本实验方案旨在建立并维持一种新皮层脑片的器官型培养体系，以便对锥体神经元进行电生理记录。
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摘要
摘要
我们一直在研究大鼠新皮层锥体神经元中电压门控钾通道的表达及其功能作用。由于目前缺乏针对这些通道的特异性药理学工具，我们采用了遗传学方法来调控通道的表达。我们采用脑片器官型培养方法（16），以维持细胞形态以及皮层的分层结构。通常在出生后第8至10天急性分离新皮层脑片，并将脑片在体外培养3至7天。这种方法使我们能够在与急性脑片实验相似的发育阶段研究神经元，同时最大限度地减少脑片中过度兴奋性连接的形成。我们通过红外照明（IR）结合微分干涉差显微镜（DIC）技术，在电流钳或电压钳模式下进行全细胞膜片钳记录，对II/III层或V层中经视觉识别的锥体神经元进行电生理记录。为调控钾通道的表达以研究其功能，我们采用基因枪（生物弹道）法转染野生型或突变型钾通道DNA。通过共转染绿色荧光蛋白（GFP）的cDNA，可在转染后利用落射荧光显微镜轻松识别转染的细胞。我们将同一脑片同一皮层内转染细胞的记录结果与邻近未转染神经元的记录结果进行比较。
方案
1. 切片日前的准备工作
我们发现，在切片当天之前对手术器械进行高压灭菌并配制溶液更为高效。
- 对器械进行高压灭菌。（手术和切片操作在半无菌条件下进行）。将以下物品分别用高压灭菌纸包裹后，单独进行高压灭菌：
- 手术包：刮勺、#22 手术刀柄、剪刀、镊子
- 切片包：三个旋钮（刀片固定旋钮和两个浴槽固定旋钮）和刀片护罩（用于固定切片机上的剃须刀片：Campden Vibroslice，货号 #MA572），分别单独包裹（因其需放入冷冻保存）；定制金属切片槽（标本槽，用于切片机；厂家提供的聚甲基丙烯酸甲酯材质槽无法耐受反复高压灭菌）；止血钳、剪刀、镊子
- 玻璃器皿包：两个 50 mL 烧杯和一个 25 mL 烧杯
- 分装马血清（Hyclone 供体马血清，货号 #SH 30074：Thermo Scientific）。将约 11 mL 马血清分装至 15 mL 圆锥形离心管中。（实际需要 10 mL 血清；由于血清解冻时会产生气泡，因此需准备 11 mL 以便准确吸取所需的 10 mL）。将分装后的血清储存于 -20°C 冰箱中。
- 分装培养基。培养基瓶开启后仅可稳定保存约 4 周（因 pH 会变化）。使用新鲜培养基时，组织切片的存活状态更佳。
- 我们使用三种市售培养基（以 500 mL 瓶装购买），另加马血清。培养基分别为：HMEM（Lonza Biowhittaker 最低必需培养基加 HBSS 和 HEPES，不含谷氨酰胺：目录号 #12-137F）、HBSS（GIBCO Hank's 平衡盐溶液，货号 #24020-117）和 MEM（GIBCO 最低必需培养基，货号 #12360-038）。参见表 2。
- 对每种培养基（HMEM、HBSS 和 MEM），从 500 mL 原装瓶中各取约 50 mL，分别分装至四个 50 mL 圆锥形离心管中。分装后用 Parafilm 封口膜密封所有离心管。将 MEM 储存于冰箱中，HMEM 和 HBSS 储存于室温。
- 培养用培养基由马血清、HMEM 和 HBSS 混合而成（见下文表 2）。MEM 用于洗涤步骤。
- 配制切割液（见表 3）。切割液的成分（单位：mM）为：NaCl 125，KCl 3，NaH2PO4 1.25，NaHCO3 26，CaCl2 2，MgCl2 2，葡萄糖 20。通常配制 250 mL（在容量瓶中定容）。检测渗透压（应约为 310）和 pH 值（7.2–7.3）。
后续步骤（第2步和第3步）在切片当天进行。
2. 手术、切片与器官型培养
手术操作应在与其他实验步骤隔离的独立区域进行。我们使用真空（通风）橱进行脑组织取出的手术操作。半无菌条件下的操作，如脑片的切割及对脑片和溶液的处理，则在层流罩中进行。
- 配制溶液。（这些步骤无需在无菌条件下进行，因为溶液将在后续步骤中经过滤除菌。）
- 配制切割液（见表3）。用95% O2 / 5% CO2混合气体对溶液通气至少20分钟（以稳定pH并确保所有盐类完全溶解）。加入1 mM丙酮酸（代谢抑制剂）和0.6 mM抗坏血酸（抗氧化剂）。
- 解冻一份马血清（11 mL）。
- 准备超净工作台（所有操作均需佩戴手套，并用乙醇充分润湿手套）。本节中，我们将准备操作区域，以提供一个洁净、半无菌的工作环境。同时，我们还将对溶液进行过滤以实现灭菌。
- 使用紫外灯照射约1小时，以对超净工作台内的工作区域进行灭菌（紫外光会损伤塑料部件，因此需用灭菌纸覆盖后续用于切片的Campden Vibroslice切片机，见下文）。用70%乙醇清洁所有表面（切片机的塑料旋钮除外：乙醇会对其造成损害）。通常放置在超净工作台内的物品还包括移液器和移液管、乙醇瓶、胶水，以及连接95% O2 / 5% CO2和100% O2气体的管路。
- 将以下物品置于超净工作台内：
- 已高压灭菌的切片用具包
- 250 mL切割液
- Millipore Express Plus滤器：250 mL [0.2 μm滤器（#SC6PU02RE），用于过滤切割液]
- 培养基组分：
- 20 mL HMEM
- 10 mL HBSS
- 10 mL马血清
- 玻璃器皿包：已高压灭菌的烧杯
- 50 mL MEM洗涤培养基
- 移液器（Drummond pipet-aid）
- 七根塑料转移移液管（Fisher #13-711-20）。这些移液管用于转移脑片和溶液，也可作为气体（O2；95% O2 / 5% CO2）通入溶液和培养基进行鼓泡的导管。
- 氰基丙烯酸酯胶水
- 刀片或剪刀（用于切割塑料）
- 无菌#22手术刀片
- Millicell细胞培养插件（0.4 μm孔径，30 μm直径，#PICM 03050），每6孔板使用3个插件
- 6孔培养板（Corning: Costar #3516）
- 使用250 mL Millipore滤器（见上文）过滤已配制的250 mL切割液。
将40 mL切割液分装至一个50 mL烧杯中。将该40 mL分装液与剩余的210 mL切割液一同放入-20°C冰箱冷冻。目的是在取出脑组织后，使用这些溶液作为约4°C的冰浆混合物接收脑组织（40 mL烧杯中的溶液用于接收，210 mL用于切片）。 - 将金属切片室（用高压灭菌纸覆盖）放入-20°C冰箱。这有助于在切片过程中保持切割液和脑组织处于低温状态。
- 配制培养基并加入孔板中（切勿对培养基进行鼓泡——会引起泡沫）。
- 在50 mL塑料离心管中配制40 mL培养基：
- 混合20 mL HMEM + 10 mL HBSS + 10 mL马血清分装液（见表2）
- 使用50 mL Millipore Steriflip 0.22 μm滤器（#SCGP00525）过滤培养基（以实现灭菌）。
- 将1.1 mL培养基加入6孔板中呈对角线分布的3个孔内（Corning: Costar #3516 6孔培养板）。将6孔板/培养基放入37°C培养箱中至少1小时。
- 在50 mL塑料离心管中配制40 mL培养基：
- 使用无菌剪刀或刀片，将4根转移移液管剪短（用于转移脑片）。剪断的管口无需进一步处理，可直接用于向溶液中通入气体进行鼓泡。这些管子连接来自95% O2/5% CO2或100% O2气瓶的管路与溶液。
- 使用50 mL Millipore Steriflip 0.22 μm滤器（#SCGP00525）过滤洗涤培养基（50 mL）。将洗涤培养基放入冰箱冷藏。
- 手术前准备。手术结束后必须立即准备好溶液以接收脑组织（在真空罩内），并快速进行切片及培养前处理（在超净工作台内）。我们将在真空罩下进行手术。为避免毛发和体液污染半无菌的超净工作台，手术应在独立区域进行。
- 准备培养基和溶液。
- 从冰箱中取出装有40 mL切割液的50 mL烧杯，置于真空罩下，用于接收取出的脑组织。倒出约10 mL该低温切割液至25 mL烧杯中，用于将脑组织转移至超净工作台。
- 将210 mL切割液从冰箱中取出，置于超净工作台内（用于切片和脑片收集）。
- 将金属切片室从冰箱中取出，置于超净工作台内。
- 用95% O2 / 5% CO2混合气体对两种切割液进行鼓泡（使用剪短的塑料转移移液管连接管路与溶液）。
- 将以下物品置于真空罩下（30 mL切割液已存在并正在用95% O2 / 5% CO2鼓泡）：
- 已高压灭菌的25 mL烧杯
- 已高压灭菌的手术器械、手套、镊子
- 从冰箱中取出洗涤培养基，并用100% O2进行鼓泡（使用剪短的塑料转移移液管末端连接管路与溶液）。
- 准备培养基和溶液。
- 手术（在真空罩下进行）。此步骤用于取出脑组织以便后续切片。重要的是尽量缩短动物处死后至将脑组织放入冷的、含氧切割液之间的时间。同时，应尽量减少对脑组织的机械损伤。所有实验程序均已获得田纳西大学健康科学中心动物护理与使用委员会批准。
- 我们使用P6-P17日龄的Sprague-Dawley大鼠（偏好P8-P10日龄）。将大鼠放入一个带盖的2-4 L塑料容器中。为实施麻醉，将约1 mL异氟烷滴加在位于塑料网下方的纱布上（确保麻醉剂不直接接触动物）。使用异氟烷麻醉大鼠直至其失去反射反应。用乙醇充分润湿手套。
- 大鼠麻醉后，用大号手术刀断头并取出脑组织。将脑组织放入盛有30 mL冷切割液（约4°C）的烧杯中约30秒。小心地将脑组织转移至25 mL烧杯中，以尽量减少毛发或血液带入超净工作台。
- 更换手套（用乙醇充分润湿）。
- 将盛有低温切割液的脑组织（置于25 mL烧杯中）转移至超净工作台。
- 切片并准备培养。此步骤中，我们将对脑组织进行定位、去除不需要的脑组织、切片并收集脑片。随后清洗脑片，将每一片置于网格插件上，将插件放入6孔培养板中，并将培养板（含脑片）转移至培养箱中进行培养。
- 定位并修整脑组织（去除小脑和额极，在额叶皮层端约一半位置做部分正中矢状切口。这样可同时切出两个脑片——分别来自左右半球——但尾端仍保持两半球相连，以提供稳定的基底用于粘附到切片台上）。用氰基丙烯酸酯胶将修整后的脑组织粘附在切片台上。将额叶皮层朝上放置，切取额顶叶皮层的冠状切片。根据需要使用手术刀进行额外切割以控制切片大小。
- 将带有脑组织的切片台放入已灭菌的金属切片室（该切片室连接振动式组织切片机），并向浴槽中加入冰冷的、持续鼓泡的切割液。将剩余的约30 mL切割液倒入一个50 mL烧杯中（用于收集脑片），并用95% O2 / 5% CO2进行鼓泡。
- 使用振动式组织切片机（Campden Vibroslice #MA572：World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA）切取250-300 μm厚的脑片。将切下的脑片放入盛有30 mL切割液的烧杯中。收集所需数量的脑片用于培养（通常为3-6片），并额外多切几片备用。
- 清洗脑片：在35 mm塑料培养皿中加入约2 mL洗涤培养基。将所有脑片从切割液转移至含洗涤培养基的塑料培养皿中。每次使用新鲜洗涤培养基，共清洗3次。使用不同的转移移液管分别进行脑片转移、添加培养基和吸除废液。
- 将脑片转移至培养基中（置于另一个35 mm塑料培养皿中；使用新的转移移液管）。打开网格插件包装的上盖，但保持插件仍在包装内。
- 使用剪短的转移移液管将脑片从培养基转移至网格插件上：将脑片置于插件中央（见图1A）。会有少量培养基随脑片一同转移。使用未剪短的转移移液管，在脑片放置到插件后立即吸除多余培养基。尽量将脑片置于插件中心（这有利于后续基因枪转染，并便于日后取出脑片进行记录）。
- 将带有脑片的网格插件放入6孔板的培养基中（见图1B）。注意避免网格下方产生气泡。当3个插件/脑片放入6孔板后，将6孔板放回培养箱。在37°C培养箱中孵育脑片约1小时。
- 使用基因枪（Bio-Rad Helios）转染脑片。可在切片后立即进行，也可在将脑片置于6孔板的网格上后立即操作；但我们通常先在37°C孵育1小时以稳定脑片状态，然后再进行转染。有关cDNA“子弹”制备及基因枪使用的详细方案，请参见参考文献17-22。
- 装载含有“子弹”的塑料“弹夹”。（我们将包被cDNA的金颗粒称为“子弹”，因此多个“子弹”被装入一个塑料“弹夹”中。）第一个位置留空（不装“弹夹”）。每隔一个位置装入一个含cDNA包被“子弹”的弹夹。将弹夹架放入基因枪中。
- 在不装弹夹的情况下发射一次枪管以清枪。
- 推进枪管至装有弹夹的位置。从培养箱中取出6孔板，置于超净工作台下。将基因枪垂直持于6孔板上方，以约100 psi压力射击。
- 推进枪管，清枪，重复操作。每片脑片射击一次。
- 射击完成后，将含脑片/插件的6孔板放回培养箱。
- 培养脑片（在半无菌条件下）。所有对脑片和6孔板的操作均需佩戴经乙醇润湿的手套，并在用乙醇清洁后的超净工作台内进行。我们将脑片培养不同时间（通常为2-7天），以使其从急性切片操作中恢复，并为转染后新蛋白的表达提供时间。
- 在培养箱（Forma Scientific型号#3110）中于37°C、5% CO2条件下培养2-7天。
- 每隔一天更换一次培养基：向三个未使用的孔中加入新鲜培养基，放回培养箱至少1小时。使用经乙醇清洁的弯头镊子将脑片/膜转移至新孔中。吸除旧培养基。将培养板放回培养箱。
3. 在脑片中记录锥体细胞
本方案不涉及全细胞记录技术的详细操作说明。我们提供将脑片转移至记录浴槽的方法，并详细介绍我们的记录装置，特别是与识别用于记录的转染细胞相关的内容。
- 使用 Sutter P-87 水平拉制仪，从 Harvard GC150TF-10 玻璃毛细管中拉制电极。电极在细胞外溶液中的阻抗为 2–6 MΩ。电极内充 KMeSO4 内液（见表 3）。
- 佩戴手套。从培养箱中取出 6 孔板。在超净台内，使用经乙醇清洁的弯头镊子小心取出一个脑片/网格插件。将 6 孔板放回培养箱，并将待记录的脑片转移至记录区域。在本实验中，该区域位于另一个实验室。我们使用带盖的 35 mm 塑料培养皿携带网格插件/脑片。此步骤完成后，无需再佩戴手套（无污染培养物或培养箱的风险）。
- 使用 #11 手术刀片切割去除膜。在镊子或柔性金属条提供的张力下进行切割（必要时可用剪刀完成最后的切割）。使用镊子将附着网格的脑片转移至 Olympus BX50 WI 直立显微镜载物台上的记录浴槽中。
- 我们使用 Axon Instruments Multiclamp 700B 放大器及 PClamp 10 中的数据采集程序。电极位置由 Sutter ROE-200 操纵器和 PC-200 控制器控制。使用配备红外微分干涉（IR-DIC）光学系统的 Olympus BX-50WI 直立显微镜观察 II/III 层或 V 层的锥体神经元。采用单个红外敏感相机（Olympus OLY-150 或 DAGE-MTI）和 ProVideo 1201B 显示器观察脑片中的细胞。脑片浸没在以 2–3 mL/min 流速灌流、温度维持在 33±1°C 的含碳合气人工脑脊液（aCSF：见表 3）中。
通常，每张脑片可发现 10–50 个转染细胞。通过显微镜目镜观察，并结合安装在物镜上方、目镜下方转盘式滤光片轮中的 FITC 滤光片进行落射荧光观察，以定位细胞。该设置可方便地在 IR-DIC 与落射荧光模式之间切换，用于判断细胞类型、确认细胞是否转染（转染细胞在落射荧光下呈绿色并含有“子弹”状结构）以及评估细胞健康状态（细胞呈三维形态、表面光滑、细胞核无肿胀、细胞未膨胀或皱缩）。
我们以 II/III 层或 V 层的锥体神经元为靶细胞（见图 1）。锥体细胞的鉴定依据包括：存在向 I 层延伸的顶树突、大量树突棘以及梨形胞体。脑层位置根据细胞密度及相对于软脑膜的位置确定。通常，位于脑片表面的转染细胞健康状况较差。尽管在组织切片中观察深层细胞比急性脑片更困难，但我们通常仍可观察到位于脑片表面下 20–50 μm 处的健康转染细胞。我们采用标准全细胞记录方法。在视觉引导下，施加正压，以电压钳模式接近细胞。在电压钳模式下，通过轻柔抽吸（使用 1 mL 注射器）形成高阻封接。当封接电阻达到 GΩ 级后，进一步施加抽吸以破入细胞。随后在电流钳或电压钳模式下进行记录。
记录结束后，我们验证所记录细胞是否呈绿色、是否含有“子弹”状结构，并在施加负压或正压时产生可见反应。为控制不同脑片、细胞层、手术时年龄及培养时间等因素带来的变异，我们始终将转染细胞的记录结果与来自同一层、距离转染细胞 50 μm 范围内的未转染对照细胞的记录结果进行配对比较。
4. 典型结果：
图1A 显示一个急性制备的脑片放置在膜上，准备插入6孔板中进行培养。该脑片包含P10大鼠幼鼠的运动皮层和体感皮层。图中右侧为软脑膜，左侧为白质和纹状体。图1B 显示脑片/膜置于孔板内，浸没于约1.1 mL培养基中。我们进行器官型培养的目标是：保留皮层正常的分层结构，防止培养过程中表面干燥，并最终在培养数天后获得较高比例的活细胞（细胞无皱缩或肿胀，肿胀的细胞核极少，细胞在红外微分干涉（IR-DIC）光学下呈现光亮且立体的形态），以便进行电生理记录。图1C 显示培养3天后体感皮层器官型脑片中第III层锥体神经元的红外微分干涉（IR-DIC）和落射荧光图像（来自P10动物）。图1D 为另一脑片的落射荧光图像，显示多个第V层细胞转染了编码绿色荧光蛋白（GFP）的cDNA（绿色细胞）。
图2显示了经过3天器官型脑片培养（P10动物）后，第V层锥体细胞在电流钳和电压钳记录中的代表性轨迹。图2A显示了一个超射的动作电位（AP）。图2B显示在给予2秒、400 pA的恒定电流刺激时产生的重复放电。这些轨迹表明该第V层规则放电神经元具有正常的电生理特性（另见表1）。图2C是在存在1 μM河豚毒素（TTX）的情况下，对第V层锥体神经元进行的电压钳记录，以阻断电压门控性Na+电流。这些轨迹是在保持电位为-70 mV时，给予持续500 ms、步长为10 mV、电位范围从-90 mV至+70 mV之间的电压阶跃所诱发的一系列电流响应。
图 1. 组织切片培养。 A. P10 大鼠感觉运动皮层切片置于 Millicell 滤膜插件上。右侧为软脑膜，左侧为深层白质和纹状体，中线位于上缘。B. 三个切片及滤膜插件浸没于约 1 mL 培养基中，并置于 6 孔板的非相邻孔中（与 A 来自同一只动物）。C. 组织切片培养中第 III 层新皮层锥体细胞的红外微分干涉（IR-DIC，上图）和落射荧光（下图）图像（P10 动物，培养 3 天）。注意 DIC 图像中可见的“弹头”结构（黑色球状物）。D. 通过基因枪转染 GFP cDNA 后，多个第 V 层神经元的荧光图像。
图 2. 器官型脑片培养中新生皮层锥体细胞的记录。 A. 对第 III 层锥体细胞（来自 P10 动物，培养 3 天后）施加超阈值 10 ms 电流刺激所引发的动作电位。B. 另一第 V 层锥体神经元（P10 大鼠，培养 3 天后）在 2 s、400 pA 电流刺激下产生的重复放电。该神经元表现为规则放电型。C. 另一第 V 层锥体神经元（P10 大鼠，培养 3 天后）的电压钳制记录。加入 1 μM TTX 以阻断电压门控 Na+ 电流。在保持电位为 -70 mV 的条件下，给予一系列 500 ms 电压阶跃刺激（右侧为刺激方案），记录到外向的 K+ 电流。电压值已校正 +10 mV 液体结电位。通路电阻约为 9 MΩ。未对串联电阻或膜电容进行补偿。
表1. 对照组与GFP转染锥体细胞的相似电学特性 （p10大鼠脑片；器官型切片：3-4天） 体外）。 平均值 ± 标准误（细胞数量）。RMP = 静息膜电位，Rn = 输入电阻，AP = 动作电位；Vth = 动作电位的电压阈值；HW = 半幅动作电位宽度。
| 处理 | 静息膜电位 (mV) | 输入电阻 (MΩ) | 动作电位幅度 | 阈值电位 (mV) | 半宽 (ms) |
| 对照 | -72 ± 1 (21) | 119 ± 17 (11) | 84 ± 2 (24) | -45 ± 1 (21) | 1.7 ± 0.1 (19) |
| 仅 GFP | -77 ± 1 (9) | 123 ± 7 (5) | 87 ± 2 (24) | -45 ± 2 (9) | 2.1 ± 0.2 (7) |
表2. 商业培养基。 这些培养基购入后未经修改直接使用（其成分可从生产商网站获取）。
1洗涤液：MEM (GIBCO#12360)
培养液：20 mL HMEM1 (Lonza Biowhittaker)，加入 10 mL HBSS1 (Gibco, 24020-117) 和 10 mL 马血清1 (Hyclone #SH 30074.03)
表3. 溶液（浓度单位为 mM）。
切割液：125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 葡萄糖（pH 7.4, 310 mOsm/L）。
人工脑脊液 aCSF（细胞外记录）：125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 葡萄糖（pH 7.4, 310 mOsm/L）。
记录内液（电流钳）：130.5 KMeSO4, 10 KCl, 7.5 NaCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, 2 ATP, 0.2 GTP, 0.1 EGTA（pH 7.2, 285–295 mOsm/L）。
记录内液（电压钳）：55 KMeSO4, 55 KOH, 2 MgCl2, 20 HEPES, 6 磷酸肌酸, 4 ATP, 0.5 GTP, 10 BAPTA, 0.1 亮肽素（pH 7.2, 285–295 mOsm/L）。
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讨论
我们一直在研究大鼠新皮层锥体神经元中电压门控性钾通道的表达及其功能作用（4, 9-11）。由于目前缺乏针对这些通道的特异性药理学工具，我们采用遗传学方法来调控通道的表达（1,14,15,17-19）。我们采用一种改良自Stoppini et al.（16）的器官型脑片培养方法（2,3;5-8;12,13,15-22），以维持细胞形态以及皮层的分层结构。我们在出生后第6至17天获取急性新皮层脑片，并在体外培养2至7天。这种方法使我们能够研究与急性脑片实验中年龄相近的神经元，同时最大限度地减少脑片中过度兴奋性连接的形成。我们通过红外照明（IR）结合微分干涉差显微镜（DIC）技术，在电流钳或电压钳模式下对II/III层或V层中视觉识别的锥体神经元进行全细胞膜片钳记录。通过基因枪（Biolistic）转染野生型或突变型钾通道DNA，调控通道表达以研究其功能（1,14,15,17）。通过与GFP的cDNA共转染，可在落射荧光显微镜下轻松识别转染的细胞。我们将同一脑片同一皮层层中相邻的未转染神经元作为对照，与转染细胞的记录结果进行比较（1,17）。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Mayumi Sakuraba 和 Rebecca Foehring 提供出色的技术支持。此外，我们感谢 Rodrigo Andrade 博士在实施器官型脑片培养和基因枪转染实验方案方面提供的帮助，以及 Jeanne Nerbonne 博士为我们提供用于转染的 cDNA 构建体。本研究工作由美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS）资助：NIH 基金项目 NS044163（资助对象：RCF）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
手术 / 转染 / 培养
媒体：
第6-8项物品购自：Fisher Scientific，1241 Ambassador Blvd，P.O. Box 14989，St. Louis，MO 63132。 记录：
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参考文献
- Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).
- Buonomano, D. V. Timing of neural responses in cortical organotypic slices. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).
- Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex. Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).
- Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons. Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
- Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
- Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue. Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).
- Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones. J Physiol. 571, 371-389 (2006).
- Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).
- Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons. J Physiol. 581, 941-960 (2007).
- Johnson, H. A., Buonomano, D. V. A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes. Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).
- Johnson, H. A., Buonomano, D. V. Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices. J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).
- Malin, S. A., Nerbonne, J. M. Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons. J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).
- O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons. J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).
- Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons. J Neurochem. 75, 882-885 (2000).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- O'Brien, J. A., Lummis, S. C. Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun. Nat Proc. 1, 977-981 (2006).
- Joshi, P., Dunaevsky, A. Gene gun transfection of hippocampal neurons. J Vis Exp. , (2006).
- Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).
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