流式细胞术纯化小鼠减数分裂细胞

摘要

本文介绍了一种从小鼠睾丸中高效获取高纯度且具有活性的减数分裂细胞组分的方法，该方法结合了优化的细胞解离方案与荧光激活细胞分选技术（FACS）。此方法利用了不同减数分裂阶段细胞在DNA含量和细胞核密度上的差异。

摘要

睾丸中细胞类型的异质性以及缺乏减数分裂的细胞培养模型，一直是研究减数分裂期间特异性分化程序的重大障碍。目前已开发出两种主要方法，可在不同程度上从成年和未成熟动物中纯化各种减数分裂期细胞组分：离心淘析法或使用牛血清白蛋白（BSA）和/或Percoll梯度的Staput（沉降）法。这两种方法均依赖细胞的大小和密度来分离减数分裂细胞^1-5。总体而言，除少数细胞群体外⁶，这些方案难以获得足够纯度的多种减数分裂细胞群体，而后者是进行详细分子分析所必需的。此外，这些方法通常一次只能纯化一种类型的减数分裂细胞，这在比较减数分裂细胞样本时，进一步增加了实验可重复性和均一性的复杂性。

本文介绍了一种经过优化的方法，通过结合Hoechst 33342染色与流式细胞分选技术（FACS），可简便地对从生殖细胞到圆形精子细胞的减数分裂细胞进行可视化观察、鉴定与纯化^7,8。该方法能够全面呈现整个减数分裂过程的概貌，并可实现对减数分裂大多数阶段的活细胞进行高度纯化。随后，可对这些纯化的细胞进行深入分析，以研究伴随减数分裂进程发生的分子变化，例如基因表达的变化^9,10，以及减数分裂重组热点区域核小体占据动态的变化¹¹。

方案

该方案可分为两个主要步骤：（1）小鼠睾丸细胞的解离及Hoechst 33342染色，随后如有需要，（2）通过FACS分选生殖细胞中与减数分裂相关的各阶段细胞组分，包括从精原细胞到圆形精子细胞的整个减数分裂过程。收集后，这些高度富集的减数分裂细胞群体可用于多种分析。本方案描述的是单个成年小鼠睾丸的解离过程；对于幼鼠或多个睾丸，可相应调整体积。

1. 睾丸解离

1. 将一个去囊睾丸放入一个15 ml的离心管中。
2. 加入3 ml含有120 U/ml I型胶原酶的盖氏平衡盐溶液（GBSS）。
3. 加入10 μl DNA酶I（1 mg/ml的储存液，溶于50%甘油），用手剧烈震荡，直至观察到睾丸小管开始解离。
4. 在33°C下以不超过120 rpm的速度水平振荡15分钟。
5. 室温下垂直静置1分钟，弃去上清液。
6. 重复步骤1.2至1.5。
7. 加入2.5 ml含有I型胶原酶的GBSS、50 μl溶于1 mM盐酸溶液的50 mg/ml胰蛋白酶储存液，以及10 μl DNA酶I（1 mg/ml），并反复倒置混匀数次。
8. 在33°C下以不超过120 rpm的速度水平振荡15分钟。
9. 使用带有宽口的塑料一次性巴斯德吸管，轻柔吹打3分钟，此时不应有可见的团块。
10. 加入30 μl胰蛋白酶、10 μl DNA酶I，以及40 μ....

讨论

本文所述方案能够从成年雄性小鼠中同时分离出整个减数分裂阶段的细胞，且纯度极高，使研究人员能够研究这一基本生物学过程的动态变化。所获得的纯化细胞可用于多种实验，包括RNA提取^9,10、核小体定位¹¹、重组分子检测、蛋白质分析等。然而，检测方法需根据所获得的减数分裂细胞数量进行相应调整。此外，由于该方法具有高度可重复性，可将不同日期独立分选的同一种细胞组分合并，以增加特定实验所需的材料量。同时，该方法为研究人员提供了减数分裂全过程的独特可视化图谱，可快速评估基因敲除、发育进程异常，或任何旨在影响减数分裂的处理（例如，辐照或小分子抑制剂处理）所产生的效应。

本方案中的关键步骤包括：(i) 使用足量的 DNA 酶，这能有效防止细胞结团和聚集，从而极大地方便细胞分选；(ii) 保持 Hoechst 33342 染色的一致性，这对于有效区分不同减数分裂阶段的细胞群体至关重要。此外，流式细胞分选（FACS）操作人员应熟悉减数分裂细胞分选的具体操作和特殊性，以便对仪器进行最佳设置，获得视频中详述的、如图1

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ⅰ型胶原酶	Worthington Biochemical	CLSS1	用GBSS溶解至12,000U/ml，4°C保存
胰蛋白酶	Worthington Biochemical	TRL3	用1mM HCl溶解至50mg/ml，4°C保存
H–chst 33342	Acros Organics	230001000	饱和溶液（DMSO中10mg/ml），4°C保存
DNase I	Sigma-Aldrich	DNEP	用水/50%甘油溶解至1mg/ml，-20°C保存
Gey’s平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	G9779
6" 转移吸管	Fisher Scientific	137119D