我们通过气管途径，展示了一种将待测物质非手术递送至麻醉小鼠肺部的方法。该方法可使肺部暴露于细菌和病毒病原体、细胞因子、抗体、微珠、化学物质或染料中。我们进一步描述了肺组织及肺引流淋巴结（LDLNs）的采集与处理，以用于流式细胞术分析。
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摘要
摘要
肺泡巨噬细胞和肺树突状细胞（LDCs）等吞噬细胞持续从肺部肺泡腔中摄取抗原。特别是LDCs，已知其会迁移至肺引流淋巴结（LDLNs），并在其中将吸入的抗原呈递给T细胞，从而针对多种免疫原启动适当的免疫应答1,2。为了在小鼠中模拟肺部与空气传播抗原之间的相互作用，可通过鼻内途径1,3,4、气管内途径5或气溶胶形式6给予抗原。每种给药途径均涉及不同的技术要求和局限性，在设计实验前需加以考虑。例如，鼻内和气溶胶暴露会将抗原递送至肺部和上呼吸道。因此，抗原可能进入鼻相关淋巴组织（NALT）7，从而可能使实验结果的解释复杂化。此外，小鼠的吞咽、打喷嚏以及呼吸频率也可能导致给药剂量不一致。尽管在某些研究中可能希望上呼吸道参与反应，但对于专注于肺部特异性启动事件的研究而言，这可能会增加实验复杂性。在此情况下，气管内（i.t.）给药途径更为理想，因其可将测试物质直接递送至肺部，并绕过NALT。目前许多气管内注射方案需通过口腔盲插气管插管，或通过外科手术暴露气管以进入肺部。本文中，我们描述一种简单、稳定且无需手术的气管内滴注方法。使用喉镜可视化气管开口，然后将弯曲的灌胃针直接插入气管以递送接种物。我们还描述了采集和处理LDLNs及肺组织的步骤，以便通过流式细胞术分析抗原的迁移过程。
方案
1. 流程开始前，准备并收集以下物品
- 请参考图 1a) 和 1b) 中的图像，制作用于在操作过程中固定小鼠的木质平台。
- 淋巴结消化液 — HBSS + 1.25 mg/ml IV型胶原酶 或 2.5 mg/ml 胶原酶D
- 肺组织消化液 — HBSS + 1 mg/ml 胶原酶
- 将乳胶微珠用 PBS 稀释（1:20），用于腹腔注射以示踪 LDLN
注意： LDLNs 体积较小且难以找到。为学习如何定位它们，可向小鼠腹腔内注射 200μl 1:20 稀释的红色荧光乳胶微球。腹膜液体会引流至这些 LDLNs8。感染后 24 小时（24 hpi），按上述方法暴露小鼠胸腔。由于从腹腔引流而来的微球聚集，LDLNs 会呈现粉红色。
- 红细胞（RBC）裂解缓冲液 - 0.15M NH₄Cl4Cl, 10 mM KHCO₃3，0.1 mM Na21 L dH₂O 中的 EDTA20. 调节pH至7.2-7.4，室温保存。
- 70μm 或 100μm 细胞筛
- 0.5 M EDTA 储存液，pH = 8.0
- 不含 CaCl 的 HBSS2<....
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讨论
我们已利用该方案研究炭疽杆菌（Bacillus anthracis）孢子从肺部向局部引流淋巴结（LDLNs）的迁移过程。对于类似应用，应谨慎选择递送至肺部的颗粒数量，以确保通过流式细胞术可在局部引流淋巴结中检测到注入的物质。我们还成功地将该方法用于细胞的过继转移，以及利用荧光标记抗体对特定肺细胞群体进行标记。此外，该方法常规用于将博来霉素（一种肺纤维化化学诱导剂）和细胞因子直接递送至肺部10。
尽管该方法可实现将测试物质稳定递送至肺部，但需要经过大量培训和验证（可通过向肺内灌注染料来实现）。由于该方法避开了上呼吸道，因此可能不如其他吸入途径具有相同的生理相关性，而上呼吸道可能是重要相互作用和免疫应答的起始部位。然而，在以下情况下，该方法更具优势：即当头颈部区域淋巴结对给药物质的摄取以及呼吸道上皮的刺激可能使实验结果解释复杂化时。与所有模型一样，在实验设计过程中应充分考虑剂量、递送载体、注入物质的分布、对呼吸道上皮的损伤以及麻醉的影响等实验因素。与传统的气管内灌注（i.t. instillation）方法相比，我们认为该方法显著减少了对呼吸道上.......
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披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70μm 细胞筛 | BD Biosciences | ||
| 苯胺蓝 | 菲舍尔科技公司 | A967-25 | |
| 动物饲喂针头 | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| 胶原酶 | 西格玛奥德里奇公司 | C2139 | |
| IV型胶原酶 | 沃辛顿生化公司 | ||
| 胶原酶D | 罗氏集团 | 11088974103 | |
| DPBS | 英坦科技公司 | 14190 | |
| 荧光亮黄YG微球（0.5μm） | Polysciences, Inc. | 17152 | |
| 不含氯化钙和氯化镁的HBSS | 英坦科技公司 | 14170 | |
| 盐酸氯胺酮（100 mg/ml） | 赫施拉公司 | ||
| 喉镜片 | PennCentury, Inc | 适用于型号 LS-1 | 请参考 www.penncentury.com |
| 轻质光纤喉镜 | Welch Allyn | 80814 | |
| 红色荧光微珠（0.5μm） | 英坦科技公司 | F8812 | 用于腹腔注射 |
| 赛拉嗪（100 mg/ml） | Lloyd, Inc. |
参考文献
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Imm....
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