本文介绍了一种利用灭活细菌在秀丽隐杆线虫(C. elegans)中进行固体平板饮食限制的实验方案。
本文介绍了一种利用灭活细菌在秀丽隐杆线虫(C. elegans)中进行固体平板饮食限制的实验方案。
在包括哺乳动物在内的多种物种中,已知在不造成营养不良或饥饿的情况下减少食物摄入量能够延长寿命,并延缓多种与年龄相关疾病的发生。这种干预措施还会导致体重和生育力下降,以及动物体内血浆葡萄糖、胰岛素和IGF-1水平降低。该处理通常被称为饮食限制(dietary restriction, DR)或热量限制(caloric restriction, CR)。线虫Caenorhabditis elegans已成为研究衰老生物学的重要模式生物。通过环境和遗传手段模拟饮食限制的研究均已证明可延长C. elegans的寿命。然而,许多已报道的关于C. elegans的饮食限制研究是在液体培养基中进行的,而衰老领域的大多数遗传学研究则是在标准的固体琼脂培养皿上完成的。本文介绍一种使用标准固体NGM琼脂平板并以灭活细菌作为食物来源的饮食限制实验方案。
1. 建立用于估算细菌浓度的校准曲线
本部分介绍了一种用于估算任意给定细菌菌株(例如 OP50、HT115)浓度的方法,这些菌株将作为秀丽隐杆线虫(C. elegans)饮食限制实验中的食物来源。每种使用的细菌菌株均应建立独立的校准曲线。
溶液:
| LB 培养基(Luria Broth),1 L: | |
| 10 g | Bacto-tryptone |
| 5 g | 酵母提取物(Yeast Extract) |
| 10 g | NaCl |
加入去离子水至1 L。
高压灭菌后室温保存。
2. 固体平板饮食限制(sDR)平板的制备
本部分描述了用于固体平板饮食限制(sDR)实验的平板制备方法。通常,我们将细菌浓度为 1 × 1011 cfu/mL 视为自由摄食条件,而将 1 × 108 cfu/mL 视为该方法下最佳的饮食限制(DR)喂养条件。然而,可能需要设置 4 至 6 种不同的细菌浓度,以建立 sDR 及其响应的完整剂量依赖关系。
溶液
| 线虫培养基(NGM),1L: | |
| 3 g | NaCl |
| 2.5 g | Bacto-Peptone |
| 20g | Agar |
高压灭菌40分钟,然后冷却至65 °C,再加入:
| 1 mL | 1 M MgSO4 |
| 1 mL | 1 M CaCl2 |
| 1 mL | 5 mg/mL 胆固醇 |
| 25 mL | 1 M 磷酸钾,pH 6.0 |
立即将液体NGM以每份10 mL的量倒入60 mm × 15 mm的培养皿中
3. 设置 sDR 实验
对于大多数与sDR相关的研究,例如寿命分析和生育力分析,制备年龄同步化的线虫群体至关重要。对于其他研究,只需将线虫从常规的OP50平板转移至sDR平板,即可启动饮食限制。本节以sDR动物的寿命分析为例,描述了相应的实验方案。
4. 代表性结果:
图1展示了一条用于估算OP50浓度与OD600之间关系的代表性标准曲线。通过线性回归分析得到的方程可用于今后所有OP50细菌浓度的计算。图2展示了慢性sDR处理对不同线虫品系平均寿命影响的检测示例。蓝色曲线代表野生型线虫对sDR的正常剂量依赖性反应。红色曲线表明,drr-2 o.e.部分抑制了sDR对寿命的影响,而daf-16(mu86)对sDR诱导的寿命延长无影响。C. elegans中进行寿命分析的详细方法已在先前文献中描述1-3。

图1. 用于估计 E. Coli OP50 浓度的标准曲线代表性结果。OP50 浓度以测得的 OD600 值为自变量进行绘制。误差线 = 标准差(S.D.)。将过夜培养的细菌培养物在测定吸光度前分别稀释 1.5 倍、2 倍、4 倍、8 倍、16 倍和 32 倍,并在测定菌落形成单位(cfu)前再进一步稀释 1,000 倍两次。

图 2. 野生型 N2 动物(蓝色)与两种不同突变体(绿色和红色)在 sDR 条件下 C. elegans 寿命实验的代表性结果(引自 Ching et al. 4)。误差线 = S.E.M.
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已知饮食限制(DR)可延长多种物种(包括哺乳动物)的寿命,并延缓多种与年龄相关疾病的发生5-7。在秀丽隐杆线虫(C. elegans)中,已有多种环境和遗传操作方法用于模拟DR,包括将线虫培养于半定义的液体培养基中8,9、在液体培养基中稀释细菌食物来源10-12,以及利用摄食速率较慢的行为突变体13。然而,遗传性模拟DR可能产生与DR无关的表型,而在线虫液体培养体系中则涉及与大多数线虫实验室所适应的固体培养板条件不同的生长环境。因此,能够在标准固体培养板上实施的DR方案具有重要应用价值,目前已由多个研究团队建立4,14,15。
在本方案中,通过在培养皿上施加两种不同的抗生素来杀死细菌,以此控制食物摄入水平。然而,也可使用其他方法(如紫外线照射)来抑制细菌生长。
为避免在sDR实验过程中完全缺乏食物(即饥饿),如上文步骤3.7所述,需每隔12至48小时将线虫转移至新的sDR培养板。转移频率取决于食物浓度...
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未声明任何利益冲突。
本工作获得了Nathan Shock中心(P30 AG13283)的试点项目资助以及美国国家衰老研究所(NIA)R01基金(R01 AG028516)对A.-L.H.的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 羧苄青霉素 | Duchefa Biochemie | C0109.25 | 溶于水。 |
| 卡那霉素 | Roche Group | 10106801001 | 溶于水。 |
| Bacto-蛋白胨 | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-胰蛋白胨 | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-酵母提取物 | BD Biosciences | DF0127071 | |
| 琼脂 | BD Biosciences | DF00145170 | |
| 无菌培养管 | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| 分光光度计 | Amersham | Gene Quant pro | Amersham 现为 GE Healthcare 的一部分。 |
| 解剖显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| 离心机 | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
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