我们展示了一种 体内 电穿孔转染方案，用于在多种出生后年龄段的小鼠中转染单个或少量成簇的视网膜神经节细胞（RGCs）及其他视网膜细胞类型。该方法实现了对出生后RGCs的标记与遗传操作 体内 是发育研究中的强大工具。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
视网膜神经节细胞（RGC）轴突向中脑的靶向投射及其精细化过程是研究神经连接在发育过程中如何形成精确模式的一个常用且强大的模型系统。在小鼠中，视网膜传出投射以拓扑方式排列，并在丘脑的外侧膝状体核（dLGN）和上丘（SC）形成眼特异性的分层结构。这些精确的视网膜传出投射模式的发育通常通过使用荧光染料和示踪剂（如辣根过氧化物酶1-4）标记RGC群体来进行研究。然而，这些方法分辨率不足，无法揭示个体RGC轴突分支形态在发育过程中的变化，而这些变化正是视网膜拓扑图形成的结构基础。此外，这些方法也不允许对RGC进行遗传学操作。
近年来，电穿孔已成为一种有效方法，可实现对带电分子向视网膜递送过程的精确定位和时序控制。5-11目前的视网膜电穿孔技术尚无法实现对出生后小鼠单个或少量视网膜神经节细胞（RGCs）的基因操作及其视网膜外投射通路的示踪。有观点认为，出生后 体内 电穿孔法不是转染视网膜神经节细胞（RGCs）的可行方法，因为其标记效率极低，因此需要在胚胎期对正在分化和增殖的RGC前体细胞进行靶向操作6.
在本视频中，我们描述了一种针对小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）在出生后进行基因、shRNA 和荧光葡聚糖靶向递送的 体内 电穿孔实验方案。该技术提供了一个成本低、速度快且相对简便的平台，可用于高效筛选参与神经发育多个方面的候选基因，包括神经回路发育不同阶段中的轴突回缩、分支、分层、再生以及突触形成。总之，我们在此描述了一种有价值的工具，将有助于进一步揭示感觉图谱发育背后的分子机制。
方案
1. 电穿孔设备的设置
- 电极：我们对Dumont #5 镊子进行改装，用作电极。
- 将镊子分开并拆开。
- 在每个镊臂较宽的一端焊接导线，并用绝缘胶带包裹导线连接处及镊臂，仅露出镊尖约25–30 mm。
- 使用合适的塑料间隔物（例如纽扣）将改装后的镊子重新组装，置于两个镊臂之间，以提供弹性作用。
- 电学设备：我们使用电刺激器输送电穿孔所需的电流脉冲，并使用示波器和音频监视器确认输出波形及脉冲数量。
- 将其中一个镊臂的导线连接至脚踏开关，该开关与刺激器串联。脚踏开关起到开关作用，踩下时即可接通电穿孔电路。
- 将另一个镊臂的导线连接至电刺激器。
- 将刺激器连接至示波器和音频监视器。
- 微量移液器与注射装置的设置：我们使用拉制尖细的玻璃移液器和Nanoinject II注射系统，将极小体积的染料或DNA溶液直接注射至视网膜内。
- 将注射系统安装在三维显微操作器上。
- 拉制具有长锥度和小尖端的玻璃移液器。
- 用矿物油从后方填充已拉制的移液器，并将其固定在注射装置上（具体操作详见Nanoinject II使用手册）。
- 使用锋利的显微解剖剪刀a剪去移液器尖端，形成一个小开口（约2–3 μm）。
- 通过移液器尖端加入所需量的注射溶液。只要尖端结构保持完整，同一根移液器可用于多次注射及多个动物。
注意：i) 确保移液器尖端装载了足量的注射溶液，避免将后方填充的矿物油注入眼内。ii) 本视频中使用的Nanoinject II系统及特定电子设备并非成功标记视网膜神经节细胞（RGCs）的关键。使用其他设备（如Picospritzer）进行注射，或使用其他常见刺激器进行电穿孔，同样可实现RGCs的标记。
2. 用于RGC标记的质粒溶液
- 用于标记少量RGC簇：我们使用一种在CAG启动子（鸡β-肌动蛋白启动子与CMV早期增强子）控制下编码EGFP（~2–3 μg/μL）增强型绿色荧光蛋白的载体。EGFP融合了GAP-43（生长相关蛋白-43）的棕榈酰化序列，使其靶向定位于细胞膜（mut4EGFP）12。该载体称为pCAG-gapEGFP。
- 用于单细胞标记：我们联合使用两种载体。第一种载体为CAG启动子驱动Cre重组酶表达的质粒（pCAG-Cre，Addgene [Cambridge, MA] 质粒13775）13；第二种载体包含一个两侧带有loxP位点的STOP序列，其后接膜定位EGFP（pCAG-LNL-gapEGFP）。pCAG-Cre（~0.15 ng/μL）的使用浓度比pCAG-LNL-gapEGFP（~1–2 μg/μL）低约1,000至10,000倍，从而通过较低浓度的pCAG-Cre将强烈的EGFP表达限制在极少数细胞中。
3. 视网膜注射与电穿孔实验方案
- 出生后第0天（P0）至P5的幼鼠采用低温麻醉，而P5以上的幼鼠则通过腹腔注射（0.7 ml/kg）氯胺酮（4.28 mg/mL）、赛拉嗪（0.82 mg/mL）和乙酰丙嗪（0.07 mg/mL）混合物进行麻醉14.
- 将所有手术器械和电极尖端在高温珠灭菌器中灭菌，随后在使用前置于无菌生理盐水中冷却，以避免对眼睛造成热损伤。
- 将小鼠置于解剖显微镜下，并调整注射器位置。
- 对于出生后14天以内（P14，眼睑未睁开）的小鼠，使用显微解剖弹簧剪沿未来眼睑 opening 的全长剪开眼睑进行手术暴露b.
- 用镊子尖端轻轻按压眼球周围，使眼球部分突出c.
- 通过轻轻捏住眼球周围的皮肤来固定眼睛的位置。
- 调节显微操作仪，将移液管移至眼球附近。
- 踩下与Nanoinject II系统相连的脚踏板，排出数滴注射液，以确认移液管未堵塞。
- 一手固定眼球，移动显微操作仪，使玻璃移液管的尖端穿透视网膜色素上皮并进入视网膜。
- 通过踩下Nanoinject II系统的脚踏板，注入所需体积的溶液。例如，为标记单个RGC，我们进行一次2.3–4.6 nL的注射。
- 收回移液器，将电极尖端小心地置于注射部位正上方，踩下刺激器的脚踏开关以接通电路，对眼球进行电穿孔。我们通常采用方波脉冲，参数设置为25 V电压、50毫秒持续时间，脉冲间隔1秒。对于出生后第4天以上的幼鼠，施加10次脉冲（每种极性各5次）；对于出生后第0至第3天的幼鼠，施加6次脉冲（每种极性各3次）。
- 轻柔地将眼球推回眼窝，并在切开的眼睑上涂抹无菌眼科软膏。
- 将动物置于温度可控的加热垫上，在其完全恢复（包括充分复温及活动能力）后，将其放回母体身边。
- 每12小时监测动物一次，观察是否存在疼痛、痛苦或不适的迹象，例如活动能力丧失、姿势异常或无法正常理毛。不得对同一动物重复进行多轮麻醉、注射和电穿孔操作。
4. 注意事项
- 本视频中描述的注射方法是一种“盲法”注射。在使用白化小鼠和有色溶液（DiI 或含有少量快蓝的质粒溶液）时，可以观察到注射的剂量和位置。然而，对于有色小鼠品系，无法直接观察注射位置，因此很难口头描述是否已到达目标视网膜位置，或应将移液管移动多远以精确定位于视网膜神经节细胞（RGC）层。因此，我们强烈建议新用户首先在白化小鼠中进行 DiI 注射，因为这些注射可在视网膜中立即可视化，且 RGC 向视网膜和脑部的投射标记可用于评估注射质量。为局灶性注射，准备 10% DiI 溶于 N,N-二甲基甲酰胺（100%）的溶液。掌握此操作后，用户应能持续在有色小鼠中使用清晰的 DNA 质粒溶液靶向 RGCs。
- 本视频中描述的注射方法可用于进行局灶性 DiI 注射，以标记少量细胞用于研究视网膜拓扑投射（4.6nL 可标记数百个 RGCs）14，也可用于通过霍乱毒素 B 亚基偶联的荧光染料（Alexa555、488 等）对 RGCs 进行大范围标记，以研究眼特异性分离，此应用中可省略上述第10步的电穿孔步骤。建议对 P14 以上小鼠的总注射体积不超过 2–3µL，P14 以下小鼠不超过 1–2µL。
- 可先将待注射溶液从移液管后端填充，然后在将移液管安装到注射器并断裂尖端前，再用矿物油进行后向填充。此方法在使用高浓度 DNA 溶液（约 6µg/µL）时尤为有用，因为此类溶液通常黏稠，难以从移液管尖端加载。
- 若玻璃移液管发生堵塞，应使用浸有水的棉签小心擦拭 DNA 溶液的移液管尖端，或使用浸有乙醇（100%）的棉签擦拭染料（DiI）溶液的移液管尖端。
- 在眼球内注射后，将移液管尖端从眼球中撤出，并踩下脚踏开关再次注射，以确认尖端在注射过程中未被堵塞。若无溶液排出，注射很可能未成功。但此现象不应被视为注射失败的绝对指标。若需在同一只眼内实现多个注射位点或标记更多细胞，实验者可对该眼再次进行注射。
- 为标记单个 RGC，应在 Nanoinject 控制盒上将注射速度设为“慢速”。此设置可进一步减少注入视网膜的溶液量，因为系统在此模式下释放溶液所需时间更长，同时玻璃移液管尖端正快速从眼球中撤出。
- 对出生后第 0 至 3 天（P0 至 P3）的小鼠进行电穿孔需格外小心，因为极易损伤眼球（在恢复数天后即可明显观察到眼球明显小于正常）。建议对早期新生小鼠减少脉冲次数和施加电压。P4 之后，眼球对电穿孔造成的损伤更具耐受性。
- 根据我们的经验，用于观察视网膜传出投射至脑部的膜定位型 EGFP 或 RFP（“gapEGFP”，见12）远优于未修饰的 GFP。然而，缺乏膜定位修饰的 pCAG-tdTomato 也表现良好（图 1E）。此外，也可使用上述电穿孔方案，通过葡聚糖偶联的荧光染料对 RGCs 进行标记。
- 通常情况下，每 10 次注射中有 9 次可成功标记 RGCs，但采用双质粒方法时，仅有约 15% 的注射能实现仅标记单个 RGC。通过在单眼内多个位置注射 DNA，或向每只眼分别注射编码不同荧光蛋白的质粒，可提高成功案例的数量。
5. 代表性结果
在P2至P25的所有年龄段均观察到RGC标记，电穿孔后24小时即可在RGC中检测到EGFP标记，转染后至少维持表达三周。
单个视网膜神经节细胞（RGCs）的荧光标记树突（图1A、B）和轴突分支（图1F）可以被清晰地观察和重建。
除了视网膜神经节细胞（RGCs）外，该技术还可用于标记其他视网膜细胞类型，如水平细胞、双极细胞以及多种无长突细胞亚型（图1C）
该方法不会干扰视觉图精炼的正常时间进程，这一点已通过上丘中正常的视网膜拓扑结构得到证实（图1E）。
在各个年龄段中，约90%的情况下，向视网膜神经节细胞（RGCs）注射少量液体（~2.3-4.6 nL）的pCAG-gapEGFP，可导致少数RGCs表达（图1D）。
在约15%的实验中，每只动物单次注射pCAG-Cre和pCAG-LNL-gapEGFP组合质粒，可实现单个视网膜神经元的标记，包括视网膜神经节细胞（RGCs）（图1A、B、D）以及其他细胞类型，如无长突细胞（图1C）。
图1 - A, B. 出生后第14天（P14）平铺视网膜中EGFP标记的单个视网膜神经节细胞示例（箭头指示轴突）。C. P8时期单个星形双极无长突细胞的示例。D. P14平铺视网膜中一群EGFP标记的视网膜神经元，包括视网膜神经节细胞和无长突细胞。E. 右眼的背侧和腹侧视网膜神经节细胞在P1时期通过电穿孔标记为EGFP，左眼的颞侧和腹侧视网膜神经节细胞则通过电穿孔标记为tdTomato。在P9时，标记的视网膜神经节细胞在上丘（SC）中形成的目标区域（星号标示）位于其拓扑正确的对应位置（整体染色，白色轮廓）。F. 上丘（SC）矢状切面（厚度250 μm，虚线所示）中单个EGFP标记的视网膜神经节细胞树突（二维投影）示例。为清晰起见，(D) 和 (F) 中的图像已转换为灰度并反转。比例尺（μm）：(A) - (D), (F)：100；(E)：500
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在本视频中，我们演示了一种体内电穿孔实验方案，该方法可通过编码荧光蛋白的DNA构建体，在出生后小鼠的视网膜神经元中实现单个或小簇细胞的标记。荧光标记的视网膜神经节细胞（RGC）投射至外侧膝状体背核（dLGN）和上丘（SC）的小簇投射模式，与先前使用脂溶性染料标记RGC的研究结果相似，表明电穿孔并未干扰RGC轴突分支的正常精细化过程。我们已利用该方案，在具有正常和紊乱视觉图谱的多种小鼠模型中，分析了单个及成组RGC水平上的视网膜拓扑图谱。
我们的结果表明，使用以下方法可可靠地转染出生后视网膜中已分化的视网膜神经元 体内 电穿孔。出生后 体内 此处描述的电穿孔方案可实现对视网膜神经节细胞（RGCs）进行时空受限条件下的同步标记与遗传学操作。我们通过使用编码Cre重组酶的质粒与携带floxed STOP序列的荧光报告基因质粒联合转染，实现了对视网膜神经元的有效标记。通过使Cre质粒浓度远低于报告基因质粒浓度，可实现稳定且单一神经元的转染。与传统方法相比， 在子宫内 电穿孔技术侵入性较小，且不会干扰视交叉处轴突交叉等早...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
pCAG-gapEGFP 质粒由 S. McConnell 博士（加利福尼亚州斯坦福）惠赠。pCAG-tdTomato 质粒由 M. Feller 博士（加利福尼亚州伯克利）惠赠。我们感谢 Edward Ruthazer 博士提出使用双质粒策略进行单细胞标记，感谢 Anne Schohl（加拿大魁北克省蒙特利尔）在初步研究中验证了双质粒 Cre/loxP 策略，以及 Crair 实验室成员提供的技术支持。本研究由 R01 MH62639（MC）、NIH R01 EY015788（MC）和 NIH P30 EY000785（MC）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜蒙特 #5 镊子 | 精细科学工具公司 | 11252-20 | |
| 电刺激器 | 格拉斯科技公司 | 型号 S4 | |
| 示波器 | 安捷伦科技公司 | 型号 54621A | |
| 音频监测器 | 格拉斯科技公司 | 型号 AM8B | |
| 拉针仪 | 萨特仪器公司 | 型号 P-97 | |
| 万纳斯剪刀 a | 世界精密仪器公司 | 14003 | |
| 微型剪刀 b | 特德佩拉公司 | 1347 | |
| 杜蒙特 AA 镊子 c | 精细科学工具公司 | 11210-20 | |
| Nanoinject II 注射系统 | 德拉蒙德科学公司 | 3-000-204 | |
| 玻璃移液管 | 德拉蒙德科学公司 | 3-000-203-G/X | |
| 脚踏开关 | 德拉蒙德科学公司 | 3-000-026 | |
| 矿物油 | 西格玛-奥德里奇公司 | M3516 | |
| DiI | 英维特罗根公司 | D-383 | |
| N,N-二甲基甲酰胺 | 西格玛-奥德里奇公司 | D4551 |
参考文献
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 191-204 Forthcoming.
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
