我们展示了一种 体内 电穿孔转染方案，用于在多种出生后年龄段的小鼠中转染单个或少量成簇的视网膜神经节细胞（RGCs）及其他视网膜细胞类型。该方法实现了对出生后RGCs的标记与遗传操作 体内 是发育研究中的强大工具。
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摘要
摘要
视网膜神经节细胞（RGC）轴突向中脑的靶向投射及其精细化过程是研究神经连接在发育过程中如何形成精确模式的一个常用且强大的模型系统。在小鼠中，视网膜传出投射以拓扑方式排列，并在丘脑的外侧膝状体核（dLGN）和上丘（SC）形成眼特异性的分层结构。这些精确的视网膜传出投射模式的发育通常通过使用荧光染料和示踪剂（如辣根过氧化物酶1-4）标记RGC群体来进行研究。然而，这些方法分辨率不足，无法揭示个体RGC轴突分支形态在发育过程中的变化，而这些变化正是视网膜拓扑图形成的结构基础。此外，这些方法也不允许对RGC进行遗传学操作。
近年来，电穿孔已成为一种有效方法，可实现对带电分子向视网膜递送过程的精确定位和时序控制。5-11目前的视网膜电穿孔技术尚无法实现对出生后小鼠单个或少量视网膜神经节细胞（RGCs）的基因操作及其视网膜外投射通路的示踪。有观点认为，出生后 体内 电穿孔法不是转染视网膜神经节细胞（RGCs）的可行方法，因为其标记效率极低，因此需要在胚胎期对正在分化和增殖的RGC前体细胞进行靶向操作6.
在本视频中，我们描述了一种针对小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）在出生后进行基因、shRNA 和荧光葡聚糖靶向递送的 体内 电穿孔实验方案。该技术提供了一个成本低、速度快且相对简便的平台，可用于高效筛选参与神经发育多个方面的候选基因，包括神经回路发育不同阶段中的轴突回缩、分支、分层、再生以及突触形成。总之，我们在此描述了一种有价值的工具，将有助于进一步揭示感觉图谱发育背后的分子机制。
方案
1. 电穿孔设备的设置
- 电极：我们对Dumont #5 镊子进行改装，用作电极。
- 将镊子分开并拆开。
- 在每个镊臂较宽的一端焊接导线，并用绝缘胶带包裹导线连接处及镊臂，仅露出镊尖约25–30 mm。
- 使用合适的塑料间隔物（例如纽扣）将改装后的镊子重新组装，置于两个镊臂之间，以提供弹性作用。
- 电学设备：我们使用电刺激器输送电穿孔所需的电流脉冲，并使用示波器和音频监视器确认输出波形及脉冲数量。
- 将其中一个镊臂的导线连接至脚踏开关，该开关与刺激器串联。脚踏开关起到开关作用，踩下时即可接通电穿孔电路。
- 将另一个镊臂的导线连接至电刺激器。
- 将刺激器连接至示波器和音频监视器。
- 微量移液器与注射装置的设置：我们使用拉制尖细的玻璃移液器和Nanoinject II注射系统，将极小体积的染料或DNA溶液直接注射至视网膜内。
- 将注射系统安装在三维显微操作器上。
- 拉制具有长锥度和小尖端的玻璃移液器。
- 用矿物油从后方填充已拉制的移液器，并将其固定在注射装置上（具体操作详见Na....
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讨论
在本视频中，我们演示了一种体内电穿孔实验方案，该方法可通过编码荧光蛋白的DNA构建体，在出生后小鼠的视网膜神经元中实现单个或小簇细胞的标记。荧光标记的视网膜神经节细胞（RGC）投射至外侧膝状体背核（dLGN）和上丘（SC）的小簇投射模式，与先前使用脂溶性染料标记RGC的研究结果相似，表明电穿孔并未干扰RGC轴突分支的正常精细化过程。我们已利用该方案，在具有正常和紊乱视觉图谱的多种小鼠模型中，分析了单个及成组RGC水平上的视网膜拓扑图谱。
我们的结果表明，使用以下方法可可靠地转染出生后视网膜中已分化的视网膜神经元 体内 电穿孔。出生后 体内 此处描述的电穿孔方案可实现对视网膜神经节细胞（RGCs）进行时空受限条件下的同步标记与遗传学操作。我们通过使用编码Cre重组酶的质粒与携带floxed STOP序列的荧光报告基因质粒联合转染，实现了对视网膜神经元的有效标记。通过使Cre质粒浓度远低于报告基因质粒浓度，可实现稳定且单一神经元的转染。与传统方法相比， 在子宫内 电穿孔技术侵入性较小，且不会干扰视交叉处轴突交叉等早.......
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致谢
pCAG-gapEGFP 质粒由 S. McConnell 博士（加利福尼亚州斯坦福）惠赠。pCAG-tdTomato 质粒由 M. Feller 博士（加利福尼亚州伯克利）惠赠。我们感谢 Edward Ruthazer 博士提出使用双质粒策略进行单细胞标记，感谢 Anne Schohl（加拿大魁北克省蒙特利尔）在初步研究中验证了双质粒 Cre/loxP 策略，以及 Crair 实验室成员提供的技术支持。本研究由 R01 MH62639（MC）、NIH R01 EY015788（MC）和 NIH P30 EY000785（MC）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜蒙特 #5 镊子 | 精细科学工具公司 | 11252-20 | |
| 电刺激器 | 格拉斯科技公司 | 型号 S4 | |
| 示波器 | 安捷伦科技公司 | 型号 54621A | |
| 音频监测器 | 格拉斯科技公司 | 型号 AM8B | |
| 拉针仪 | 萨特仪器公司 | 型号 P-97 | |
| 万纳斯剪刀 a | 世界精密仪器公司 | 14003 | |
| 微型剪刀 b | 特德佩拉公司 | 1347 | |
| 杜蒙特 AA 镊子 c | 精细科学工具公司 | 11210-20 | |
| Nanoinject II 注射系统 | 德拉蒙德科学公司 | 3-000-204 | |
| 玻璃移液管 | 德拉蒙德科学公司 | 3-000-203-G/X | |
| 脚踏开关 | 德拉蒙德科学公司 | 3-000-026 | |
| 矿物油 | 西格玛-奥德里奇公司 | M3516 | |
| DiI | 英维特罗根公司 | D-383 | |
| N,N-二甲基甲酰胺 | 西格玛-奥德里奇公司 | D4551 |
参考文献
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement....
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重印与许可
