通过流式细胞术对受损或病变的中枢神经系统中的细胞炎症进行定量分析时，脂质/髓鞘碎片会带来复杂性，因为这些碎片的大小和颗粒度与细胞相似，从而降低检测的灵敏度和准确性。我们改进了一种细胞制备方法，可有效去除髓鞘碎片，提高流式细胞术在损伤脊髓中对细胞的检测能力。
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摘要
摘要
使用形态学或组织学技术检测损伤的中枢神经系统（CNS）中的免疫细胞，往往无法提供对细胞炎症的真实定量分析。流式细胞术是一种快速的替代方法，可用于定量分析损伤脑或脊髓组织中的免疫细胞。传统上，流式细胞术用于定量从血液或解离的脾脏、胸腺中收集的免疫细胞，仅有少数研究尝试利用新鲜解离的脊髓组织，通过流式细胞术来定量损伤脊髓中的免疫细胞。然而，解离后的脊髓组织中含有大量髓鞘碎片，这些碎片可能被误认为细胞，从而降低流式细胞仪所获得的细胞计数的可靠性。我们改进了一种基于OptiPrep密度梯度系统的细胞制备方法，可有效将脂质/髓鞘碎片与细胞分离，从而通过流式细胞术对损伤脊髓中的细胞炎症进行灵敏且可靠的定量分析。正如我们近期研究中所述（Beck & Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47），采用OptiPrep细胞制备方法提高了检测损伤脊髓中细胞炎症的灵敏度，特定细胞类型的计数与损伤严重程度呈相关性。关键的是，该方法的创新性应用首次系统表征了脊髓损伤（SCI）后急性期与慢性期的细胞炎症反应，完整描绘了从损伤后2小时至180天（dpi）多形核白细胞（PMNs，中性粒细胞）、巨噬细胞/小胶质细胞以及T细胞的动态变化时间谱，并发现了一个出乎意料的细胞炎症第二阶段。利用该方法对细胞炎症进行系统表征，有助于更深入理解损伤中枢神经系统中的神经炎症过程，并揭示神经炎症中存在的多相性重要特征，这对于设计和实施合理的治疗策略（包括基于细胞的干预和药物干预）以治疗脊髓损伤具有重要意义。
方案
1. 脊髓组织的解离
- 按照先前所述方法1，取未损伤或脊髓挫伤（损伤位置为T9）的Sprague Dawley大鼠的T8-T10节段脊髓，在室温下用HBSS中的精细剪刀进行解剖和机械解离。在组织解离前，将完整的脊髓柱置于干冰上冷冻5分钟，然后取出T8-T10节段。
- 通过离心（1分钟，1000 rpm，室温）收集组织碎片，并在37°C下用含有2.5 mg胰蛋白酶和5 mg胶原酶的5 ml DME（Dulbecco改良Eagle培养基）进行酶解消化20分钟，随后使用玻璃巴斯德吸管（9英寸）在室温下吹打约10次进行 triturate 处理。
- 向细胞中加入10 ml含10%胎牛血清的DME以终止酶活性，然后通过40 μm细胞滤筛过滤。短暂离心后，将细胞沉淀重悬于6 ml HBSS中，并铺加至如下所述的OptiPrep梯度溶液上。
2. 制备 OptiPrep 梯度溶液
- 通过将 OptiPrep 与 MOPS 缓冲液（0.15 M NaCl，10 mM MOPS，pH 7.4）按 1:1 比例稀释，制备稀释的 OptiPrep 溶液。
- 通过将 350、250、200 或 150 μl 稀释的 OptiPrep 与 HBSS 混合至终体积为 1 ml，配制四种 OptiPrep 梯度溶液（表 1）。
- 将四种溶液缓慢而小心地分层加入 15 ml 圆锥形离心管中，最浓的溶液置于底部，最稀的溶液置于顶部（图 1A）。
3. 分离脂质/髓鞘碎片与细胞
- 将6 ml解离的脊髓细胞悬液小心地铺在OptiPrep梯度溶液上方。
- 将含有细胞和梯度溶液的离心管使用Eppendorf Centrifuge 5810R离心机（配备A-4-62水平转子）进行离心（15分钟，1900 rpm或726 RCF，20 °C），使细胞悬液分离成不同层次：最上层为脂质/髓鞘碎片（管子顶部7 ml），随后是三层神经元，而炎性细胞、胶质细胞和红细胞则沉淀于管底。尽管大多数炎性细胞（包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞）均位于沉淀中，但部分体积较大的活化巨噬细胞也可能存在于沉淀层之上的各层中。
- 小心吸除并弃去脂质/髓鞘碎片层（顶部7 ml）。随后将细胞用2.5 ml HBSS洗涤并重悬，用于后续免疫标记实验。
4. 用于流式细胞术的特定免疫细胞免疫标记
- 从脊髓组织样本中收集的细胞（500 μl）经离心沉淀后，重悬于0.85%氯化铵溶液（用蒸馏水稀释）中，室温孵育5分钟以裂解红细胞。
- 细胞用500 μl HBSS洗涤一次，随后在室温下用正常兔血清或小鼠血清封闭30分钟。
- 细胞洗涤后，在室温下与一抗（Rabbit anti-PMN FITC, Accurate Chemical and Scientific；Mouse anti-rat ED1 Alexa 488, Serotec；或Mouse anti-rat CD3 Alexa 488）或同型IgG对照抗体溶液（均以HBSS按1:100稀释）孵育1小时，具体操作如前所述1。
- 上述每一步骤后均将细胞洗涤两次，最后一步完成后重悬于300 μl HBSS中。
5. 通过流式细胞术对细胞进行定量评估
- 使用 FACS Calibur（Becton-Dickinson）流式细胞仪和 Cell Quest 软件对样品进行分析。每个样品采集 5,000 个事件，所有样品的数据分析均使用 Summit（DakoCytomation）完成。
- 流式细胞术设门依据对照 IgG 同型标记细胞或未损伤对照动物的脊髓细胞设定基线值，以实现不同时间点之间的归一化，具体方法如前所述1。阳性标记细胞的平均值以占整个样品的百分比（± 标准误）表示。
6. 代表性结果：
通过在SCI后PMN浸润的已知峰值时间点（伤后1天，1 dpi）定量脊髓中的PMN，评估了OptiPrep梯度离心法清除髓鞘碎片并提高流式细胞术检测免疫细胞的能力（图1B）1-3。作为对照，对同样解剖获取的脊髓组织进行酶解离散处理，但不使用OptiPrep去除髓鞘碎片，并平行地通过流式细胞术检测PMN浸润情况。正如我们先前报道的那样1，与仅进行酶解离散的样本相比，采用OptiPrep梯度纯化法分离的样本中细胞事件的位置发生了偏移，表明在含有完整髓鞘碎片的样本中检测到的PMN比例仅为OptiPrep纯化样本中检测到比例的极小部分（前者为0.5%，后者为5.1%）（图1B）。这些数据表明，组织制备物中的髓鞘碎片可能干扰流式细胞术的检测结果，同时也证明去除髓鞘碎片可增强损伤脊髓组织中免疫细胞检测的灵敏度。
在确定了OptiPrep梯度系统对损伤脊髓中细胞检测的敏感性后，我们表征了从伤后2小时至180天（dpi）期间细胞浸润的动态变化，并揭示了脊髓损伤（SCI）后一种新的多相性细胞炎症反应，其中包括中性粒细胞（PMNs）、巨噬细胞/小胶质细胞以及T细胞。正如先前研究1-3所证实的，PMNs在损伤后2小时即进入脊髓，并于1 dpi达到峰值（图2和图4）。另一方面，巨噬细胞/小胶质细胞1,4,5在损伤脊髓中直到3 dpi才被检测到，并于7 dpi时首次达到峰值（图3和图4）。令人意外的是，我们首次发现巨噬细胞/小胶质细胞在60 dpi时出现第二次峰值，并持续升高至180 dpi（图3和图4）。与巨噬细胞/小胶质细胞类似，先前研究预测T细胞浸润在7 dpi达到峰值5-7；然而，流式细胞术在伤后前7天内未检测到T细胞数量的明显变化，直到9 dpi才检测到T细胞数量升高（1.6%）（图4）。尽管T细胞数量在10 dpi时开始下降，但持续的T细胞反应一直维持至180 dpi，在此时间点有4.4%的细胞表达CD3标记（图4）。
综上所述，这些数据表明脊髓损伤（SCI）后细胞炎症反应具有时间依赖性的多相特征（图4）；细胞炎症的早期阶段包括损伤后1天（dpi）中性粒细胞（PMNs）的早期峰值，随后是损伤后7天ED1+巨噬细胞/小胶质细胞的峰值以及损伤后9天T细胞的峰值；而后期阶段则表现为这三种细胞群体在损伤后14天开始上升，并持续至损伤后180天，其中巨噬细胞/小胶质细胞在损伤后60天出现明显的第二次峰值。该时间过程研究及流式细胞术所产生的定量数据此前已被验证，结果与免疫标记脊髓切片的定量体视学分析所获得的数据具有可比性1。
表1. 用于去除髓鞘碎片的OptiPrep梯度溶液的制备。 使用HBSS和稀释的OptiPrep（OptiPrep与MOPS按1:1稀释）配制四种OptiPrep梯度溶液。
图1. OptiPrep 梯度密度法可将大部分髓鞘/碎片与损伤脊髓组织/细胞分离，从而改善流式细胞术对免疫细胞的检测。(A) 将解离的脊髓组织经 OptiPrep 梯度离心后，吸除髓鞘/碎片层，实现髓鞘/碎片与细胞（神经元、胶质细胞及免疫细胞）的分离。(B) 损伤脊髓中 PMN 数量检测结果，显示去除碎片后检测 PMN 的敏感性显著提高（Student’s t-test，p = 0.0001）。所有流式细胞术设门均基于未损伤动物的标记细胞设定。 n每组 n=5，数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。所有样本均检测 5,000 个事件，阳性标记细胞的平均值以占整个样本的百分比（± 标准误，S.E.M.）表示。
图 2. 通过流式细胞术检测损伤脊髓中中性粒细胞（PMN）的浸润。在T9节段施加中度（200 kd）挫伤损伤后，中性粒细胞从损伤后2小时（B）开始迅速进入脊髓，并在1天（C）达到峰值。所有流式细胞术设门均使用未损伤动物的标记细胞设定（A）。
图3. 通过流式细胞术检测损伤脊髓中巨噬细胞/小胶质细胞的浸润。在T9节段造成中度（200 kd）挫伤损伤后，ED1+巨噬细胞/小胶质细胞数量自损伤后第3天（D）开始增加，在损伤后第7天（E）达到急性高峰，至损伤后第14天（F）降至低水平，随后在损伤后第60天（G）出现第二个高峰，并持续存在于损伤脊髓中直至损伤后第180天（H）。损伤后第7天脊髓细胞的IgG同型对照标记（B）显示抗体标记背景信号极低，与损伤后2小时（C）或未损伤动物（A）的抗体标记细胞无差异。所有流式细胞术设门均基于未损伤动物来源的标记细胞设定。
表 2. 时间进程实验中的动物样本。 在每个时间点（0 小时至 180 天），五只动物在 T9 水平接受中度（200 kd）挫伤损伤，并通过流式细胞术检测脊髓组织中 PMN、ED1+ 巨噬细胞/小胶质细胞和 CD3+ T 细胞的数量。然而，并非所有动物样本均成功获得用于 PMN（4–5 只）、ED1（3–5 只）和 CD3（4–5 只）的流式细胞术分析。
图4. T9节段中度（200 kd）挫伤后脊髓内细胞炎症的时程变化。通过流式细胞术评估，PMNs、ED1阳性巨噬细胞和T细胞的数量在损伤后不同时间点显著增加。+ 巨噬细胞/小胶质细胞，以及 CD3+ T细胞在损伤脊髓中急性期达到峰值（分别为伤后1、7和9天），并持续存在于慢性期。 n每组3至5个，均值±标准误。
讨论
使用流式细胞术定量中枢神经系统（CNS）中的免疫细胞时，脂质/髓鞘成分和碎片会带来复杂性。除了干扰抗体结合和特异性外，髓鞘碎片在大小和颗粒度特性上与免疫细胞相似，从而降低检测的敏感性和准确性8。本文所述的新型细胞制备方法可有效去除髓鞘碎片，进而提高流式细胞术检测脊髓损伤后细胞炎症变化的敏感性。例如，与仅使用酶解离的方法相比，该方法通过去除髓鞘碎片显著增强了对免疫细胞的检测能力。尤为关键的是，该方法的创新性应用首次实现了对脊髓损伤（SCI）后急性和慢性阶段细胞炎症的全面表征，涵盖了中性粒细胞（PMNs）、巨噬细胞/小胶质细胞以及T细胞从损伤至180天（dpi）的完整时间进程，并发现了一种新型的二次细胞炎症相。神经炎症具有多相性特征的这些重要发现，可能对设计和实施合理的治疗策略至关重要，包括针对SCI的细胞治疗和药物干预措施。
OptiPrep 梯度系统已被用于从血液中分离细胞碎片9，或从脑组织中纯化神经元以用于细胞培养10；然而，我们对该方法系统进行了改进和优化，以从脊髓解离细胞中分离髓鞘碎片，并通过流式细胞术实现对细胞炎症的快速且更准确的定量分析。该方法结合流式细胞术，有望显著推动中枢神经系统（CNS）损伤或病理状态下炎症研究的发展，因为大多数研究仅依赖形态学和组织学技术来表征中枢神经系统中的细胞炎症，而这些技术缺乏细胞类型特异性，且无法始终提供真正的定量评估。此外，少数近期研究尝试利用新鲜解离的脊髓组织通过流式细胞术定量损伤脊髓中的免疫细胞11,12，或使用 Percoll 梯度系统分离细胞后进行分析13；然而，这些研究均显示出细胞得率较低或对免疫细胞的检测不够灵敏。
相比之下，OptiPrep 梯度细胞分离方法首次实现了通过流式细胞术对细胞炎症在不同损伤程度及长达180天损伤后时间进程中的变化进行灵敏且可靠的定量评估。流式细胞术分析的灵敏性和可靠性还取决于用于检测特定免疫细胞类型的抗体的特异性，因为流式细胞术无法利用形态学标准进一步区分细胞类型。针对中性粒细胞（PMNs）、巨噬细胞/小胶质细胞或T细胞的抗体特异性已在流式细胞术中得到充分验证，包括对腹腔中性粒细胞、培养的肺泡巨噬细胞以及损伤脊髓组织中的细胞的检测1,2。结合OptiPrep梯度系统，这些用于流式细胞术的抗体有助于实现对细胞炎症的时序性和定量分析，从而加深了对脊髓损伤（SCI）微环境动态变化的理解，并首次揭示了细胞炎症存在一个持续的多相性反应过程。脊髓损伤后细胞的这种多相性反应可能对于研究特定时间点存在的特定细胞类型的作用，或针对可能加重损伤的特定细胞类型开发治疗干预措施具有重要意义。此外，这些发现可能有助于为脊髓损伤的最佳药物或细胞治疗干预提供合理的理论依据。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢加州大学欧文分校 Christopher & Dana Reeve 基金会动物核心设施的 Rebecca Nishi（理学硕士）及其技术人员在动物手术方面的帮助。同时感谢 Gabriella Funes、Usha Nekanti 和 Denisse Moreno 在技术协助、手稿和视频拍摄准备以及动画制作方面提供的支持。本研究由美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS，资助号 RO1 NS43428-01，授予 AJA）、美国瘫痪项目（Paralysis Project of America，资助号 PPA-32574，授予 HXN）以及加州再生医学研究所（CIRM）干细胞培训奖（资助号 T1-00008，授予 HXN）资助。KDB 得到了加州大学欧文分校分子与细胞神经科学培训项目（资助号 T32 NS007444）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| OptiPrep | 赛默飞世尔科技 | NC9182490 | |
| HBSS | 西格玛奥德里奇 | H1387 | |
| 兔抗大鼠中性粒细胞抗体（FITC标记） | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AIFAD51140 | |
| 小鼠抗大鼠ED1抗体（Alexa Fluor 488标记） | AbD Serotec | MCA341A488 | |
| 小鼠抗大鼠CD3抗体（FITC标记） | AbD Serotec | MCA772F | |
| 胰蛋白酶 | 西格玛奥德里奇 | T9935 | |
| 胶原酶 | 西格玛奥德里奇 | C5138 | |
| DME培养基 | 西格玛奥德里奇 | D1152 | |
| 小鼠IgG1同型对照抗体（Alexa Fluor 488标记） | AbD Serotec | MCA1209A488 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30070.03 | |
| 兔血清 | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 | |
| 小鼠血清 | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 | |
| 细胞筛 | BD 生物科学 | 352340 |
参考文献
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