用于调控细胞间相互作用的硅基微芯片

摘要

本文介绍了一种在微米尺度上动态调控贴壁细胞间相互作用的实验方法。文中展示了对肝细胞与基质细胞之间细胞间通讯的操控。该平台可用于研究多种生物过程中的细胞间相互作用，包括发育和发病机制。

摘要

人们认识到，细胞微环境在从发育到恶性转化的几乎所有哺乳动物组织中，对细胞命运和功能的决定都起着至关重要的作用。  特别是，细胞与邻近间质的相互作用已被证实参与多种生物学现象；然而，传统技术限制了对这些相互作用的空间特征和动态过程进行深入探究的能力。

在微机械可重构培养（RC）中，我们采用带有可动部件的微加工硅基底，通过机械重定位动态调控细胞间相互作用。此前，该方法已用于研究肝细胞与非实质细胞共培养中的细胞间通讯，证实了具有时间依赖性的相互作用以及可溶性信号分子作用范围的局限性¹。

本文详细描述了RC系统的制备与使用方法。首先，我们演示如何使用镊子操作装置的各个部件，包括在间隙与接触两种构型之间进行切换（细胞群之间被一个狭窄的80 µm间隙分隔，或处于直接且紧密的接触状态）。接着，我们详细说明培养基底的制备过程，以及为获得融合单层细胞所需的多步骤接种流程。通过活细胞显微镜观察，我们进一步展示了在不同实验构型之间实时操控细胞的过程。最后，我们演示了装置表面再生以实现重复使用所需的步骤：甲苯和piranha溶液清洗、聚苯乙烯涂层处理以及氧气等离子体处理。

方案

细胞培养物的制备：

1. 从经等离子体处理的聚苯乙烯涂层硅部件开始。
2. 用适当的细胞外基质蛋白包被部件，以支持目标细胞类型的贴附。对于肝细胞，在37°C下用50 µg/mL I型胶原溶液孵育45分钟；对于3T3成纤维细胞，则无需基质。
3. 将部件与互补部件以接触构型锁定。
4. 用70%乙醇浸泡至少10分钟以灭菌，随后用ddH₂O冲洗两次，再用细胞培养基冲洗一次。
5. 在适当的培养基中以500,000个细胞/mL的浓度接种细胞。每孔12孔培养板中加入1 mL细胞悬液。
6. 孵育1小时，每隔15分钟轻轻振摇一次，使细胞均匀重悬。
7. 若1小时后仍未形成融合单层，吸除细胞悬液，并使用新鲜细胞悬液重复接种。重复此步骤直至达到所需细胞密度。
8. 移除互补部件，将部件转移至新的培养孔中，过夜孵育以使细胞充分贴附和铺展。
9. 通过将适当部件以间隙或接触构型锁定，形成共培养体系。在培养过程中可于任意时间点切换构型。
10. 更换培养基时，应尽量减少细胞暴露于干燥环境的时间，最好仅一至两秒。一手吸出旧培养基的同时，另一手立即加入新鲜培养基。

硅部件再利用的处理：

1. 用漂白剂浸泡细胞并用水冲洗以去除残留物。
2. 让部件完全干燥。用甲苯浸泡2小时以去除聚苯乙烯。
3. 使用加热至120°C的piranha溶液（1:2 H₂O₂:H₂SO₄）进行清洗。
4. 在ddH₂O持续流动下冲洗15分钟。如果未立即沉积聚苯乙烯，请将部件保存在水中。
5. 将聚苯乙烯溶于甲苯中，浓度为100 mg/ml。在聚丙烯锥形管中涡旋约1小时，直至完全溶解。每10个部件需要略多于1 ml的溶液。
6. 在单个硅部件上以2,400 rpm转速旋涂聚苯乙烯溶液，持续30秒。
7. 在120°C下烘烤至少5小时。
8. 用氧气等离子体（200 mTorr，200 W）处理1分钟。

讨论

该系统的独特之处在于，能够在细胞水平上动态调控组织的空间结构。因此，该装置已实现多种新颖的生物学实验，涵盖细胞间信号传导动力学、接触介导信号与可溶性信号的比较、细胞命运决定、毒理学以及细胞间串扰等研究领域。由于培养基质为标准的组织培养塑料，且系统与常规培养方法和检测手段兼容，该装置应具有广泛的通用性。因此，我们认为该平台作为一种研究多种不同类型细胞与组织间细胞相互作用的工具，将引起广泛关注。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅梳基底	工具	不适用	不适用	相关部件可提供用于合作研究项目。请联系 Elliot Hui（eehui @ alum . mit . edu）或 Sangeeta Bhatia（sbhatia @ mit . edu）。