通过组织表面张力测定法测量聚集体黏附力

摘要

我们描述了一种测量三维组织样聚集体内细胞间结合能的方法，该结合能可表示为组织表面张力。已有研究表明，组织表面张力的差异与肺、肌肉和脑肿瘤的侵袭性相关，并且是决定不同类型细胞之间空间关系的基本因素。

摘要

只有在处于平衡状态的系统中，基于热力学原理的方法才能对细胞间结合能进行严格的测量。我们专门开发了组织表面张力测定法（TST），用于测量细胞间相互作用的表面自由能。TST背后的生物物理概念此前已有详细描述^1,2。该方法基于如下观察：若将具有相互黏附性的细胞维持在振荡培养中，它们将自发聚集成团；随着时间推移，这些细胞团会进一步收缩形成球形结构。这种成球行为模拟了液体系统的典型行为。通过在自行设计的组织表面张力仪中将球形聚集体压缩于两平行板之间，即可测量细胞间的结合能。测量三维类组织球形聚集体的表面张力时，所采用的数学方程与测量液滴表面张力的方程相同。在细胞体系中，液体表面张力的对应物即为细胞间结合能，或更广义地说，组织内聚性。本实验室此前的研究表明，组织表面张力（1）可预测两组胚胎细胞之间的相互作用方式^1-5；（2）可显著影响组织与生物材料相互作用的能力⁶；（3）不仅可通过直接调控基于钙黏蛋白（cadherin）的细胞间黏附来改变⁷，还可通过调控关键的细胞外基质分子（如FN）来调节^8-11；（4）与肺癌¹²、纤维肉瘤¹³、脑肿瘤¹⁴以及前列腺癌细胞系¹⁵的侵袭潜能相关。本文将介绍该仪器装置，详述生成球形聚集体的步骤、将聚集体装入张力仪腔室的操作、启动聚集体压缩的过程，以及对所获得的组织表面张力测量结果进行分析与验证的方法。

方案

1. 组织表面张力测量用聚集体的制备。

对于贴壁细胞，可以通过悬滴法形成球状体，或者先生成一层完整的细胞片，再将其切割成1 mm的片段。

采用悬滴法形成聚集体：

1. 贴壁细胞培养物应生长至90%融合度，用PBS洗涤单层细胞两次。充分弃去液体后，加入2 ml（100 mm培养皿）0.05%胰蛋白酶-1 mM EDTA溶液，于37°C孵育至细胞脱落。加入2 ml完全培养基终止消化，用5 ml移液管轻轻吹打混合液，使细胞充分悬浮。将细胞转移至15 ml锥形离心管中。
2. 加入40 μl浓度为10 mg/ml的DNA酶储备液，室温孵育5分钟。短暂涡旋混匀后，以200 × g离心5分钟。
3. 弃去上清液，用1 ml完全组织培养基洗涤沉淀。重复一次，然后将细胞重悬于2 ml完全组织培养基中。
4. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并调整细胞浓度至2.5 × 10⁶ 个/ml。
5. 取下60 mm组织培养皿的皿盖，将5 ml PBS加入培养皿底部，作为保湿腔使用。
6. 将皿盖翻转，在其底部使用20 μl移液器滴加10 μl液滴。确保各液滴之间保持足够间距，避免相互接触。每个培养皿底部最多可放置不少于20个液滴。
7. 将翻转后的皿盖盖在含有PBS的底部培养皿上，置于37°C、5% CO₂

讨论

通过组织表面张力测定法（TST）测量聚集体的内聚力相对简单。然而，为了获得可用的TST数据，必须掌握以下几个关键步骤：1）聚集体必须“健康”。这可以通过确保在细胞解离前处于最佳汇合度来控制聚集体的形成。还必须控制聚集体的大小和培养时间，以尽量减少聚集体内部坏死核心的形成；2）另一个可能影响TST测量结果的参数是聚集体与上、下压缩板之间粘附的程度。因此，每种类型的聚集体都需要通过实验确定用于包被压缩板的聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）的最佳浓度；3）虽然理想情况下压缩前的聚集体应尽可能呈球形，但这并非绝对必要。某些聚集体，特别是那些结合力较弱的聚集体，往往难以形成完美的球形。其原因是，细胞要完全变圆，必须通过移动和重排来消耗能量。如果变圆所需的能量超过了因形成球形而降低的表面能，聚集体将倾向于停留在某种亚球形状态。根据我们的经验，这类聚集体在受到压缩时，其侧面仍会形成半圆形，其抵抗压缩力的方式与从完美球形开始的情况完全相同；4）还必须确保上下压缩板相互平行。这一点最好通过确保镍铬丝保持平直，并且仪器处于水平和垂直状态来实现。只要遵循上述措施，组织表面张力测定法就相对简单，能够提供有关组织机械特性及其潜在分子决定因素的非常有价值的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
水浴摇床	New Brunswick Scientific
10 ml 圆底烧瓶	Bellco Glass