体内 激光轴突切断术在 C. elegans 中的应用

摘要

本文介绍了一种使用 MicroPoint 脉冲激光器在 C. elegans 中切割神经元的实验方案。我们描述了系统的设置、线虫的固定以及标记神经元的切断操作。该方法的优点包括系统相对低成本，以及能够在活体（in vivo）中切断神经突或消融细胞。

摘要

神经元通过轴突和树突与其他细胞进行通信，轴突和树突是含有突触前或突触后特化结构的细长膜突起。当神经元因损伤或疾病而受损时，可能具有再生能力。细胞内在因素和外在因素均会影响神经元的再生能力及其功能恢复。近年来，线虫 C. elegans 已成为识别影响神经元再生相关基因和信号通路的优良模式生物^1-6。在 C. elegans 中诱导神经元再生的主要方法是激光介导的切割，即轴突切断术（axotomy）。在轴切过程中，利用高能脉冲切断荧光标记的神经元突起。最初，C. elegans 中的神经元再生研究采用的是放大飞秒激光器⁵。然而，后续的再生研究表明，常规脉冲激光器也可用于在体（in vivo）精确切断神经元，并引发类似的再生反应^1,3,7。

我们提出了一种用于执行的实验方案 体内 使用MicroPoint脉冲激光系统在蠕虫中进行激光轴突切断，该系统是一种即用型设备，可轻松获取，且已被广泛用于靶向细胞消融。本文描述了激光的校准、蠕虫的固定、特定神经元的切断以及后续再生情况的评估。该系统能够在一次实验中对多只蠕虫中的大量神经元进行切断。因此，本文所述的激光轴突切断技术是启动并分析再生过程的一种高效系统。

方案

1. 组装系统

我们系统的具体组件如下所述。当正确组装后，用户应能够单手操作显微镜调焦，另一只手移动载物台（可通过鼠标或操纵杆），同时用脚踏板激活激光，并清晰地观察屏幕上的图像。

1. 安装在复合显微镜落射荧光端口的MicroPoint激光系统。我们使用的是Nikon 80i，但任何研究级的正置或倒置显微镜均可适用。MicroPoint系统包含一个定制的二向色镜，其应与标记待切割细胞的荧光染料相匹配。若使用其他荧光染料标记细胞，则需额外配备相应的二向色镜。此外，MicroPoint系统还配备有脉冲发生器和脚踏开关。
2. 用于手术操作和再生评估的100x、1.4 NA油镜，以及根据需要用于在载玻片上定位样品的其他物镜。我们使用Nikon Plan Apo VC物镜进行手术，并发现4x物镜在粗调焦和寻找样品时非常有用。
3. 带操纵杆的电动载物台。由于载物台仅用于目标定位，因此无需极高精度和重复性的型号。我们使用Prior OptiScan II（见讨论部分）。
4. 相机。相机需具备足够的帧率，以便在计算机显示器上观察时，使用100x物镜对标记的神经突进行聚焦和靶向。我们倾向于在轴突切断过程中衰减照明光，以避免光漂白或光损伤可能带来的干扰效应（见下文1.7）。因此，相机必须具有足够高的灵敏度以适应降低的光照强度。我们使用Hamamatsu Orca 05G相机，发现16.3 Hz的成像速度已足够。其他性能相当的相机也可替代使用。
5. 可驱动相机的计算机、显示器及成像软件。此外，我们还使用成像软件通过鼠标控制电动载物台（见讨论部分）。
6. 气浮平台。该需求可能因实验地点而异，但由于手术使用100x物镜进行，我们认为减振隔离至关重要。
7. 带有光导和快门机制的光源系统，用于激发荧光染料。光导将连接至MicroPoint系统。快门机制可用于独立于激光调节照明强度。我们使用Prior Lumen 200或Leica EL6000光源，并在轴突切断过程中将总光强衰减高达80%。

2. 激光装置设置

MicroPoint 激光系统提供了用于初始校准和聚焦激光的详细方案。我们假设在初次安装时已成功完成该步骤，其中包括将激光与目镜中的十字线对齐。本文提供激光聚焦和强度的常规维护方案。

如MicroPoint使用手册所述，脉冲氮激光器可能对人眼造成严重损伤。切勿直接注视激光束。安装屏障滤光片后，应能安全阻隔通过目镜的辐射。

在大小如沙粒的生物体中切割神经元可能具有挑战性。由于激光造成的损伤区域非常小，因此必须知道激光焦点的三维位置，才能精确定位样品。通过使用镜面载玻片来确定激光焦点的位置。首先，我们检查激光焦点的 z 位置是否与成像光路的焦点一致。接着，在成像软件中用十字线标记损伤焦点的 x-y 位置。

在 z 平面上聚焦

1. 推入中性密度滤光片 ND16（图 1a）。我们在落射照明光路中使用中性密度滤光片，以便在聚焦时衰减激光强度。若需更精细的聚焦，可同时推入 ND16 和 ND4 荧光滤光片。
2. 将 MicroPoint 激光器设置为 1 次脉冲，切换开关置于“Select”位置（图 1b），然后将滤光轮转至相应的长通阻断滤光片（图 1c）。
3. 将带反射镜的载玻片放置在载物台上，使用透射光和 4X 物镜对其中的小孔进行聚焦。
4. 在带反射镜的载玻片上滴加一滴浸油，使用 100X 物镜重新对小孔进行聚焦。使用光路切换杠杆（图 1d）打开相机快门，并打开激光快门（图 1e）。如有必要，降低透射光强度，使小孔边缘清晰锐利：这有助于实现精确聚焦。
5. 踩下脚踏开关。若激光聚焦正确，应在反射镜上产生一个小孔。
6. 将显微镜焦点略微调至带反射镜载玻片平面上方，再次发射激光。此次产生的孔应比第一次更小，或完全不留痕迹。再通过将焦点调至载玻片平面下方重复此步骤。
7. 若在步骤 2.5 中未产生小孔，或在聚焦于反射镜表面之上或之下时产生较大的孔，则需使用消融头上的聚焦环重新调整激光焦点。确认小孔仍与目镜中的十字线准确对齐。在持续使用过程中，z 轴焦点通常很少需要调整。

在 x-y 平面内聚焦

8. 按照上述步骤 2.1 至 2.3 操作，并踩下脚踏板在镜面载玻片上打一个小孔。
9. 从 Elements 的“采集”菜单中启动“实时”采集模式。在“测量”工具栏中选择“ROI 编辑器”，然后选择“双十字”工具，拖动十字线使其与新孔的中心对齐。点击“保存 ROI”，然后点击“退出编辑器”，并恢复实时采集模式。
10. 在 Elements 中启用“鼠标 XY”设置，以通过鼠标操控载物台。
11. 将中性密度滤光片恢复至原始位置，将激光脉冲数设为 10，并移除镜面载玻片。

调节激光功率

12. 激光功率应调整至能够切割所选神经元的最低必要功率。在切割活体线虫时（如下所述），通过移动衰减板（图1f）来调节功率。如果激光功率过高，会造成周围组织损伤或在线虫体内炸出孔洞；如果激光功率过低，则无法切断神经元。系统设置完成后，通常无需频繁更改衰减板的位置。若激光强度减弱，需移动衰减板才能继续进行切割，这可能表明染料池中的染料需要更换（见讨论部分）。

3. 固定线虫

1. 配制含有3%熔融琼脂糖的M9溶液（22 mM KH2PO4、42 mM Na2HPO4、85 mM NaCl、1 mM MgSO4）。将5 mL熔融琼脂糖分装至15 mL离心管中。另取一管加入水。将离心管置于设定为55°C的模块化加热装置中，并向加热装置内加水，使每个离心管形成小型水浴。注意：琼脂糖可预先大量配制，并在后续实验中重新熔化使用。
2. 取两张载玻片，每张上贴两层标签胶带，并将一张洁净的载玻片置于二者之间。使用塑料球形吸头移液器吸取一滴熔融琼脂糖，滴加至洁净载玻片中央，再将另一张载玻片垂直放置于其上，使形成的琼脂糖垫厚度等于两层胶带的厚度（图2）。30秒后移除其中一张载玻片。将塑料吸头用清水冲洗后，存放于装有水的离心管中，供后续制备载玻片时重复使用。
3. 随后，在琼脂糖垫中央加入3–5 μL的0.10 μm或0.05 μm聚苯乙烯微球。加入5–10条在目标神经元中表达荧光蛋白的线虫。若目标神经元在线虫身体左右侧不对称分布，需使用铂金挑针翻转线虫，使正确的一侧朝上。线虫必须在琼脂糖垫制备后10分钟内放置到载玻片上。
4. 小心地将盖玻片覆盖在线虫上方。盖上盖玻片后，不得使其相对于琼脂糖垫移动，否则会破坏角质层并损伤线虫。将制备好的载玻片置于显微镜载物台上。

4. 切割神经元

1. 使用光路切换杆将光线导入目镜，用4X物镜对准待切割的线虫，于盖玻片上滴加一滴镜油，切换至100X物镜。随后将光路重新切换回相机。
2. 使用鼠标将目标神经元移至十字准线中心位置，踩下脚踏开关以发射激光，切断神经突。必要时可使用两组脉冲完成神经元的切断。初期建议精确记录每条线虫中被切断的神经元，以便评估后续再生情况。操作正确时，激光轴突切断术可在神经元上产生微小断裂，而不会对周围皮肤组织或其他神经元造成明显损伤（见图3）。在某些情况下，损伤部位周围可能形成微小瘢痕。
3. 通过垂直向上取下盖玻片回收线虫，注意保持线虫留在琼脂糖垫上。切勿滑动移除盖玻片。然后用尖头镊子在虫体周围剪下琼脂糖垫，并将该部分琼脂糖转移至新鲜涂布OP50⁸的大肠杆菌NGM平板上。在垫上加入10 μL无菌M9缓冲液，以使线虫脱离微珠并去除琼脂糖残留。

5. 对神经元再生进行评分

1. 按照步骤 2.2 中所述制备琼脂糖垫。
2. 将线虫置于 3–5 μL 聚苯乙烯微珠中，加盖盖玻片。载玻片可依次制备，也可预先集中处理所有线虫，并将载玻片置于直径 10 cm 的培养皿中，每个培养皿内放置一张湿润的 Kimwipe 纸以保持琼脂糖湿润。
3. 使用 100X 物镜观察被切断的神经元。在许多神经元中，切割位点远端会残留一段神经元残端。我们以此残端的存在作为神经元确实被切断的依据（图 4）。该残端的存在使得能够区分已被切断并发生再生的神经元与未被切断的神经元。注意：远端和近端残端在被切断后均会立即发生回缩。
4. 评估再生情况。可测定多种参数。一种简单的检测方法是判断受损神经元是否形成了生长锥（图 4a）并完成再生，或未形成（图 4b）。此外，也可追踪并比较神经突的长度。

6. 代表性结果

以γ-氨基丁酸（GABA）运动神经元的再生表征为例进行说明。这些神经元位于腹侧神经索中，并发出突起环绕延伸至背侧神经索，对正常运动功能至关重要⁹。可通过在unc-47或unc-25启动子的调控下表达基因编码的荧光蛋白（如绿色荧光蛋白GFP），来可视化GABA神经元（菌株分别为EG1285和CZ1200，可从C. elegans遗传中心获得）。

按照所述方法制备L4期线虫的样品，翻转线虫使其右侧的GABA能神经元朝上，加盖盖玻片。在每条线虫背侧和腹侧神经索之间的中点位置切断1-3条后部连合神经。避免切断与其他连合神经交叉或束状伴行的连合，因为这些结构后续难以准确评分。按照所述方法回收线虫。

成功进行轴突切断术后18至24小时，线虫已从手术中恢复，表现出正常的运动和产卵行为。丢弃已死亡或状态异常的线虫。按照前述方法重新制备剩余线虫，并评估其再生情况。我们通常每种实验条件下至少评估30个被切断的神经元。在oxIs12品系动物中，通常有60%-70%的L4期GABA能神经元会启动生长锥结构，表现为轴突末端膜结构增宽，并延伸出多个神经突分支，且已从切断部位迁移（图4a）。在许多情况下，生长锥已迁移至背侧神经索、邻近的神经横向连接或远端残端。其余约30%的神经元则未启动明显生长，仅在轴突切断处形成近端残 stump，或仅延伸出少量丝状伪足（图4b）。

图1. 紫外脉冲激光切片系统。具体组件包括：(a) 中性密度滤光片（ND滤光片）、(b) 脉冲选择器、(c) 滤光轮拨杆、(d) 光路切换拨杆、(e) 激光快门和 (f) 衰减板。

图 2. 制备琼脂糖垫。为制备所需厚度的琼脂糖垫，需在两张载玻片上各贴两层胶带（绿色）。将一张载玻片置于前两张之间，然后在干净的载玻片上加入一滴琼脂糖溶液。最后，将第四张载玻片垂直放置于前三张之上，从而形成厚度相当于两层胶带的琼脂糖垫。

图3. 代表性GABA能神经元轴突切断图像。在典型实验中，GABA能神经元的连合纤维在蠕虫侧部中段被切断。左图和右图分别显示了轴突切断前（左图）和切断后（右图）的情况。所有图像均使用100倍油镜拍摄。

图4. GABA能神经元轴突切断的代表性结果。轴突切断后24小时，对切断的轴突进行再生评分。图(a)显示了一条带有生长锥的再生轴突（箭头），而图(b)中可见一条未再生的轴突，表现为近端残端（箭头）。每个被切断轴突的远端残端在各图中均有显示（空心箭头），表明轴突已被切断。

讨论

已有多种激光系统被用于切割 C. elegans 的神经突，多项研究已对其性能进行了详细评估^3,7,10,11。本实验方案中使用的 MicroPoint 激光系统是一种即插即用型设备，安装和维护简便，且相较于钛宝石（Ti-Sapphire）激光系统，成本较低。然而，与钛宝石系统相比，MicroPoint 激光可能会对更大范围的组织造成损伤，这在某些应用中可能具有不利影响。如果需要使用钛宝石系统，已有出色的构建方案可供参考¹²。

本方案可应用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的多种神经元；然而，不同类型的神经元在再生能力上存在差异是预期之中的¹³。此外，不同的转基因背景也可能影响再生的成功率。尽管在不同转基因标记品系之间，GABA能神经元再生的比例相对一致，但我们注意到，在juIs76¹⁴与oxIs12¹⁵线虫之间，前者的总体再生水平略有提高。针对触觉神经元标记物之间的差异也已有相关报道²。

我们倾向于使用微珠而非麻醉剂来固定线虫，因为微珠能实现更快且更一致的固定效果¹⁶。这种方法还有一个优势，即我们能够观察再生过程，而不会受到麻醉可能带来的混杂效应的影响¹⁷。另一种无需麻醉剂的固定方法是使用微流控装置。微流控技术在轴突切断实验中的应用已有广泛报道^17-22。

我们发现，若持续使用，按照MicroPoint操作手册中所述步骤每周更换一次染料池中的香豆素440（Coumarin 440），激光器的工作状态最佳。必要时，可使用衰减滑块来提高功率，但这可能是染料老化或激光未对准的迹象。此外，染料池的使用寿命有限，最终需要重建或更换（参见故障排除部分）。

将目标神经突移至标记激光焦点的十字线下方可能较为困难，特别是当动物未完全麻痹时。我们发现手动载物台并非最佳选择，尽管仍可使用。由操纵杆控制的电动载物台更为精确，我们发现使用支持通过鼠标拖动图像来移动电动载物台的软件效果最好。Nikon Elements 具备此功能，本方案中对此进行了描述，但免费的 Micromanager 软件以及其他成像软件也可能具有类似功能。另一种精细定位的方法是移动激光焦点，而非移动动物本身。若倾向于采用此方法，MicroPoint 激光系统可选配检流计光束导向装置。

除了用于研究神经元再生外，该激光技术还可用于消融其他细胞类型，如皮肤细胞、肌肉细胞或特化细胞，或用于破坏特定的神经元突触^23-27。此外，该系统还可用于研究在损伤或疾病过程中调控神经元变性的相关通路。因此，脉冲激光的应用将继续揭示促进神经元再生及其他相关过程的遗传因素和细胞生物学变化。

故障排除：

本文介绍了一些常见问题及其相应的解决方案。

1. 激光无法正常切割。这可能是由于激光失焦（参见第2节），或染料池中的染料需要更换（参见MicroPoint操作手册）。此外，也可能需要更换或重建染料池。
2. 线虫在琼脂糖垫上移动。这通常表明琼脂糖垫过于湿润。我们发现，在放置线虫前将垫片静置约30秒可避免此问题。您也可以尝试使用更小尺寸（0.05 μm）的微珠。
3. 线虫回收困难且效率低下。这可能是由于盖玻片移除不当或琼脂糖垫过干所致。如果垫片太干，您可能会观察到轴突出现串珠样形态。在某些情况下，这是由于线虫未在制备后及时放置到垫片上所致。此外，反复熔化的琼脂糖溶液储存过久后，其浓度可能高于3%。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05 μm 聚苯乙烯微球	Polysciences, Inc.	08691
0.10 μm 聚苯乙烯微球	Polysciences, Inc.	00876
琼脂糖 GPG/LE	American Bioanalytical	00972	超纯
Falcon 14 ml 聚苯乙烯圆底管	BD Biosciences	352057	17 x 100 mm 型号，无热原
Thermo Scientific 普通预清洁载玻片	Erie Scientific	420-004T	3" x 1" x 1 mm
盖玻片	VWR international	48366 205	18 mm x 18 mm No. 1 1/2
KIMTECH Science Kimwipes 擦镜纸	Kimberly-Clark Corporation	34155
BD Falcon 100 x 15 mm 型式培养皿	BD Biosciences	351029
空白胶带 3/4w x 500L	TimeMed	T-512
浸油	Nikon Instruments		类型 A，nd=1.515
EG1285 或 CZ1200	Caenorhabditis Genetics Center	http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/
OptiScan II	Prior Scientific
NIS-Elements Ar 或 Br	Nikon Instruments
MicroPoint 消融激光系统	Photonic Scientific
复合显微镜	Nikon Instruments	Eclipse 80i
Hamamatsu 相机	Hamamatsu Corp.	Model C8484-05G01
配备 Intel Core 2 Duo 的 Dell Precision T3400 台式机	Dell
Windows XP Professional		Microsoft	版本 2002，Service Pack 3
双孔干浴恒温箱	Fisher Scientific		模拟控制
4X Plan Fluor 物镜	Nikon Instruments
100X Plan Apo VC 浸油物镜	Nikon Instruments
Dumont #5/45 镊子	Dumont	11251-35	Dumoxel 标准尖头，也可使用 #7
解剖显微镜	Nikon Instruments	SMZ800	配备 NI-150 高强度照明器