介绍了一种将卵巢卵泡包埋于三维纤维蛋白-海藻酸盐互穿网络的新方法。该系统结合了结构支撑与蛋白水解降解特性，可支持未成熟卵泡发育并产生成熟卵母细胞。该方法也可用于培养细胞聚集体，以维持细胞间接触，同时不限制其扩展。
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摘要
摘要
卵巢卵泡是卵巢的功能单位，可分泌性激素并支持卵母细胞成熟。In vitro 卵泡技术为研究卵泡发育的基本生物学提供了建模工具，同时正在被开发为一种临床生育力保存技术1-4。我们的in vitro 培养系统采用水凝胶，通过维持卵泡的三维结构、细胞间相互作用以及调控卵泡发育的旁分泌信号，模拟卵巢的天然微环境5。此前，卵泡已在海藻酸盐中成功培养，海藻酸盐是一种惰性的藻类来源多糖，可在钙离子作用下发生凝胶化6-8。浓度为0.25% w/v的海藻酸盐水凝胶最有利于卵泡培养，并能保持最高的发育潜能9。海藻酸盐水凝胶不可降解，因此随着卵泡直径增大，会对卵泡产生压缩力，从而影响其生长10。随后，我们开发了一种基于纤维蛋白-海藻酸盐互穿网络（FA-IPN）的培养系统，其中纤维蛋白与海藻酸盐混合后同时发生凝胶化。该组合提供了动态的力学环境：初始阶段两种组分共同贡献基质刚性；但随着卵泡生长，其分泌的蛋白酶会降解基质中的纤维蛋白，最终仅由海藻酸盐提供支撑。在该互穿网络中，海藻酸盐含量可低于0.25%，而单独使用海藻酸盐则无法实现这一浓度5。因此，随着卵泡扩张，由于固体含量降低，其所受压缩力也相应减小。本文中，我们描述了一种将卵巢卵泡包埋于FA-IPN中的封装方法及相应的in vitro 培养系统。该动态力学环境模拟了自然卵巢中卵泡的发育过程：小卵泡位于刚性较强的皮质区，随着体积增大逐渐移向更为宽松的髓质区11。该可降解组分在临床转化中可能尤为关键，因其可支持人类卵泡在体内正常发育过程中超过106倍的体积增长in vivo。
方案
1. 卵泡分离
动物实验严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》以及西北大学既定的实验动物使用与护理规程中的规定进行。
为获得最佳结果，所有解剖操作均在L15培养基中进行，以在环境CO2水平下控制pH值；使用37°C加热台控制温度，并在洁净工作台中操作以最大限度减少细菌污染。解剖培养基（DM）由添加了50 IU/mL青霉素、50 μL/mL链霉素和1%胎牛血清（FBS）的L15培养基配制而成。维持培养基（MM）由添加了50 IU/mL青霉素、50 μL/mL链霉素和1%胎牛血清（FBS）的αMEM培养基配制而成。
- 将16日龄小鼠的新鲜解剖卵巢转移至新的35 mm培养皿中，加入1-2 mL含0.1%胶原酶和0.1% DNase的MM。置于培养箱中孵育15分钟 37°C 和5% CO₂2.
- 孵育后，用DM进行多次洗涤以去除胶原酶，然后转移至含新鲜DM的35 mm培养皿中。使用两个连接一次性注射器的28½号针头，通过轻弹（或切割）方法将卵泡从整个卵巢上分离。在不破坏卵泡完整性的前提下，尽可能去除间质组织。每枚卵巢分离出20–40个次级卵泡（130–150 mm）。这些卵泡通常具有2–3层体细胞。
- 向60 mm IVF培养皿的中央小室加入1 mL MM体外 受精）培养皿的外圈加入3 mL ....
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讨论
所展示的卵巢卵泡在FA-IPN中的包封方法可实现卵泡在三维环境中的培养 体外纤维蛋白-海藻酸盐互穿网络（FA-IPN）是一种动态的、细胞响应性基质，其初始力学性能由纤维蛋白和海藻酸盐共同决定。在培养过程中，包埋的卵泡会激活蛋白酶，特异性降解IPN中的纤维蛋白组分，而保留海藻酸盐。随着培养进行，凝胶刚度逐渐降低，最终仅由剩余的海藻酸盐提供力学支撑。研究表明，FA-IPN所提供的动态力学性能更接近于发育中卵泡的天然微环境，与单独使用海藻酸盐相比，可显著提高卵母细胞减数分裂成熟率。
FA-IPN 表现出温和且快速的凝胶化特性，该系统的各个组分通过独立的机制交联。我们已在其他地方描述过5，凝胶形成的速度可通过纤维蛋白原和凝血酶的浓度进行调控。降解速率可通过抑肽酶抑制纤维蛋白降解来调节。小鼠次级卵泡通常培养 8–12 天，而其他物种的卵泡则需要更长的培养时间。因此，抑肽酶延缓纤维蛋白降解可能为更长时间的培养提供一个持续动态的环境。
所述的包封方法可应用于其他系统，例如微组织或类胚胎体的包封与培.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：U54HD41857 和 PL1EB008542，以及“肿瘤生育力联盟”路线图资助项目中的 P30 生物材料核心项目）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎球蛋白 | Sigma-Aldrich | F3385 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10082-139 | |
| 抑肽酶 | Roche Group | 10236624001 | |
| CaCl2 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00475 | 40 mM |
| 表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | A412 | |
| 重组卵泡刺激素 | 国家糖尿病、消化系统疾病和肾脏疾病研究所 | ||
| 人绒毛膜促性腺激素 | Sigma-Aldrich | CG-5 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Sigma-Aldrich | I1884-1VL | |
| L-15 培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM+Gluta MAX | GIBCO, by Life Technologies | 32561 | |
| 青霉素-链霉素 | Cellgro | 30-002-CI | |
| Tris缓冲盐溶液 | Pierce, Thermo Scientific | 28379 | |
| Tisseel 纤维蛋白试剂盒 | Baxter Internationl Inc. | 921030 | |
| 海藻酸钠 | FMC BioPolymers | LF200DL | 分子量 418 kDa |
参考文献
- Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system. Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).
- Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X.
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