成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胰岛素敏感性检测中的胰岛素注射与血淋巴提取方法

摘要

在果蝇Drosophila melanogaster中发现的保守胰岛素信号通路使该生物成为模拟包括2型糖尿病在内的代谢性疾病的潜在工具。为此，建立生理学检测方法以有效测量成年果蝇外周葡萄糖代谢中的全身性胰岛素作用至关重要。

摘要

在哺乳动物与果蝇之间存在着保守的营养感应机制，其中分别类似于哺乳动物胰岛素和胰高血糖素的肽类在幼虫发育阶段发挥维持葡萄糖稳态的功能^1,2。对基本处于有丝分裂后状态的成年果蝇的研究表明，胰岛素样肽（ILP）产生细胞（IPCs）的遗传性消融会导致葡萄糖稳态的紊乱³。因此，成年果蝇作为研究代谢性疾病（包括2型糖尿病）的合适遗传模型系统具有巨大潜力。为了进一步完善果蝇研究体系，必须建立与哺乳动物中用于检测葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性的生理测定方法相类似的实验手段。为此，我们近期描述了一种新颖的方法，用于测量成年果蝇的口服葡萄糖耐受反应，并证实了成年期IPCs在维持葡萄糖稳态中的重要性^4,5。在此，我们改进了一种先前报道的胰岛素注射方法⁶，并将其与一种新颖的血淋巴提取方法相结合，以测定成年果蝇的外周胰岛素敏感性。本方案的独特之处在于，能够直接进行生理学测量，评估成年果蝇在胰岛素注射后对外周葡萄糖负荷的清除能力。这一方法使得对胰岛素信号通路突变体以及影响成年果蝇葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性的潜在干预措施进行表征成为可能。

方案

1. 胰岛素溶液的制备

1. 通过将胰岛素溶解于 PBS 中，配制浓度为 0.01 mg/ml 的新鲜牛胰岛素溶液。在整个注射过程中，胰岛素/PBS 溶液和对照 PBS 溶液均需置于冰上保存。这些溶液中应加入 0.5%（v/v）FD&C 蓝色 1 号食用色素。

2. 针头准备与注射装置设置

1. 使用微量移液器拉制仪制备毛细玻璃针。以下拉制仪参数可制备出适合注射的高质量针头：加热温度 345；拉力 210；速度 100；时间 200（100ms）。新拉制的针头必须通过将针尖压过 Kimwipe 擦拭纸进行钝化处理。该钝化过程可去除细长且高电阻的针尖，形成更粗壮、孔径更大的针尖。
2. 将钝化后的针头针尖朝上放入含有胰岛素/PBS 溶液或仅含 PBS 的微量离心管中。毛细作用会使每根针头从后端自动填充液体。在体视显微镜下观察针尖，确保无任何碎屑或气泡出现在针尖处。丢弃任何填充不完全或不洁净的针头。
3. 将已填充液体的针头插入手动显微注射器的针头夹持器中，并使用显微操作器调整夹持器位置，使针尖在体视显微镜下清晰可见。通过旋转连接在显微注射器推杆上的手动显微注射器微调旋钮，对针头内的液柱施加正压。
4. 用 Kimwipe 擦拭纸轻触针尖，确认有液体流出，以验证已施加足够推动液体的正压。
5. 针头准备就绪后，用透明胶带将校准图表固定在针杆上，并在 20 倍放大倍率的体视显微镜下将针尖调至清晰对焦状态。

3. 果蝇准备

1. 使用10日龄的雌性果蝇进行注射实验。在羽化后24小时内收集果蝇，用加湿的CO₂在气体垫上麻醉，分选出雄蝇，并将雌蝇放入含有标准饮食或处理饮食的小瓶中。将雌蝇维持在实验饮食上培养10天。
2. 在羽化并转入实验饮食后的第10天，将果蝇从小瓶（含食物）转移至含有5 ml 2%琼脂塞的小瓶中，饥饿处理12–16小时。
3. 在胰岛素注射前1小时，将饥饿处理的果蝇转移至含有10%葡萄糖浸润滤纸的小瓶中。
4. 葡萄糖饲喂后，用加湿的CO₂短暂麻醉果蝇，随后将其置于冰上进行低温固定。

4. 注射操作步骤

1. 用一对精细镊子轻轻夹住一只经低温固定处理的果蝇，将其靠近针尖，使针尖位于果蝇胸部左侧前部区域的旁边。在体视显微镜下将针尖和果蝇胸部同时调至清晰对焦状态。
2. 轻轻移动果蝇使其朝向针尖，使针尖接触果蝇胸部左侧前盾区隆起部分的中心位置（图1）。当果蝇被正确取向并对准针尖后，继续推进果蝇使其穿刺到针上，使针尖刺入前盾区中央。
3. 根据需要，通过微注射仪的微操纵旋钮推动注射器活塞施加正压，直至向果蝇体内注入0.1 μl液体。液体进入果蝇血腔后会使胸部前部左侧呈现蓝色。偶尔需要反复回撤和推进数次，以清除针尖可能的堵塞，确保液体顺利流出。
4. 将注射后的果蝇置于含2%琼脂的离心管中，按指定时间点恢复培养，随后进行血淋巴提取。

5. 血淋巴采集

1. 在所需的注射后时间点，用加湿的 CO₂ 对果蝇进行短暂麻醉，并将每只果蝇背侧朝下固定在粘附于 CO₂ 垫表面的双面胶带上。将果蝇排列成整齐的行，使头壳对齐。可使用修剪过的木质涂布棒将果蝇翅膀压入胶带粘合剂中，以确保其固定不动。
2. 果蝇固定于胶带后，用精细镊子夹住每只果蝇的喙器，并轻轻将其向腹侧然后向后方牵拉，以便通过体视显微镜观察到头壳的前部。
3. 另一只手在保持喙器位置的同时，使用锋利的钨针刺穿头壳中央、额缝上方的位置（图 2）。需注意不要将针插入过深，以免针尖穿透头壳另一侧，导致无法控制血淋巴的流出。在收集血淋巴前，应先完成同一批次所有果蝇的穿刺操作。
4. 头壳穿刺完成后，使用修剪过的木质涂布棒轻轻按压果蝇腹部。按压时可将果蝇翻转，使其腹侧朝下放置，有助于操作。此步骤将使血淋巴从头壳穿刺处形成液滴渗出。
5. 将一根 1μl 微量毛细管的一端接触从头壳穿刺处渗出的血淋巴液滴，血淋巴将通过毛细作用进入管内。通过将毛细管内的液柱与标准体积刻度图对照，确定并记录所收集的血淋巴量。

6. 血淋巴葡萄糖测定

1. 将血淋巴样品注入含有100 μl Infinity葡萄糖试剂的微孔板孔中。加样过程中将微孔板置于冰上。
2. 分别加入50 mM、25 mM、12.5 mM、6.25 mM和3.125 mM的葡萄糖标准溶液各1 μl，建立标准曲线。
3. 在37°C下孵育样品10分钟。
4. 在340 nm处检测吸光度。
5. 根据采集的血淋巴体积，利用已知葡萄糖浓度的标准曲线确定样品中的葡萄糖浓度。

7. 代表性结果

在注射胰岛素的果蝇中可检测到典型的胰岛素耐受反应，表现为注射后15分钟循环葡萄糖水平下降。相比之下，注射PBS的果蝇中未观察到此类反应（图3）。在注射胰岛素的果蝇中，外周葡萄糖清除的这一反应可持续至注射后30分钟。我们通常从每组注射的4-5只果蝇中常规提取0.2-0.5 μl的血淋巴。每次实验包含三个注射组。

图 1. 黑腹果蝇胸部左侧示针头插入位置（修改自 Demerec，1950）⁷。将针头插入胸部左侧前背区前盾片的中心位置。

图 2. 显示果蝇头部正面观，标示血淋巴提取的穿刺位置（改编自 Demerec，1950）⁷。使用精细打磨的钨针，在头壳顶部中央、额缝正上方位置穿刺头壳。

图 3. 在对照组成年果蝇中检测到的典型胰岛素耐受性反应。对照组 w¹¹¹⁸ 果蝇注射牛胰岛素（PBS 中含 1 ng）或仅注射 PBS。随后，各重复组果蝇分别恢复 0、15 或 30 分钟，并测定其循环葡萄糖水平。

讨论

本报告所述技术在任何研究可检测到的生理过程变化的研究中均具有潜在应用价值 果蝇 血淋巴成分。通过以这种方式结合注射与血淋巴采集，可确定特定实验处理或操作所引起的即时生理相关效应。相较于以往涉及断头的血淋巴采集方法，这种“放血”技术的主要优势在于 ² 该技术的优势在于可最大限度地减少血淋巴样本被肠道内容物污染。若小心操作以避免采集到可能出现在渗出血淋巴液滴中的围脑脂肪体组织，则样本可准确反映其状态 体内 循环液

在此类规模的注射实验中，一个潜在的干扰因素是注射后循环液总体积的初始稀释。然而，这一因素可通过向实验组果蝇注射相同体积的磷酸盐缓冲液（PBS），或向年龄匹配的对照组注射胰岛素，并对结果进行归一化处理而有效控制。为确保循环葡萄糖读数的可重复性，血淋巴液滴的质量最为关键。仅应收集不含围脑脂肪体或其他组织碎片的透明血淋巴液滴用于葡萄糖测定。此外值得注意的是，在测定相对葡萄糖浓度前，收集的样本数不应超过8个。我们注意到，当血淋巴样本在冰上放置较长时间后，OD₃₄₀读数会出现“漂移”现象。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛胰岛素	Sigma-Aldrich	I5500
Infinity 葡萄糖试剂	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TR1541
手动显微注射器	Sutter Instrument Co.
P-87 Flamming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Co.
单管硼硅酸盐毛细管玻璃	A-M Systems	626000
FD&C 蓝色 No. 1	McCormick & Co.
1 μl 微量毛细管	Drummond Scientific
三轴手动显微操作器及底座	World Precision Instruments, Inc.