内质网在蛋白质生物合成和钙稳态中起关键作用。我们已建立一个实验系统，可用于研究Ca2+泄漏通道的作用，并表征其可能的调控机制。该系统包括siRNA介导的基因沉默和活细胞Ca2+成像。
方法文章
活细胞钙成像结合siRNA介导的基因沉默技术鉴定内质网膜上的Ca2+渗漏通道及其调控机制
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
在哺乳动物细胞中，内质网（ER）在蛋白质生物合成以及钙信号传导中发挥关键作用1内质网膜中的异源三聚体 Sec61 复合物为新合成的多肽链进入内质网腔提供了水相通道。近年来多个实验室的研究表明，该异源三聚体复合物还可能形成瞬时的 Ca2+ 漏通道2-8. 这一观点的关键观察依据是，新生多肽链通过嘌呤霉素从核糖体和Sec61复合物释放后，会导致Ca²⁺的瞬时释放2+ 从内质网。此外，已有观察发现 体外 内质网腔蛋白 BiP 参与防止 Sec61 复合物水平上的离子通透性9,10我们建立了一个实验系统，可直接研究Sec61复合物作为潜在Ca2+ 漏通道并表征其假定的调控机制11-13. 该系统结合了siRNA介导的基因沉默与活细胞Ca2+ 成像13. 细胞分别用靶向编码区和非翻译区（UTR）的siRNA进行处理 SEC61A1 基因或阴性对照 siRNA。在互补分析中，细胞共转染一个 IRES-GFP 载体，该载体可实现野生型基因的 siRNA 抗性表达 SEC61A1 基因。然后用比率型 Ca2+-指示剂 FURA-2 以同时监测胞质 Ca²⁺ 的变化2+ 通过荧光显微镜测量多种细胞中的浓度。细胞质 Ca 的连续测量2+ 还可用于评估多种试剂（如嘌呤霉素、小分子抑制剂和毒胡萝卜素）对Ca的影响2+ 泄漏。该实验系统使我们能够独特地评估不同内质网膜蛋白对被动钙2+ 从多种细胞类型的内质网中流出，ii) 鉴定限制这种被动 Ca2+ 外排，以及 iii) 研究疾病相关突变对相应组分的影响。
方案
1. 储备液的配制
- 配制无钙缓冲液（140 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、0.5 mM EGTA、10 mM 葡萄糖溶于 10 mM HEPES-KOH，pH 7.35）。
- 将 FURA-2 AM 溶于 DMSO 中，配制成 1 mM 储存液。使用涡旋振荡器混匀，直至溶液呈均匀的淡黄色。避光保存。将 FURA-2 AM 储存液稀释至 1 ml 含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中，终浓度为 4 μM，用于 HeLa 细胞负载。
- 用蒸馏水（pH 7.0）配制 12.5 mM 嘌呤霉素储存液。分装后于 -20°C 保存。使用前将 12.5 mM 嘌呤霉素储存液用无钙缓冲液稀释至终浓度为 500 μM。
- 将毒胡萝卜素溶于 DMSO 中，配制成 1 mM 储存液。
- 将 1 mg 斑蝥素 A 溶于 20 μl 氯仿中，随后加入 25 μl DMSO 混匀。微型离心管保持敞口直至氯仿完全挥发，最终斑蝥素 A 浓度为 100 mM。分装后于 -20 °C 保存。使用前将储存液用无钙缓冲液稀释至终浓度为 100 μM，活细胞成像时终浓度 DMSO 不超过 0.1%。
- 将三氟拉嗪溶于 DMSO 中，配制成 10 mM 溶液，分装后于 -20 °C 保存。使用前将储存液用无钙缓冲液稀释至终浓度为 10 μM，活细胞成像时终浓度 DMSO 与斑蝥素 A 相同，不超过 0.1%。
- 将 siRNA（SEC61A1 siRNA、SEC61A1-UTR siRNA 和对照 siRNA）溶于无 RNase 水中，配制成 20 μM 储存液。使用涡旋振荡器混匀，并肉眼观察溶解情况。分装 50 μl 于 -20 °C 保存。
2. HeLa 细胞中的基因沉默
为了研究某种特定蛋白质对内质网Ca2+外流的贡献，必须使用两种不同的siRNA有效沉默相应基因（图1）。此外，还需通过表达相应的野生型基因来逆转沉默效应。通常，我们采用分别靶向目的基因编码区和非编码区（UTR）的siRNA。使用靶向UTR的siRNA可为功能互补实验提供便利。
- 在6 cm培养皿中接种5.2 × 105个HeLa细胞（ATCC编号CCL-2），培养皿内放置25 mm盖玻片（预先用200 μl聚-L-赖氨酸（1 mg/ml）处理1 h），加入含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，在37°C、5% CO2的湿润环境中培养（终体积为3.9 ml）。
- 使用HiPerFect转染试剂，按照制造商说明书将SEC61A1 siRNA、SEC61A1-UTR siRNA或阴性对照siRNA转染入细胞（siRNA终浓度为20 nM）。简要而言，在正式转染前，于独立的微量离心管中新鲜配制siRNA混合物：将20 μl HiPerFect转染试剂加入含4 μl各siRNA（20 μM）的80 μl OptiMEM溶液中。轻轻涡旋混匀，室温孵育10分钟。随后将siRNA混合液（104 μl）逐滴加入已接种的5.2 × 105个HeLa细胞（3.9 ml）中。
- 24小时后更换培养基（3.9 ml），并使用相同的siRNA混合液（104 μl）进行第二次转染。
- 通过Western blot分析评估基因沉默效果，沉默效率应高于80%。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养皿中的细胞，并在DMEM中收集细胞。使用Countess全自动细胞计数器进行细胞计数。用细胞裂解缓冲液（10 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 8.0，3 mM MgCl2，0.5% NP40）裂解细胞，同时加入蛋白酶抑制剂混合物（3 μg/ml Pepstatin A，3 μg/ml Leupeptin，3 μg/ml Antipain，3 μg/ml Chymastatin），再与SDS上样缓冲液（60 mM Tris-HCl，pH 6.8，2% SDS，10%甘油，5% β-巯基乙醇，0.01%溴酚蓝）混合，使终浓度达到10,000个细胞/μl。将样品在56 °C加热15分钟，随后加入玻璃珠，涡旋20分钟以剪切DNA。取每种样品20 μl进行Laemmli型SDS-PAGE电泳（通常分离胶为15%聚丙烯酰胺）。通过湿法电转印，在恒定400 mA电流下于转移缓冲液（100 mM甘氨酸，12.5 mM Tris-HCl）中将分离的蛋白质转移至PVDF膜，持续3小时或过夜。转膜后，用含5%（w/v）脱脂奶粉的PBS溶液室温封闭30分钟，然后分别孵育针对Sec61α C末端的兔源一抗和抗β-actin小鼠源一抗。用PBS-TritonX-100（0.05%）洗涤一次，再用PBS洗涤两次，每次5分钟。使用ECL Plex山羊抗兔IgG-Cy5或ECL Plex山羊抗小鼠IgG-Cy3偶联物，并结合Typhoon-Trio成像系统与Image Quant TL软件7.0进行信号检测。对于SEC61A1基因，最大沉默效应通常出现在首次转染后96小时。代表性实验结果见图2。
3. HeLa 细胞的互补实验
为了挽救SEC61A1沉默的表型，将SEC61A1 cDNA插入含有巨细胞病毒（CMV）启动子、多克隆位点（MCS）、内部核糖体进入位点（IRES）以及绿色荧光蛋白（GFP）编码序列的pCDNA3-内部核糖体进入位点（IRES）-GFP载体的多克隆位点（MCS）中。
- 首次siRNA转染后48小时，再次更换培养基（3.9 ml），并根据制造商说明书，使用Fugene HD将细胞转染空载体或SEC61A1表达质粒（载体与Fugene HD的最终比例为4 μg载体对应16 μl Fugene HD）。简言之，在转染操作前，于独立的微量离心管中新鲜配制质粒：将16 μl Fugene HD转染试剂加入溶解于80 μl OptiMEM中的4 μg各质粒中。轻轻涡旋混匀，室温孵育10分钟。将质粒混合液（0.1 ml）逐滴加入已接种的5.2 × 105 HeLa细胞（3.9 ml）中。
- 质粒表达48小时后，在进行钙成像和细胞收集之前，对培养皿进行荧光显微镜观察。如有必要，可用PBS替换DMEM以获得更佳的荧光信号。使用配备冷却CCD相机的荧光显微镜记录荧光图像。转染效率可通过计算显示GFP荧光的细胞数占明场模式下计数的总细胞数的比例来确定，效率应高于80%。典型结果如图3所示。
4. 活细胞钙离子成像
- 测量前，将转染的 HeLa 细胞接种在盖玻片上，并转移至另一个 3.5 cm 培养皿中。加入 1 ml 含 4 μM FURA-2 AM 的 DMEM，于 25°C 避光孵育 45 分钟11,12。
- 将 25 mm 盖玻片固定于 iMIC 金属腔室中，用无钙缓冲液洗涤细胞两次（每次 300 μl），并进行孵育。
- 在 iMIC 显微镜上使用多色光源 V，交替以 340 nm 和 380 nm 激发，检测 510 nm 处的发射荧光（滤光片设置：分光镜 565 nm；发射滤光片 605/70 nm），开始采集数据。每 3 秒采集一次图像，每帧包含 20–50 个细胞。以 F340/F380 比值记录 FURA-2 信号，其中 F340 和 F380 分别代表扣除背景后 340 nm 和 380 nm 处的荧光强度。
- 1 分钟后，向细胞中加入嘌呤霉素（500 μM）或等量无钙缓冲液。或者，加入小分子抑制剂（如 10 μM 三氟拉嗪或 100 μM ophibolin A）或仅加入无钙缓冲液。
- 在进行 2 或 10 分钟的比值测量后，加入毒胡萝卜素（1 μM），并继续测量。
- 最终，通过已建立的校准方法从比值测量结果估算细胞质 [Ca2+] 浓度2。使用 Excel 2007 和 Origin 6.1 进行数据分析。
5. 代表性结果：
到目前为止，我们探讨了沉默SEC61A1基因是否影响内质网（ER）中的钙离子（Ca2+）泄漏（图1）。在HeLa细胞中，使用两种不同的siRNA沉默SEC61A1基因达96小时。尽管沉默对细胞生长和活力几乎没有影响，但在半通透化细胞中，蛋白质向内质网的转运几乎完全被抑制。此外，SEC61A1基因沉默的细胞在内质网Ca2+泄漏方面受到严重影响。基因沉默的效应可通过重新表达SEC61A1基因而逆转。因此，存在于所有有核细胞内质网膜上的Sec61复合物可形成Ca2+泄漏通道，在Ca2+稳态中发挥关键作用。然而，Sec61复合物在内质网膜上形成的这种大而充满水的、具有非选择性离子通透性的孔道，会严重干扰Ca2+从内质网腔向胞质溶胶的受控释放——这是细胞内信号传导的重要机制。我们在哺乳动物Sec61α的胞质N端鉴定出一个钙调蛋白（CaM）结合基序，该基序以纳摩尔亲和力和序列特异性结合CaM，但不结合无Ca2+的脱钙钙调蛋白（apocalmodulin）。在细胞水平上，两种不同的CaM拮抗剂仅在存在Sec61通道的情况下促进内质网中Ca2+的释放，而在缺乏Sec61通道时则无此现象（图4和图5）。当Sec61通道中Sec61α的IQ基序发生突变时，该效应未被观察到。因此，Ca2+-CaM参与限制内质网中Ca2+的泄漏（图6）。
图1．流程图。详见正文。
图 2. 沉默效率的数据分析。通过使用靶向 Sec61α 和 β-actin（上样对照）的抗体进行 Western blot 分析，以评估沉默效果。使用 ECL Plex 二抗及荧光成像技术对一抗进行检测。
图3. 转染效率数据分析。图像使用配备冷却CCD相机的荧光显微镜采集。转染效率可通过统计显示GFP荧光的细胞数量，并除以明场模式下计数的总细胞数来确定。
图4. 对照组或处理组存在下，活细胞钙成像的 HeLa 细胞截图 SEC61A1-siRNA 以及钙调蛋白拮抗剂 ophiobolin A 的有无。HeLa 细胞用针对 SEC61A1 (B) 或阴性对照 siRNA (A) 处理 96 小时，如图所示。这些细胞负载钙离子指示剂 FURA-2 AM，并在含钙缓冲液中孵育2+ 含 0.5 mM EGTA 的无钙缓冲液孵育后，加入缓冲液或含蛇孢菌素 A（Ophio A）的缓冲液继续孵育。10 分钟后，Ca2+ 通过在无外源 Ca 的条件下加入毒胡萝卜素（TG）启动释放2+ 继续孵育。在指定时间点拍摄连续钙成像的截图。
图5. 活细胞钙成像实验的数据分析。（A）如图4A所示的一系列实验的动力学与定量分析。细胞质[Ca2+]通过已建立的校准方法2从比值测量中估算。毒胡萝卜素的作用以柱状图形式展示。（B-D）细胞用对照siRNA或指定的SEC61A1-siRNA处理48小时，随后转染对照载体（C），或SEC61A1表达质粒（C），或突变型SEC61A1表达质粒（D），如图所示。48小时后，按照图4和图5A的方法进行钙成像实验。展示了如A图所示实验中加入毒胡萝卜素后细胞质Ca2+浓度变化的统计分析结果。通过非配对t检验定义P值<0.001为显著，用三个星号（***）表示；n.s.，无显著性差异。分析的细胞数量已标明。数据以平均值表示，误差线代表均值的标准误（s.e.m.）。需说明的是，这些示例改编自参考文献13。
图6. 这些数据表明，新生肽链从Sec61复合物释放确实会导致内质网中的钙离子释放，并在Sec61复合物胞质口周围形成钙纳米结构域。该钙离子被钙调蛋白结合，钙-钙调蛋白复合物可关闭Sec61复合物。
讨论
在哺乳动物细胞中，内质网（ER）在蛋白质生物合成以及钙信号传导中发挥关键作用。本文描述了一种实验系统，可直接探究一种潜在的Ca2+泄漏通道的作用，并表征其假定的调控机制13。该实验系统为我们提供了独特的机会：i）评估不同内质网膜蛋白在多种细胞类型中对内质网被动Ca2+外流的贡献；ii）鉴定并表征限制这种被动Ca2+外流的蛋白及机制；iii）研究与疾病相关的突变对相关组分功能的影响。
我们注意到，仅应分析活细胞，且总体存活率应高于80%。因此，通常根据制造商的说明书，使用Nuclear-ID蓝/绿细胞活力试剂对细胞活力进行常规评估。此外，必须对胞质Ca2+浓度的变化进行统计学分析。因此，每项实验需针对四种不同批次的细胞进行，并且每种条件下至少分析两个盖玻片，每个盖玻片至少包含20个细胞。我们注意到，所有不同实验必须在细胞接种到盖玻片后的同一时间点进行。
致谢
S.L. 获得德国研究基金会（DFG）（研究生院研究项目 845）的资助。本工作获得德国研究基金会（DFG）（SFB 530/C1 和 FOR 967）以及 HOMFOR 项目的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 31966 | |
| OptiMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 51985 | |
| FBS | Biochrom AG | S0115 | |
| 青霉素/链霉素 | PAA Laboratories | P11-010 | |
| HiPerFect | Qiagen | 301707 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04709713 | |
| Nuclear-ID 蓝色/绿色细胞活力试剂 | Enzo Life Sciences | ENZ-53004 | |
| FURA-2 AM | Invitrogen | F-1221 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P 7255 | |
| 毒胡萝卜素 | Invitrogen | T-7459 | |
| 蛇形毒素 A | Enzo Life Sciences | ALX-270-109 | |
| 三氟拉嗪 | Sigma-Aldrich | T 6062 | |
| Countess® 自动细胞计数仪 | Invitrogen | ||
| Typhoon-Trio 成像系统 | GE Healthcare | ||
| TE2000-S 显微镜配 DS-5Mc 相机 | Nikon Instruments | ||
| iMIC 显微镜配多色 V 光源 | Till Photonics |
参考文献
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