通过组织表面张力测定法测量聚集体黏附力

摘要

我们描述了一种测量三维组织样聚集体内细胞间结合能的方法，该结合能可表示为组织表面张力。已有研究表明，组织表面张力的差异与肺、肌肉和脑肿瘤的侵袭性相关，并且是决定不同类型细胞之间空间关系的基本因素。

摘要

只有在处于平衡状态的系统中，基于热力学原理的方法才能对细胞间结合能进行严格的测量。我们专门开发了组织表面张力测定法（TST），用于测量细胞间相互作用的表面自由能。TST背后的生物物理概念此前已有详细描述^1,2。该方法基于如下观察：若将具有相互黏附性的细胞维持在振荡培养中，它们将自发聚集成团；随着时间推移，这些细胞团会进一步收缩形成球形结构。这种成球行为模拟了液体系统的典型行为。通过在自行设计的组织表面张力仪中将球形聚集体压缩于两平行板之间，即可测量细胞间的结合能。测量三维类组织球形聚集体的表面张力时，所采用的数学方程与测量液滴表面张力的方程相同。在细胞体系中，液体表面张力的对应物即为细胞间结合能，或更广义地说，组织内聚性。本实验室此前的研究表明，组织表面张力（1）可预测两组胚胎细胞之间的相互作用方式^1-5；（2）可显著影响组织与生物材料相互作用的能力⁶；（3）不仅可通过直接调控基于钙黏蛋白（cadherin）的细胞间黏附来改变⁷，还可通过调控关键的细胞外基质分子（如FN）来调节^8-11；（4）与肺癌¹²、纤维肉瘤¹³、脑肿瘤¹⁴以及前列腺癌细胞系¹⁵的侵袭潜能相关。本文将介绍该仪器装置，详述生成球形聚集体的步骤、将聚集体装入张力仪腔室的操作、启动聚集体压缩的过程，以及对所获得的组织表面张力测量结果进行分析与验证的方法。

方案

1. 组织表面张力测量用聚集体的制备。

对于贴壁细胞，可以通过悬滴法形成球状体，或者先生成一层完整的细胞片，再将其切割成1 mm的片段。

采用悬滴法形成聚集体：

1. 贴壁细胞培养物应生长至90%融合度，用PBS洗涤单层细胞两次。充分弃去液体后，加入2 ml（100 mm培养皿）0.05%胰蛋白酶-1 mM EDTA溶液，于37°C孵育至细胞脱落。加入2 ml完全培养基终止消化，用5 ml移液管轻轻吹打混合液，使细胞充分悬浮。将细胞转移至15 ml锥形离心管中。
2. 加入40 μl浓度为10 mg/ml的DNA酶储备液，室温孵育5分钟。短暂涡旋混匀后，以200 × g离心5分钟。
3. 弃去上清液，用1 ml完全组织培养基洗涤沉淀。重复一次，然后将细胞重悬于2 ml完全组织培养基中。
4. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并调整细胞浓度至2.5 × 10⁶ 个/ml。
5. 取下60 mm组织培养皿的皿盖，将5 ml PBS加入培养皿底部，作为保湿腔使用。
6. 将皿盖翻转，在其底部使用20 μl移液器滴加10 μl液滴。确保各液滴之间保持足够间距，避免相互接触。每个培养皿底部最多可放置不少于20个液滴。
7. 将翻转后的皿盖盖在含有PBS的底部培养皿上，置于37°C、5% CO₂、95%湿度条件下孵育，每日观察液滴情况，持续孵育直至形成细胞片层或细胞聚集体。
8. 一旦形成细胞片层，即可将其转移至含有3 ml完全培养基的圆底玻璃摇瓶中，在37°C、5% CO₂条件下置于摇水浴中震荡培养，直至形成球状体。

通过细胞片层法形成聚集体：

9. 单细胞悬液的制备方法如上所述，但浓度需调整为 1×10⁶ 个细胞/ml。
10. 将 3 ml 细胞悬液转移至 10 ml 圆底培养瓶（Belco, Vineland, NJ）中。
11. 将培养瓶置于旋转水浴摇床（New Brunswick Scientific, Edison, NJ）中，在 37°C、5% CO₂ 条件下以 120 rpm 振荡培养 4 小时，直至细胞从胰酶消化中恢复。
12. 将细胞转移至玻璃圆底离心管中，以 200 × g 离心形成薄层细胞沉淀。继续孵育 24 小时，直至形成完整的细胞片层。
13. 轻轻摇动培养管使片层脱落，将培养管内容物倒入小型无菌玻璃组织培养皿中。
14. 使用显微手术刀将片层切割成不同大小的碎片。
15. 将碎片置于旋转水浴摇床中，在 37°C、5% CO₂ 条件下以 120 rpm 振荡培养 2 至 3 天，直至其形成球形结构。

2. 聚集体表面张力的测量

1. 组织表面张力仪。该装置如图1和图2所示。压缩池（图3）由两个腔室组成。外腔（OC）连接至37°C循环水泵，用于调节内腔（IC）的温度。腔室由铣削Delrin材料制成，并配有石英窗口，以便观察细胞团块。下部组件（LA）旋入内腔底部，用于：1）将细胞团块定位在内腔中；2）密封内腔底部；3）抬升细胞团块以启动压缩；以及4）控制平行板之间的距离，从而控制细胞团块的压缩程度。该组件的中心芯（CC）可调节。中心芯的顶端（即基座）由光滑的聚四氟乙烯（Teflon）制成，作为下压缩板（LCP）。上压缩板（UCP）是一根长15 mm的聚四氟乙烯圆柱体，通过一根经火焰拉直的镍铬丝（NCW）*悬挂在天平臂（B）上。实验过程中，将细胞团块（A）置于下板上，并向上抬升直至接触上板。上压缩板与天平臂（B）相连。细胞团块受压导致天平臂发生位移。天平采用Cahn/Ventron model 2000型记录式电子天平，基于零位平衡原理工作。天平臂的支点处含有置于永久磁场中的电枢。当天平运行时，它会持续调节通过电磁组件的电流，从而保持天平臂处于水平位置。当天平臂悬挂物体时，天平为维持臂部水平所施加的电压与该物体的重量成正比。该电压用于测量施加于细胞团块的外部压缩力。细胞团块的形态通过连接至配备图像采集卡的计算机的25倍Nikon SMZ10A体视显微镜进行视觉监测。为尽量减少细胞团块与压缩板之间的黏附，上下压缩板均涂覆了聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）{poly(HEMA)}，这是一种细胞无法黏附的聚合物材料¹⁶。
   * 通过将一段15英寸长的金属丝一端悬挂在铁架台上，并在末端夹上一个小夹子，然后用本生灯沿金属丝长度方向上下移动加热至其发红，即可完成火焰拉直。随后可将拉直后的金属丝剪成所需长度。使用两片刀片在金属丝末端约¼英寸处弯折形成小钩。另一端则插入下压缩板的筒状孔中。
2. 细胞团块压缩
   1. 将预热的CO₂-非依赖性组织培养基（Gibco/BRL, NY）注入内腔。
   2. 将大小约为200–300 μm的细胞团块置于下压缩板上（图4A）。加载方法为：将细胞团块连同组织培养基吸入装有硅胶头的巴斯德移液管尖端约一半深度，将移液管转移至内腔，并将管尖置于LCP上方，然后轻轻挤压胶头使团块缓慢排出至LCP上；也可让团块依靠重力自然下落至LCP上。
   3. 将上压缩板（UCP）置于细胞团块上方并使其自然沉降，建立压缩前的UCP表观重量基线。
   4. 随后抬升LCP，直至细胞团块被压缩至上压缩板（UCP）（图4B）。通过调节下部装置中心芯的高度，可控制不同的压缩程度。压缩过程通过配备CCD视频相机的解剖显微镜进行观察监控。
   5. 利用ImageJ软件对细胞团块图像进行采集、数字化处理和分析。表观UCP重量变化通过条带记录仪连续记录，当Cahn天平的电压输出趋于平稳时，表明形态达到平衡状态。每个细胞团块需经历两种不同程度的压缩。
3. 细胞团块表面张力的计算
   在形态平衡状态下，对于不黏附于平行压缩板之间的细胞团块，其内聚力可根据Young-Laplace方程（图5）求得，其中σ表示内聚力，F为压缩细胞团块的作用力，πr₃²为力F作用下的细胞团块表面积，R₂和R₃分别为压缩后细胞团块赤道半径和定义其表面轮廓在垂直于压缩板方向上跨越两板之间弧线的曲率半径（图6）。通过测量力与形态平衡时的压缩力和几何参数，并将这些测量值代入Young-Laplace方程，即可获得表观组织表面张力的数值。当达到平衡并计算出σ₁后，释放压缩使细胞团块恢复并趋近第二个平衡状态，再按上述方法计算σ₂。
4. 细胞团块液态性质的验证
   对于液态细胞团块，在经历两种不同压缩程度时，其计算得到的表面张力应保持恒定。此类团块的σ₂/σ₁比值等于1，且小于每次连续压缩所施加力的比值（F₂/F₁）。相反，弹性细胞团块的表面张力遵循胡克定律，随施加力的增加而成比例上升。对于弹性团块，σ₂/σ₁比值不等于1，而趋近于F₂/F₁的比值。此外，液态细胞团块的表面张力还应与团块尺寸无关^2,17。仅当表面张力与施加的力和团块尺寸无关时，所得测量值才用于计算各细胞系的平均σ值。

3. 代表性结果：

以下是大鼠前列腺成纤维细胞（RPF）和大鼠前列腺平滑肌细胞（RPSMC）聚集体的典型表面张力测试（TST）结果表。如图7所示，RPF细胞聚集体的表面张力为22.8 ± 1.1 dynes/cm。此外，通过配对t检验比较第一次压缩后和第二次压缩后测得的平均表面张力值，二者在统计学上无显著差异。我们还比较了σ₂/σ₁和F₂/F₁的比值，以确认这些聚集体不遵循胡克定律，因为若其表现为弹性固体，则应遵循该定律。如表1所示，σ₂/σ₁的比值确实接近于1.0。此外，F₂/F₁的比值显著大于σ₂/σ₁（配对t检验，P < 0.05），进一步证实这些聚集体不遵循胡克定律，实际上表现出类似液体的行为。相比之下，RPSMCs遵循胡克定律。从表1中可以明显看出，σ₂/σ₁的比值显著大于1，且与F₂/F₁的比值在统计学上无显著差异。为进一步证明其类液体行为，我们探讨了表面张力（σ）与聚集体体积之间的关系。如图8所示，RPF细胞的体积与σ无关（红色回归线，r² = 0.002），而RPSMCs的σ似乎对体积存在一定的依赖性（蓝色回归线，r² = 0.146）。这些数据进一步证实RPF聚集体表现出类液体特性，而RPSMC聚集体则更倾向于表现为弹性固体。只有来自表现出液体行为的聚集体的测量结果才可用于计算表面张力。

图1. 组织表面张力仪的概览。

图2. 张力计腔室的更详细视图（右侧面板）。

图3. 表面张力仪腔室的示意图。

图 4. 未压缩（A）和压缩后（B）聚集体的图像。

图 5. 拉普拉斯方程。

图6. 液滴被压缩在两个对其黏附性较差的平行板之间并处于形状平衡状态的示意图。R₁ 和 R₂ 分别为液滴赤道处以及通过其对称轴平面内的两个主曲率半径。R₃ 为液滴与任一压缩板接触的圆形区域的半径。H 为上下压缩板之间的距离。X 是直角三角形的一条直角边，该直角三角形的斜边为 R₂，延伸至液滴表面与任一压缩板的接触点。

	σ1（达因/厘米 ± 标准误）	σ2（达因/厘米 ± 标准误）	Pσ1 vs σ2	σ1,2（达因/厘米 ± 标准误）	σ2/σ1	F2/1	Pσ2σ1 和 F2F1
RPF	22.6 ± 1.7	22.9 ± 1.4	> 0.05*	22.8 ± 1.1	1.04 ± 0.04	1.47 ± 0.06	< 0.05
RPSMC	15.0 ± 2.8	23.0 ± 3.2	0.039	NA	1.9 ± 0.3	1.6 ± 0.1	0.16*

图7. 大鼠前列腺成纤维细胞和光滑肌细胞聚集体的TST测量及其聚集体流动性的确认。

图8. RPF聚集体（红线）和RPSMCs聚集体（蓝线）的表面张力（sigma）与体积之间的关系。

讨论

通过组织表面张力测定法（TST）测量聚集体的内聚力相对简单。然而，为了获得可用的TST数据，必须掌握以下几个关键步骤：1）聚集体必须“健康”。这可以通过确保在细胞解离前处于最佳汇合度来控制聚集体的形成。还必须控制聚集体的大小和培养时间，以尽量减少聚集体内部坏死核心的形成；2）另一个可能影响TST测量结果的参数是聚集体与上、下压缩板之间粘附的程度。因此，每种类型的聚集体都需要通过实验确定用于包被压缩板的聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）的最佳浓度；3）虽然理想情况下压缩前的聚集体应尽可能呈球形，但这并非绝对必要。某些聚集体，特别是那些结合力较弱的聚集体，往往难以形成完美的球形。其原因是，细胞要完全变圆，必须通过移动和重排来消耗能量。如果变圆所需的能量超过了因形成球形而降低的表面能，聚集体将倾向于停留在某种亚球形状态。根据我们的经验，这类聚集体在受到压缩时，其侧面仍会形成半圆形，其抵抗压缩力的方式与从完美球形开始的情况完全相同；4）还必须确保上下压缩板相互平行。这一点最好通过确保镍铬丝保持平直，并且仪器处于水平和垂直状态来实现。只要遵循上述措施，组织表面张力测定法就相对简单，能够提供有关组织机械特性及其潜在分子决定因素的非常有价值的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
水浴摇床	New Brunswick Scientific
10 ml 圆底烧瓶	Bellco Glass