我们通过气管途径，展示了一种将待测物质非手术递送至麻醉小鼠肺部的方法。该方法可使肺部暴露于细菌和病毒病原体、细胞因子、抗体、微珠、化学物质或染料中。我们进一步描述了肺组织及肺引流淋巴结（LDLNs）的采集与处理，以用于流式细胞术分析。
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摘要
摘要
肺泡巨噬细胞和肺树突状细胞（LDCs）等吞噬细胞持续从肺部肺泡腔中摄取抗原。特别是LDCs，已知其会迁移至肺引流淋巴结（LDLNs），并在其中将吸入的抗原呈递给T细胞，从而针对多种免疫原启动适当的免疫应答1,2。为了在小鼠中模拟肺部与空气传播抗原之间的相互作用，可通过鼻内途径1,3,4、气管内途径5或气溶胶形式6给予抗原。每种给药途径均涉及不同的技术要求和局限性，在设计实验前需加以考虑。例如，鼻内和气溶胶暴露会将抗原递送至肺部和上呼吸道。因此，抗原可能进入鼻相关淋巴组织（NALT）7，从而可能使实验结果的解释复杂化。此外，小鼠的吞咽、打喷嚏以及呼吸频率也可能导致给药剂量不一致。尽管在某些研究中可能希望上呼吸道参与反应，但对于专注于肺部特异性启动事件的研究而言，这可能会增加实验复杂性。在此情况下，气管内（i.t.）给药途径更为理想，因其可将测试物质直接递送至肺部，并绕过NALT。目前许多气管内注射方案需通过口腔盲插气管插管，或通过外科手术暴露气管以进入肺部。本文中，我们描述一种简单、稳定且无需手术的气管内滴注方法。使用喉镜可视化气管开口，然后将弯曲的灌胃针直接插入气管以递送接种物。我们还描述了采集和处理LDLNs及肺组织的步骤，以便通过流式细胞术分析抗原的迁移过程。
方案
1. 流程开始前，准备并收集以下物品
- 请参考图 1a) 和 1b) 中的图像，制作用于在操作过程中固定小鼠的木质平台。
- 淋巴结消化液 — HBSS + 1.25 mg/ml IV型胶原酶 或 2.5 mg/ml 胶原酶D
- 肺组织消化液 — HBSS + 1 mg/ml 胶原酶
- 将乳胶微珠用 PBS 稀释（1:20），用于腹腔注射以示踪 LDLN
注意： LDLNs 体积较小且难以找到。为学习如何定位它们，可向小鼠腹腔内注射 200μl 1:20 稀释的红色荧光乳胶微球。腹膜液体会引流至这些 LDLNs8。感染后 24 小时（24 hpi），按上述方法暴露小鼠胸腔。由于从腹腔引流而来的微球聚集，LDLNs 会呈现粉红色。
- 红细胞（RBC）裂解缓冲液 - 0.15M NH₄Cl4Cl, 10 mM KHCO₃3，0.1 mM Na21 L dH₂O 中的 EDTA20. 调节pH至7.2-7.4，室温保存。
- 70μm 或 100μm 细胞筛
- 0.5 M EDTA 储存液，pH = 8.0
- 不含 CaCl 的 HBSS2 和 MgCl2
- 剪刀和钝头镊子
- 喉镜
- 灌胃针（22号）弯曲成一定角度（图2）
- 用于固定小鼠的泡沫板和图钉
- 上皿天平
- Aniline Blue 溶液 - 10 mg/ml 溶于 H2O
注意：我们将使用此溶液来演示气管内注射技术。
2. 小鼠麻醉剂的制备与给药
- 在无菌 PBS 中配制 Xylazine 和 Ketamine 的混合液，使终浓度分别为 2 mg/ml 和 10 mg/ml。
- 使用电子天平称量小鼠体重。
- 根据每只小鼠的体重计算所需给药剂量。按照 Xylazine（2–4 mg/kg）和 Ketamine（70–80 mg/kg）的剂量，使用适量的上述混合液进行腹腔注射。不同品系的小鼠可能需要优化麻醉方案。麻醉过量可能导致呼吸频率降低，在将接种物注入肺部后可能引发致命后果。
- 给药后 3–5 分钟，观察小鼠的麻醉效果。通过以下体征判断小鼠是否已完全麻醉：
- 呼吸频率应明显减慢。
- 提起小鼠颈部时，其前肢不应出现伸展动作。
- 刺激后肢时无任何反应。
若未达到上述标准，需等待数分钟后再次检查，确认后再进行下一步操作。
3. 气管内注射
- 用50μl生理盐水制备接种物。取1ml注射器，安装无菌弯头灌胃针，吸入接种物，并在接种物后方保留100μl空气腔，以确保所有液体均被注入肺内。
- 将小鼠放置于倾斜的木质平台上，使其门齿钩住金属丝，并用一条丝带轻轻固定小鼠位置。
- 用左手（若为右利手）打开喉镜，并持一对钝头镊子。利用喉镜尖端和镊子轻轻撬开小鼠口腔。
- 用镊子将舌头拉出并固定于一侧。将喉镜叶片引导至口腔后部。轻轻向下压喉镜，保持约90°角，直至观察到气管开口。固定喉镜位置。拉出舌头时应格外小心，动作须轻柔，避免造成组织损伤。
- 另一只手持装有接种物的1ml注射器（安装弯头灌胃针），将针头插入气管，直至针头弯曲处到达前门齿位置。均匀推动活塞以注入接种物。接种过程中液体不应产生气泡。接种完成后应尽快将针头从气管中拔出。若气管阻塞时间过长，小鼠可能因窒息而死亡。操作后将小鼠直立保持数秒，使接种物吸入肺部。
- 将小鼠从平台取下，置于加热灯附近。切勿让小鼠长时间暴露于直射热源下。操作后30分钟内小鼠应完全清醒（不同品系恢复时间可能有所差异）。此期间应密切观察小鼠状态，避免其体温过高或过低，否则可能导致呼吸窘迫甚至死亡。
4. 用于流式细胞术的肺引流淋巴结和肺的收获与处理
- 根据美国兽医协会（AVMA）安乐死指南，采用合适的方法处死小鼠。具体方法可根据个体取材结果而有所不同。例如，注射致死剂量的戊巴比妥钠即为一种合适的安乐死程序。我们未观察到使用CO2进行安乐死对肺部产生不良影响。
- 将小鼠四肢用大头针固定于解剖板上，用剪刀沿腹侧中线做切口，轻轻拉开皮肤，暴露胸壁肌肉。
- 切开胸壁肌肉，以暴露腹腔器官。
- 用镊子夹住胸骨尖端，刺破膈肌，并沿肋骨 cage 两侧剪开膈肌。
- 将剪刀平行于解剖板表面，在身体两侧沿背腹线方向剪开胸腔。
- 轻轻抬起肋骨 cage。在心脏右侧、胸腺正下方寻找两个淋巴结。第三个略大的淋巴结位于一条与气管垂直走行的小动脉血管下方。将淋巴结采集至含有1 ml淋巴结消化液的容器中。
- 采集淋巴结后，用一对镊子夹住心脏，另一对镊子夹取肺组织，将肺组织采集至6孔板中含3 ml冰上预冷PBS的孔内。
- 分离肺叶，吸除PBS，用镊子和剪刀将肺叶剪成小块。加入3 ml肺组织消化液。此步骤期间将6孔板置于冰上。
- 将淋巴结在37°C孵育25–30分钟，肺组织孵育30分钟。向每种消化液中加入EDTA，使其终浓度为10 mM，以终止反应，随后立即置于冰上。
- 使用3 ml注射器，将肺组织块通过18号针头推注3次。再用1 ml注射器活塞尾部将肺组织和淋巴结（LNs）研磨通过70–100 μm细胞筛网。用10 ml不含Ca2+和Mg2+的HBSS冲洗细胞筛网。以500 × g离心5分钟。
- 将沉淀重悬于5 ml红细胞裂解缓冲液中，室温孵育3分钟。加入10 ml不含Ca2+和Mg2+的HBSS终止裂解反应。以500 × g离心5分钟。将肺组织和肺引流淋巴结（LDLN）的单细胞悬液分别定容至10 ml和5 ml。使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数活细胞。此时细胞可用于流式细胞术染色。单侧肺叶可能已足够用于流式细胞术分析。其他肺叶可用于同一只小鼠的其他实验目的，例如制备匀浆用于细胞因子检测，或取组织用于组织学分析。
5. 代表性结果：
肺中的LDC和肺泡巨噬细胞在气管内注射（i.t注射）后立即从肺泡腔获取抗原。图3显示了i.t注射后30分钟，肺中表达CD11c+（存在于LDC和肺泡巨噬细胞上）的细胞中携带荧光标记的Bacillus anthracis芽孢的比例。在此时间点，肺单细胞悬液中约有15.9%的CD45+CD11c+细胞含有Bacillus anthracis芽孢（图3，下层面板）。关于肺中CD11c+细胞的进一步表征，请参见Kim和Braciale4。荧光标记的微珠通常用于评估颗粒性抗原向肺引流淋巴结（LDLNs）的转运9。为评估抗原从肺向LDLNs的转运过程，将荧光乳胶微珠与LPS一同通过i.t途径注射，并在感染后24小时（24 hpi）分析LDLNs。结果显示，在24 hpi时，约有4%的LDLNs中CD11chi细胞携带荧光微珠（图4）。这些代表性实验表明，本方案可有效用于追踪在肺中摄取吸入性颗粒抗原并将其转运至LDLNs的细胞。
图1. 用于在鞘内注射过程中固定小鼠的木制平台。 将一块木块以一定角度切割，并安装金属杆，正面视图（图1a）和侧面视图（图1b）。将一小段金属丝缠绕在金属杆上，用于固定小鼠的门齿。一条丝带被固定在平台上，用于绑住小鼠，使其在操作过程中保持稳定。
图2. 用于气管内注射的灌胃针。 将灌胃针（右侧）弯曲成约135°的角度（左侧），用于气管内注射。
图3. 肺中携带经气管注射的表达GFP的CD11c+细胞占所有CD11c+细胞的百分比 炭疽杆菌 （Sterne-p6GFP），攻击后5小时AJ小鼠被接种1x108 GFP-炭疽杆菌孢子感染后5小时分析肺组织。点图显示肺组织中CD11c+细胞中呈阳性的百分比 炭疽杆菌.
图4. 气管内注射后24小时在肺引流淋巴结中检测到荧光微球（黄/绿）。AJ小鼠分别接受PBS（左图）或5×109个Fluoresbrite YG微球（0.5 μm）联合10 μg LPS（右图）气管内注射，于感染后24小时分析肺引流淋巴结（LDLN）。代表性点图显示LDLN中携带荧光微球的CD11chi细胞百分比，对照为空白通道。
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讨论
我们已利用该方案研究炭疽杆菌（Bacillus anthracis）孢子从肺部向局部引流淋巴结（LDLNs）的迁移过程。对于类似应用，应谨慎选择递送至肺部的颗粒数量，以确保通过流式细胞术可在局部引流淋巴结中检测到注入的物质。我们还成功地将该方法用于细胞的过继转移，以及利用荧光标记抗体对特定肺细胞群体进行标记。此外，该方法常规用于将博来霉素（一种肺纤维化化学诱导剂）和细胞因子直接递送至肺部10。
尽管该方法可实现将测试物质稳定递送至肺部，但需要经过大量培训和验证（可通过向肺内灌注染料来实现）。由于该方法避开了上呼吸道，因此可能不如其他吸入途径具有相同的生理相关性，而上呼吸道可能是重要相互作用和免疫应答的起始部位。然而，在以下情况下，该方法更具优势：即当头颈部区域淋巴结对给药物质的摄取以及呼吸道上皮的刺激可能使实验结果解释复杂化时。与所有模型一样，在实验设计过程中应充分考虑剂量、递送载体、注入物质的分布、对呼吸道上皮的损伤以及麻醉的影响等实验因素。与传统的气管内灌注（i.t. instillation）方法相比，我们认为该方法显著减少了对呼吸道上...
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披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70μm 细胞筛 | BD Biosciences | ||
| 苯胺蓝 | 菲舍尔科技公司 | A967-25 | |
| 动物饲喂针头 | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| 胶原酶 | 西格玛奥德里奇公司 | C2139 | |
| IV型胶原酶 | 沃辛顿生化公司 | ||
| 胶原酶D | 罗氏集团 | 11088974103 | |
| DPBS | 英坦科技公司 | 14190 | |
| 荧光亮黄YG微球（0.5μm） | Polysciences, Inc. | 17152 | |
| 不含氯化钙和氯化镁的HBSS | 英坦科技公司 | 14170 | |
| 盐酸氯胺酮（100 mg/ml） | 赫施拉公司 | ||
| 喉镜片 | PennCentury, Inc | 适用于型号 LS-1 | 请参考 www.penncentury.com |
| 轻质光纤喉镜 | Welch Allyn | 80814 | |
| 红色荧光微珠（0.5μm） | 英坦科技公司 | F8812 | 用于腹腔注射 |
| 赛拉嗪（100 mg/ml） | Lloyd, Inc. |
参考文献
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).
- Bar-Haim, E. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).
- Kim, T. S., Braciale, T. J. Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses. PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).
- Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity. J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).
- Thomas, R. J. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. J Med Microbiol. , (2010).
- Kiyono, H., Fukuyama, S. NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).
- Parungo, C. P. Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics. Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).
- Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen. J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).
- Higgins, D. M. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).
- Kool, M. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J Exp Med. 205, 869-869 (2008).
- Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope. Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).
- Takahashi, S., Patrick, G. Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat. Lab Anim. 21, 31-31 (1987).
- Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).
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重印与许可
