基于固体平板的饮食限制方法 秀丽隐杆线虫

摘要

本文介绍了一种利用灭活细菌在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中进行固体平板饮食限制的实验方案。

摘要

在包括哺乳动物在内的多种物种中，已知在不造成营养不良或饥饿的情况下减少食物摄入量能够延长寿命，并延缓多种与年龄相关疾病的发生。这种干预措施还会导致体重和生育力下降，以及动物体内血浆葡萄糖、胰岛素和IGF-1水平降低。该处理通常被称为饮食限制（dietary restriction, DR）或热量限制（caloric restriction, CR）。线虫Caenorhabditis elegans已成为研究衰老生物学的重要模式生物。通过环境和遗传手段模拟饮食限制的研究均已证明可延长C. elegans的寿命。然而，许多已报道的关于C. elegans的饮食限制研究是在液体培养基中进行的，而衰老领域的大多数遗传学研究则是在标准的固体琼脂培养皿上完成的。本文介绍一种使用标准固体NGM琼脂平板并以灭活细菌作为食物来源的饮食限制实验方案。

方案

1. 建立用于估算细菌浓度的校准曲线

本部分介绍了一种用于估算任意给定细菌菌株（例如 OP50、HT115）浓度的方法，这些菌株将作为秀丽隐杆线虫（C. elegans）饮食限制实验中的食物来源。每种使用的细菌菌株均应建立独立的校准曲线。

1. 从LB琼脂平板上新鲜划线培养的E. coli OP50菌落中挑取单个菌落，接种于3 mL液体LB培养基中。
2. 将OP50菌液置于37 °C摇床中，过夜培养。
3. 用过夜培养物制备细菌悬液的连续2倍稀释液（2倍、4倍、8倍、16倍、32倍）。
4. 使用分光光度计在600 nm波长下测定各稀释液的吸光度（光密度），每样重复测定三次。
5. 将每种细菌悬液进一步稀释1,000,000倍（连续两次1000倍稀释）。
6. 将每种稀释度的细菌悬液各0.4 mL均匀涂布于100 mm LB琼脂平板上。
7. 将接种OP50的LB平板置于37 °C培养箱中培养18–24小时。
8. 计数每个平板上生长的细菌菌落数目。菌落计数用于计算每毫升样品中的菌落形成单位（cfu，colony forming unit）数量。
9. 通过以OD₆₀₀值为纵坐标、细菌浓度（cfu/mL）为横坐标作图，并进行线性回归分析，可建立测得的OD_600<....

讨论

已知饮食限制（DR）可延长多种物种（包括哺乳动物）的寿命，并延缓多种与年龄相关疾病的发生^5-7。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，已有多种环境和遗传操作方法用于模拟DR，包括将线虫培养于半定义的液体培养基中^8,9、在液体培养基中稀释细菌食物来源^10-12，以及利用摄食速率较慢的行为突变体¹³。然而，遗传性模拟DR可能产生与DR无关的表型，而在线虫液体培养体系中则涉及与大多数线虫实验室所适应的固体培养板条件不同的生长环境。因此，能够在标准固体培养板上实施的DR方案具有重要应用价值，目前已由多个研究团队建立^4,14,15。

在本方案中，通过在培养皿上施加两种不同的抗生素来杀死细菌，以此控制食物摄入水平。然而，也可使用其他方法（如紫外线照射）来抑制细菌生长。

为避免在sDR实验过程中完全缺乏食物（即饥饿），如上文步骤3.7所述，需每隔12至48小时将线虫转移至新的sDR培养板。转移频率取决于食物浓度.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
羧苄青霉素	Duchefa Biochemie	C0109.25	溶于水。
卡那霉素	Roche Group	10106801001	溶于水。
Bacto-蛋白胨	BD Biosciences	DF0118072
Bacto-胰蛋白胨	BD Biosciences	DF0123075
Bacto-酵母提取物	BD Biosciences	DF0127071
琼脂	BD Biosciences	DF00145170
无菌培养管	USA Scientific, Inc.	1485-0810
分光光度计	Amersham	Gene Quant pro	Amersham 现为 GE Healthcare 的一部分。
解剖显微镜	Carl Zeiss, Inc.	Stemi 2000
离心机	Beckman Coulter Inc.	Accuspin FR