基于固体平板的饮食限制方法 秀丽隐杆线虫

摘要

本文介绍了一种利用灭活细菌在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中进行固体平板饮食限制的实验方案。

摘要

在包括哺乳动物在内的多种物种中，已知在不造成营养不良或饥饿的情况下减少食物摄入量能够延长寿命，并延缓多种与年龄相关疾病的发生。这种干预措施还会导致体重和生育力下降，以及动物体内血浆葡萄糖、胰岛素和IGF-1水平降低。该处理通常被称为饮食限制（dietary restriction, DR）或热量限制（caloric restriction, CR）。线虫Caenorhabditis elegans已成为研究衰老生物学的重要模式生物。通过环境和遗传手段模拟饮食限制的研究均已证明可延长C. elegans的寿命。然而，许多已报道的关于C. elegans的饮食限制研究是在液体培养基中进行的，而衰老领域的大多数遗传学研究则是在标准的固体琼脂培养皿上完成的。本文介绍一种使用标准固体NGM琼脂平板并以灭活细菌作为食物来源的饮食限制实验方案。

方案

1. 建立用于估算细菌浓度的校准曲线

本部分介绍了一种用于估算任意给定细菌菌株（例如 OP50、HT115）浓度的方法，这些菌株将作为秀丽隐杆线虫（C. elegans）饮食限制实验中的食物来源。每种使用的细菌菌株均应建立独立的校准曲线。

1. 从LB琼脂平板上新鲜划线培养的E. coli OP50菌落中挑取单个菌落，接种于3 mL液体LB培养基中。
2. 将OP50菌液置于37 °C摇床中，过夜培养。
3. 用过夜培养物制备细菌悬液的连续2倍稀释液（2倍、4倍、8倍、16倍、32倍）。
4. 使用分光光度计在600 nm波长下测定各稀释液的吸光度（光密度），每样重复测定三次。
5. 将每种细菌悬液进一步稀释1,000,000倍（连续两次1000倍稀释）。
6. 将每种稀释度的细菌悬液各0.4 mL均匀涂布于100 mm LB琼脂平板上。
7. 将接种OP50的LB平板置于37 °C培养箱中培养18–24小时。
8. 计数每个平板上生长的细菌菌落数。根据菌落数计算每毫升样品中的菌落形成单位（cfu，colony forming unit）。
9. 通过以OD₆₀₀值为纵坐标、细菌浓度（cfu/mL）为横坐标作图，并进行线性回归分析，可建立测得的OD₆₀₀值与OP50细菌浓度之间的关系（图1）。

溶液：

LB 培养基（Luria Broth），1 L：
10 g	Bacto-tryptone
5 g	酵母提取物（Yeast Extract）
10 g	NaCl

加入去离子水至1 L。
高压灭菌后室温保存。

2. 固体平板饮食限制（sDR）平板的制备

本部分描述了用于固体平板饮食限制（sDR）实验的平板制备方法。通常，我们将细菌浓度为 1 × 10¹¹ cfu/mL 视为自由摄食条件，而将 1 × 10⁸ cfu/mL 视为该方法下最佳的饮食限制（DR）喂养条件。然而，可能需要设置 4 至 6 种不同的细菌浓度，以建立 sDR 及其响应的完整剂量依赖关系。

1. 将单个 E. Coli OP50 菌落接种至 3 mL 液体 LB 培养基中。
2. 将 OP50 菌液置于 37 °C 摇床中培养，使细菌生长 6–8 小时。
3. 将 OP50 菌液转移至含有 500 mL LB 培养基的新烧瓶中，并于 37 °C 摇床中过夜培养。
4. 测定 OP50 菌液在 OD₆₀₀ 处的吸光度以确定细菌浓度（浓度通过第一部分建立的校准曲线计算）。为准确测定吸光度，可能需要进行适当稀释。
5. 以 1,500 g 离心 20 分钟，收集 OP50 细菌菌体。
6. 将细菌重悬至浓度为 1 × 10¹² cfu/mL。
7. 配制六种不同浓度的 10 mL 细菌培养液：1 × 10¹²、10¹¹、10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷ cfu/mL。
8. 用移液器吸取 0.2 mL 细菌培养液，加至 60 mm 固体 NGM 培养皿中央。注意避免移液枪头接触培养皿表面，因表面划痕会使线虫钻入琼脂内。
9. 将培养皿置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
10. 在每块培养皿上分别加入 10 μL 100 mg/mL 羧苄青霉素和 10 μL 50 mg/mL 卡那霉素，以抑制细菌生长。
11. 将含不同浓度抗生素灭活细菌的培养皿于 4 °C 保存，以备后续使用（最多可保存一个月）。建议至少提前 1–2 天制备并储存足够整个实验所需的培养皿。整个实验使用同一批次的培养皿为佳。
12. 为验证细菌的存活状态，从 sDR 培养皿中刮取少量细菌，涂布于含羧苄青霉素和卡那霉素的空白 NGM 培养皿上。将该培养皿置于 37 °C 培养箱中培养 6–8 小时，随后检查细菌生长情况（应无细菌生长）。

溶液

线虫培养基（NGM），1L：
3 g	NaCl
2.5 g	Bacto-Peptone
20g	Agar

高压灭菌40分钟，然后冷却至65 °C，再加入：

1 mL	1 M MgSO4
1 mL	1 M CaCl2
1 mL	5 mg/mL 胆固醇
25 mL	1 M 磷酸钾，pH 6.0

立即将液体NGM以每份10 mL的量倒入60 mm × 15 mm的培养皿中

3. 设置 sDR 实验

对于大多数与sDR相关的研究，例如寿命分析和生育力分析，制备年龄同步化的线虫群体至关重要。对于其他研究，只需将线虫从常规的OP50平板转移至sDR平板，即可启动饮食限制。本节以sDR动物的寿命分析为例，描述了相应的实验方案。

1. 使用铂金线虫挑取器将20-30条具有生殖活性的成虫转移到若干含OP50的普通NGM平板上。根据实验所需卵的数量，可能需要更多成虫。
2. 将平板置于20°C环境中4小时，以允许产卵。
3. 从平板上移除成虫，并对平板进行肉眼检查以确认是否存在卵。
4. 将平板继续置于20°C培养，使子代发育至晚期L4或第1天成虫阶段。通常情况下，N2野生型线虫在20°C下需要约3天完成该发育过程。
5. 将适量的第1天成虫转移至sDR平板，以启动饮食限制处理。
6. 进行寿命分析时，每种sDR条件需准备总共6-8个平板，每个平板接种10-20条线虫。
7. 每2天记录每条线虫的存活情况，直至所有线虫死亡。关键步骤是每隔12-48小时必须将线虫转移至新的sDR平板，以避免食物完全耗尽。

4. 代表性结果：

图1展示了一条用于估算OP50浓度与OD₆₀₀之间关系的代表性标准曲线。通过线性回归分析得到的方程可用于今后所有OP50细菌浓度的计算。图2展示了慢性sDR处理对不同线虫品系平均寿命影响的检测示例。蓝色曲线代表野生型线虫对sDR的正常剂量依赖性反应。红色曲线表明，drr-2 o.e.部分抑制了sDR对寿命的影响，而daf-16(mu86)对sDR诱导的寿命延长无影响。C. elegans中进行寿命分析的详细方法已在先前文献中描述^1-3。

图1. 用于估计 E. Coli OP50 浓度的标准曲线代表性结果。OP50 浓度以测得的 OD₆₀₀ 值为自变量进行绘制。误差线 = 标准差（S.D.）。将过夜培养的细菌培养物在测定吸光度前分别稀释 1.5 倍、2 倍、4 倍、8 倍、16 倍和 32 倍，并在测定菌落形成单位（cfu）前再进一步稀释 1,000 倍两次。

图 2. 野生型 N2 动物（蓝色）与两种不同突变体（绿色和红色）在 sDR 条件下 C. elegans 寿命实验的代表性结果（引自 Ching et al. ⁴）。误差线 = S.E.M.

讨论

已知饮食限制（DR）可延长多种物种（包括哺乳动物）的寿命，并延缓多种与年龄相关疾病的发生^5-7。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，已有多种环境和遗传操作方法用于模拟DR，包括将线虫培养于半定义的液体培养基中^8,9、在液体培养基中稀释细菌食物来源^10-12，以及利用摄食速率较慢的行为突变体¹³。然而，遗传性模拟DR可能产生与DR无关的表型，而在线虫液体培养体系中则涉及与大多数线虫实验室所适应的固体培养板条件不同的生长环境。因此，能够在标准固体培养板上实施的DR方案具有重要应用价值，目前已由多个研究团队建立^4,14,15。

在本方案中，通过在培养皿上施加两种不同的抗生素来杀死细菌，以此控制食物摄入水平。然而，也可使用其他方法（如紫外线照射）来抑制细菌生长。

为避免在sDR实验过程中完全缺乏食物（即饥饿），如上文步骤3.7所述，需每隔12至48小时将线虫转移至新的sDR培养板。转移频率取决于食物浓度...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
羧苄青霉素	Duchefa Biochemie	C0109.25	溶于水。
卡那霉素	Roche Group	10106801001	溶于水。
Bacto-蛋白胨	BD Biosciences	DF0118072
Bacto-胰蛋白胨	BD Biosciences	DF0123075
Bacto-酵母提取物	BD Biosciences	DF0127071
琼脂	BD Biosciences	DF00145170
无菌培养管	USA Scientific, Inc.	1485-0810
分光光度计	Amersham	Gene Quant pro	Amersham 现为 GE Healthcare 的一部分。
解剖显微镜	Carl Zeiss, Inc.	Stemi 2000
离心机	Beckman Coulter Inc.	Accuspin FR