实验中，时间序列成像以一小时为一个会话，共采集360张图像，图像间间隔为10秒。
- 通过点击“Capture”窗口右下角的“Start”按钮，开始延时图像采集。
- 在初始（对照）成像结束后，通过载台式培养箱顶部的加样口加入神经递质及其他试剂，并开始新的成像过程。
8. 图像分析
- 打开上次成像会话后保存的图像文件。
- 可在Slidebook 5提供的掩膜功能支持下，通过自动或手动方式对时间序列图像中的单个线粒体进行标记。
- 在“Mask”菜单下，从菜单栏中选择“Segment”。通过调节“histogram”工具中的低阈值线和高阈值线，将整张图像中所有颗粒以蓝色标记出来，覆盖该突起内包含的所有线粒体，同时尽可能保持颗粒的独立性。将此掩膜应用于整个图像序列。
- 创建第二个掩膜（在“Mask”菜单下选择“Create”），覆盖除目标突起区域外的整个图像区域，而该突起区域内颗粒已被前一个掩膜高亮显示。具体操作为：首先使用最粗的“pencil”工具勾勒出突起区域外各区域的边界，然后使用“paint bucket”工具填充所围区域。将此掩膜应用于整个图像序列。
- 在“Mask”下选择“Mask Operations”，执行“Minus”操作，即从第一个掩膜（覆盖整个图像）中减去第二个掩膜（突起区域除外）。由此生成第三个掩膜，仅高亮显示目标突起区域。请注意，该新掩膜将应用于整个图像序列。
- 在“Annotations”下选择“Object IDs”。
- 通过手动回放图像序列，验证各个被掩膜标记的线粒体的连续性及其编号分配情况（在Slidebook 5中，可使用图像窗口下方的“play”、“forward frame”和“reverse frame”按钮实现此操作）。
- 选择菜单栏上的“Mask”标签页，在“Mask”下选择“Particle Tracking”，运行“Basic Particle Tracking”以生成“Path Statistics”，包括每个被标记线粒体的质心坐标。
- 根据每个颗粒在相邻两帧图像中的坐标，计算每个线粒体在两帧之间的移动距离。
- 在我们先前关于神经调节剂对线粒体运动影响的研究中，识别出三类不同的线粒体群体：“静止型”、“振荡型”和“定向移动型”。若一个线粒体在一小时内移动距离小于0.2 µm（或2像素，63倍放大下；1像素=0.10235 µm），则被定义为“静止型”；若其在顺行-逆行循环中移动至少0.2 µm但小于2.5 µm，则定义为“振荡型”；最后，若其在一个方向上的净移动距离超过2.5 µm，则归类为“定向移动型”。图2展示了一个代表性实验中所有标记线粒体的运动直方图，以及三类线粒体群体百分比分布的饼状图。
- 每个线粒体的平均速度根据其在特定成像时段内的总移动距离计算得出。线粒体群体的平均速度通过将所有个体速度相加后除以追踪的线粒体总数获得。
- 可使用Slidebook 5提供的模块生成线粒体运动的线图（kymograph）。利用“Mask”功能，在某一特定突起（如轴突）的全长上绘制一条细线，确保穿过尽可能多的线粒体质心。进入菜单栏的“Mask”标签页，选择“Advanced Operations”，然后选择“Smooth Curve Analysis”。可使用平滑曲线分析的默认设置，也可根据需要自定义参数。运行平滑曲线分析模块，分析结束后将显示该成像时段的线图。
- 进入菜单栏，选择“View”，然后选择“Export TIFF”。
- 在Photoshop或类似图像处理程序中打开包含线图的已保存.tif文件，并将图像转换为反相灰度图像。
9. 代表性结果
通过追踪和分析培养的海马神经元中线粒体的运动，我们证实了神经调节与线粒体运输之间存在关联。具体而言，我们发现5-羟色胺（5-HT）或5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT可促进线粒体运动（图2A-C）8，而多巴胺（DA）或D2受体激动剂溴隐亭则抑制线粒体运动（图2D-G）9。
图1. 封闭式载台培养箱系统的设计。 图中显示了培养箱系统的以下组件：耐热Delrin塑料外壳（A）；用于聚碳酸酯塑料窗口的矩形开口（B）；培养箱的铝制底座（C）；用于容纳底座钢柱的孔（D）；培养箱底座中心处直径为35.1 mm、带有浅凹唇边的孔，用于容纳35 mm GBM培养皿（E）；Nalgene软管（用于组织培养箱与载台培养箱之间的连接，以及水分捕集器）（F, G, N）；组织培养箱（H）；水族泵（I）；密封的ABS塑料盒（用于容纳水族泵）（J）；2000 ml锥形瓶（在进入载台培养箱前的软管中用于抑制振动的消音器）（K）；冷却风扇的塑料外壳（L）；35 mm GBM皿盖的塑料支架（M）；塑料旋塞的位置（O）。试剂添加口的位置由（II）中的黄色箭头标示。
图 2. 代表性结果：线粒体运输的调控。A. 培养条件下典型的大鼠海马神经元轴突。绿色显示由慢病毒编码的荧光蛋白标记的线粒体；红色显示用磷酸化神经丝蛋白抗体免疫标记的轴突。黄色箭头指示轴突的范围。该图像由四张重叠的显微照片拼接而成。B. 时间序列成像示例，显示给予5-HT后线粒体运动的变化。图像通过倒置荧光显微镜采集，并以序列形式存储，随后转换为Quicktime视频。代表性图像序列展示了在给予5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT之前（左图）和之后（右图）不同时间点单个线粒体的运动情况。垂直的红色矩形框突出显示在多个时间点保持静止的线粒体（左）和呈振荡运动的线粒体（右）。左图中标记的振荡线粒体在给予8-OH-DPAT后向轴突末端移动（右图；红色边框的白色箭头）。右图中的垂直黄色线表示该移动线粒体的起始位置。每个图像帧右下角显示时间间隔。右图右下角标注了放大倍数（63×）。C, D. 给予5-HT后线粒体运动变化的图示。C和D分别展示了给予5-HT前和给予5-HT后线粒体运动的变化，以速度（X轴）与各线粒体沿轴突的初始位置（Y轴）的关系图表示。速度以及静止（红色）、振荡（蓝色）和定向移动（绿色）线粒体的比例分别在主图和上方插图的饼图中表示。从示意图轴突的高亮区域投射至各图Y轴的红色虚线，表示所成像轴突片段的大致位置和范围。E, F. 给予多巴胺（DA）后线粒体运动变化的图示。E和F分别展示了给予DA前和给予DA后线粒体运动的变化，以速度（X轴）与各线粒体沿轴突的初始位置（Y轴）的关系图表示。速度以及静止（红色）、振荡（蓝色）和定向移动（绿色）线粒体的比例分别在主图和上方插图的饼图中表示。从示意图轴突的高亮区域投射至各图Y轴的红色虚线，表示所成像轴突片段的大致位置和范围。G, H. 典型的线粒体运动kymograph图，显示在培养神经元中给予D1受体激动剂溴隐亭之前（G）和之后（H）的线粒体运动情况。该神经元在给予溴隐亭前（G）和给予后（H）各持续成像一小时。
讨论
通过使用慢病毒介导的荧光蛋白在感染的培养神经元中靶向线粒体表达，并结合一种价格低廉、实验室自制的载台式培养箱，可实现对活细胞长时间成像，我们得以研究线粒体运动与5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）和乙酰胆碱（ACh）等神经调节信号之间的关联。我们的研究有助于阐明一条信号通路，首次将线粒体运输与由5-HT和DA等神经递质调节的神经元活动变化联系起来，而这些神经递质正是神经功能的核心。我们发现，使用靶向荧光蛋白可在生理学上更具相关性的较长时间内，对活体培养神经元中的标记线粒体进行持续观察，相较使用活体染料所能实现的较短观察时间具有明显优势。此外，荧光蛋白信号的强度使我们在图像采集过程中能够保持较短的曝光时间，从而最大限度地减少光漂白或光毒性发生的可能性。最后，一种结构简单且成本低廉的载台式培养箱，可在最小化培养基蒸发的同时维持环境温度、湿度和CO2水平，使我们能够连续数小时甚至数天追踪活神经元中线粒体的运动。希望为活神经元中线粒体的长期观察构建载台式培养箱的研究人员，无需完全照搬本方案中设计的具体细节，只要所用材料的特性（例如，使用透气膜以避免培养基蒸发）和应用原理（例如，温度与湿度控制、pH缓冲、渗透压维持）总体上与本方案所述一致即可。
致谢
我们感谢 Donald Hutson 在台式培养箱的设计与制造过程中贡献出他的专业技术与高超技能。我们还感谢 Ayda Dashtaei 提供出色的技术协助。所有工作均由神经科学研究基金会资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (1) 组织培养箱（H） | |||
| (1) 耐热塑料外壳（A） | （聚甲醛或性能相当的材料） | ||
| (1) 35 mm GBM 盖用塑料框架（M） | （用于将膜固定到培养皿上） | ||
| (1-2) 英尺透明 PFTE（特氟龙） | 膜材料 | ||
| (4) 黄铜手拧螺钉 | |||
| (2) 小型 10 kOhm 散热电阻 | 作为载台培养箱外壳内的加热元件 | ||
| (1) 变压器 | 为电阻提供 9 V 电流 | ||
| (1) 爬虫类饲养箱温控器及探头 | 通过变压器对散热电阻进行恒温功率调节 | ||
| (1) 2000 ml 锥形瓶（K） | 作为载台培养箱前软管的减震消音器 | ||
| (1) 1/8" 索尔波坦片材 | 作为载台培养箱底座的垫圈材料 | ||
| (1) 密闭式 ABS（或性能相当）塑料盒（J） | 用于容纳水族泵 | ||
| (1) 水族泵（I） | |||
| (1) 小型计算机散热风扇 | |||
| (1) 散热风扇塑料外壳（L） | |||
| (1) 计算机散热风扇用 9 V 变压器 | |||
| (20-30 英尺) Nalgene 或硅胶软管（F, G, N） | 连接组织培养箱与载台培养箱；用于水分捕集 | ||
| (2) 塑料活塞阀（O） | 用于开启和关闭载台培养箱前后气流 | ||
| (4) 带倒刺黄铜软管接头 | 用于连接载台培养箱与水族泵外壳的软管 | ||
| (2) 黄铜快速接头 | 用于连接载台培养箱的软管 | ||
| (2) 黄铜快速接头 | 用于连接载台培养箱的软管 | ||
| 表 1. 载台培养箱组件： | |||
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | |
| 层粘连蛋白 | Roche Group | 11243217001 | |
| 35 mm 玻底培养皿 | MatTek Corp. | P35GC-0-14-C | |
| DMEM | Life Technologies | 10567 | |
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| 富含脂质的 BSA | Life Technologies | 11020-021 | |
| L-天冬酰胺 | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
| L-脯氨酸 | Sigma-Aldrich | A8381-100G | |
| 维生素 B-12 | Sigma-Aldrich | V2876-100MG | |
| 5-HT | Sigma-Aldrich | H9523-25MG | |
| 8-OH-DPAT | Sigma-Aldrich | H8520-25MG | |
| 多巴胺 | Sigma-Aldrich | H8502-5G | |
| 溴隐亭 | Sigma-Aldrich | B2134-25MG | |
| SKF38393 | Sigma-Aldrich | D047-100MG |
参考文献
- Ligon, L. A., Steward, O. Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons. J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).
- Miller, K. E., Sheetz, M. P. Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria. J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).
- Macaskill, A. F. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Crawley, J. N. Current protocols in neuroscience. , J. Wiley. (1999).
- Fedoroff, S., Richardson, A. Protocols for neural cell culture. , 3rd edn, Humana Press. (2001).
- Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons. Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).
- Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons. PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).
- Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. , e10848-e10848 (2010).
- Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors. Mol Ther. 1, 31-38 (2000).
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