本文介绍了一种从小鼠睾丸中高效获取高纯度且具有活性的减数分裂细胞组分的方法，该方法结合了优化的细胞解离方案与荧光激活细胞分选技术（FACS）。此方法利用了不同减数分裂阶段细胞在DNA含量和细胞核密度上的差异。
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摘要
摘要
睾丸中细胞类型的异质性以及缺乏减数分裂的细胞培养模型，一直是研究减数分裂期间特异性分化程序的重大障碍。目前已开发出两种主要方法，可在不同程度上从成年和未成熟动物中纯化各种减数分裂期细胞组分：离心淘析法或使用牛血清白蛋白（BSA）和/或Percoll梯度的Staput（沉降）法。这两种方法均依赖细胞的大小和密度来分离减数分裂细胞1-5。总体而言，除少数细胞群体外6，这些方案难以获得足够纯度的多种减数分裂细胞群体，而后者是进行详细分子分析所必需的。此外，这些方法通常一次只能纯化一种类型的减数分裂细胞，这在比较减数分裂细胞样本时，进一步增加了实验可重复性和均一性的复杂性。
本文介绍了一种经过优化的方法，通过结合Hoechst 33342染色与流式细胞分选技术（FACS），可简便地对从生殖细胞到圆形精子细胞的减数分裂细胞进行可视化观察、鉴定与纯化7,8。该方法能够全面呈现整个减数分裂过程的概貌，并可实现对减数分裂大多数阶段的活细胞进行高度纯化。随后，可对这些纯化的细胞进行深入分析，以研究伴随减数分裂进程发生的分子变化，例如基因表达的变化9,10，以及减数分裂重组热点区域核小体占据动态的变化11。
方案
该方案可分为两个主要步骤：（1）小鼠睾丸细胞的解离及Hoechst 33342染色，随后如有需要，（2）通过FACS分选生殖细胞中与减数分裂相关的各阶段细胞组分，包括从精原细胞到圆形精子细胞的整个减数分裂过程。收集后，这些高度富集的减数分裂细胞群体可用于多种分析。本方案描述的是单个成年小鼠睾丸的解离过程；对于幼鼠或多个睾丸，可相应调整体积。
1. 睾丸解离
- 将一个去囊睾丸放入一个15 ml的离心管中。
- 加入3 ml含有120 U/ml I型胶原酶的盖氏平衡盐溶液（GBSS）。
- 加入10 μl DNA酶I（1 mg/ml的储存液，溶于50%甘油），用手剧烈震荡，直至观察到睾丸小管开始解离。
- 在33°C下以不超过120 rpm的速度水平振荡15分钟。
- 室温下垂直静置1分钟，弃去上清液。
- 重复步骤1.2至1.5。
- 加入2.5 ml含有I型胶原酶的GBSS、50 μl溶于1 mM盐酸溶液的50 mg/ml胰蛋白酶储存液，以及10 μl DNA酶I（1 mg/ml），并反复倒置混匀数次。
- 在33°C下以不超过120 rpm的速度水平振荡15分钟。
- 使用带有宽口的塑料一次性巴斯德吸管，轻柔吹打3分钟，此时不应有可见的团块。
- 加入30 μl胰蛋白酶、10 μl DNA酶I，以及40 μl溶于DMSO的Hoechst 33342（10 mg/ml），并反复倒置混匀数次。
- 在33°C下以不超过120 rpm的速度水平振荡15分钟。
- 加入400 μl胎牛血清（FCS），通过反复倒置混匀以灭活胰蛋白酶。
- 通过加入50 μl溶于DMSO的Hoechst 33342（10 mg/ml）和10 μl DNA酶I（1 mg/ml）进行最终染色。
- 在33°C下以不超过120 rpm的速度水平振荡15分钟。
- 将解离后的睾丸样品通过两个预先用GBSS润湿的40 μm一次性滤膜，滤入一个50 ml的锥形离心管中，然后加入5 μl碘化丙啶（PI）溶液，并用一次性巴斯德吸管轻轻吹打数次以混匀样品。
- 将样品通过18号针头转移至一个5 ml塑料注射器中。更换为22号针头用于样品输送。将注射器置于冰上并避光保存，直至进行流式细胞术（FACS）处理。
2. 流式细胞分选设置与纯化
- 分选在 Becton-Dickinson Aria IIu 细胞分选仪上进行。因此，当使用不同设备时，所述条件应仅作为起始参考，特别是此前已描述过的条件7,8。
- 由于 Aria IIu 不具备紫外激光器，我们对检测 Hoechst 染色的方案进行了调整，使用 405 nm 紫色激光进行检测，同时使用 488 nm 蓝色激光进行前向散射和侧向散射检测。此外，部分滤光片经过修改，以减少红色激光的串扰，从而提高散点图的清晰度。
- 紫色激光配置为使用 450/40 nm 带通滤光片检测 Hoechst 蓝色发射光，使用 585/42 nm 带通滤光片检测 Hoechst 红色发射光。采用 502 nm 长通滤光片将蓝色与红色荧光分离。
- 使用 100 μm 喷嘴，液滴驱动频率为 28,000 滴/秒。样本阈值速率约为 4000 事件/秒。在整个分选过程中，使用温度控制功能将样本和收集管维持在 4°C。此外，样本搅拌功能以 200 rpm 运行，以防止样本在分选过程中发生沉降。
- 通常每 6 小时分选处理两到三个睾丸，可为每个细胞群收集 0.5–2.0×106 个细胞（见代表性结果部分）。
- 样本以大约 750 μl 的分装量从注射器中分选。在这些暂停期间，收集管保持在 4°C，避光保存，并在恢复分选前轻轻混匀。
- 分选后的样本收集至含有 250 μl DMEM（补充 10% FCS）的 12×75 mm 玻璃硼硅酸盐收集管中。
3. 代表性结果：
典型的流式细胞分选（FACS）图谱如图1所示。减数分裂的所有主要阶段均已标识，并在图例中予以说明。如果Hoechst 33342染色效果不理想，整体图谱将显得更加紧凑且分辨率降低。一个常见问题是DNA酶添加量不足，这会导致细胞快速聚集。在所有指定步骤中补充额外的DNA酶通常可解决此问题。DNA酶储存液（保存于-20°C）应尽量避免反复冻融，否则会导致酶活性迅速丧失。
Spo11 是一种介导减数分裂的内切酶，可引导减数分裂重组热点位点处发生双链断裂12。图 2 展示了 Spo11 缺失型睾丸的典型图谱，其中未形成双链断裂，导致减数分裂中止12；同时也展示了 13 天龄小鼠青春期前的图谱，揭示了该减数分裂首波的异步特性。应首先采用联合免疫染色方法，结合联会复合体蛋白 3（SCP3）和磷酸化组蛋白 H2AX 抗体，对分选所得的减数分裂细胞进行标准的细胞遗传学分析，以确认细胞纯度及所处减数分裂阶段的特异性标志物，具体方法见其他文献11。
图 1. 野生型减数分裂FACS图谱。A) 显示代表性散点图。图中已标出设门的细胞。注意成年睾丸样本中存在大量碎片，主要为无内容物的膜结构和精子细胞尾部。B) 代表性碘化丙啶（PI）图显示样本中PI阳性细胞极少。图中显示典型的设门区域。C) 代表性野生型Hoechst 33342 FACS图谱。图中指出了可通过该方法分离纯化用于后续研究的不同减数分裂细胞群体：精原细胞（Sp）、前细线期（pL）、细线期-偶线期（L/Z）、早期粗线期（eP）、中期粗线期（mP）、晚期粗线期（lP）、双线期（D）以及圆形精子细胞（RS）。
图 2. Spo11 缺失型与野生型小鼠第13天减数分裂 FACS 分析图谱。A) 典型的 Spo11 缺失型图谱显示明显的减数分裂阻滞，无法检测到粗线期早期之后的任何阶段。B) 13天龄野生型雄性小鼠的图谱显示出大量细线期/偶线期细胞的集中分布。通过该方法可清晰观察到，这一轮减数分裂进程具有明显的异步性。
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讨论
本文所述方案能够从成年雄性小鼠中同时分离出整个减数分裂阶段的细胞，且纯度极高，使研究人员能够研究这一基本生物学过程的动态变化。所获得的纯化细胞可用于多种实验，包括RNA提取9,10、核小体定位11、重组分子检测、蛋白质分析等。然而，检测方法需根据所获得的减数分裂细胞数量进行相应调整。此外，由于该方法具有高度可重复性，可将不同日期独立分选的同一种细胞组分合并，以增加特定实验所需的材料量。同时，该方法为研究人员提供了减数分裂全过程的独特可视化图谱，可快速评估基因敲除、发育进程异常，或任何旨在影响减数分裂的处理（例如，辐照或小分子抑制剂处理）所产生的效应。
本方案中的关键步骤包括：(i) 使用足量的 DNA 酶，这能有效防止细胞结团和聚集，从而极大地方便细胞分选；(ii) 保持 Hoechst 33342 染色的一致性，这对于有效区分不同减数分裂阶段的细胞群体至关重要。此外，流式细胞分选（FACS）操作人员应熟悉减数分裂细胞分选的具体操作和特殊性，以便对仪器进行最佳设置，获得视频中详述的、如图1
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致谢
本项目部分得到了佛罗里达州向斯克里普斯研究所提供的资金，以及美国国家普通医学科学研究所和国家儿童健康与人类发展研究所分别授予的项目编号R01GM085079和R21HD061304的资助。这是斯克里普斯研究所的第20917号论文。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ⅰ型胶原酶 | Worthington Biochemical | CLSS1 | 用GBSS溶解至12,000U/ml，4°C保存 |
| 胰蛋白酶 | Worthington Biochemical | TRL3 | 用1mM HCl溶解至50mg/ml，4°C保存 |
| H–chst 33342 | Acros Organics | 230001000 | 饱和溶液（DMSO中10mg/ml），4°C保存 |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DNEP | 用水/50%甘油溶解至1mg/ml，-20°C保存 |
| Gey’s平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| 6" 转移吸管 | Fisher Scientific | 137119D |
参考文献
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重印与许可
