从啮齿类动物脑片中振动解离神经元以研究突触传递和成像突触前终末

摘要

本报告展示了一种机械分离单个有活性神经元的技术，该神经元保留了附着的突触前末梢。经振动解离获得的神经元具有制备快速、药理学控制优良以及在无邻近细胞干扰的情况下改善空间钳制的优点。该方法可用于突触结构的成像及膜片钳记录。

摘要

从中枢神经系统中进行机械解离神经元的优点在于，突触前末梢仍可附着在所分离的目标神经元上。这使得可以在对外部环境和突触后胞内环境进行良好控制的条件下研究突触传递。一种基于振动且不使用蛋白酶的技术，称为振动解离法（vibrodissociation），是目前最常用的机械分离技术。将尖端经火焰抛光成小球状的微电极插入由出生后1至21天（P1-P21）啮齿类动物制备的脑片中，微电极在平行于脑片表面的方向振动并逐渐穿过脑片厚度，从而释放出单个分离的神经元。这些分离的神经元在振动解离后数分钟内即可用于实验研究。与原代神经元培养、脑片以及酶解法分离神经元相比，该技术具有多项优势：能够快速获得存活且相对成熟的神经元，适用于电生理和成像研究；可精确控制细胞外环境，避免邻近细胞的干扰；适用于通过快速给药和全细胞灌流实现严格控制的药理学实验；在全细胞记录中，相较于脑片或细胞培养中的神经元，具有更优的空间钳制效果。该制备方法可用于研究突触的生理学、药理学、调制机制及可塑性。利用振动解离获得的神经元，还可对活细胞及其突触前和突触后结构进行实时成像。此外，也可结合免疫学方法和基于成像的技术，对突触前和突触后结构的分子组成进行鉴定。

方案

1. 准备火焰拉制的玻璃毛细管

1. 使用微电极玻璃管，在Flaming-Brown型或同等性能的微电极拉制仪上拉制标准的膜片钳微电极（尖端直径约2 μm）。将微电极尖端置于本生灯火焰中约2秒，直至熔融形成直径为200–300 μm的球状封口。
2. 将火焰封口的膜片钳电极安装至微操纵器的电极夹持器上，该操纵器可通过压电双晶片、继电器或功能相当的装置实现快速横向振动（移动距离为100–200 μm）。

2. 准备出生后1至21天大鼠或小鼠的脑切片

1. 配制人工脑脊液（aCSF），其成分为（单位：mM）：124 NaCl、4.5 KCl、1.2 NaH₂PO₄、26 NaHCO₃ 和 10 D-葡萄糖。用 95% 氧气 / 5% CO₂ 气体混合物通气约 15 分钟，然后加入 2 mM CaCl₂ 和 1 mM MgCl₂。
2. 脑切片制备：
   1. 使用氟烷或异氟烷麻醉动物，断头取脑，并将脑组织按所需方向（冠状面、旁矢状面、横断面等）进行修块，确保包含目标脑区。
   2. 将修好的脑组织固定在浸没于 aCSF 中的振动切片机载物台上，切成 250–400 μm 厚的脑片，随后将切片转移至充满碳合气（carbogen）并持续通气的 aCSF 中，在网状支架上的“预孵育”室中孵育，确保切片各表面均可接触液体和气体。让切片在此环境中平衡至少一小时。

3. 振动解离

1. 用以下成分（单位：mM）的 HEPES 缓冲盐溶液填充直径为 35 mm 的培养皿：150 NaCl、5 KCl、10 HEPES、1 MgCl₂、2.5 CaCl₂、10 D-葡萄糖，用 NaOH 调节 pH 至 7.4，并用蔗糖将渗透压调节至约 300 mOsM。培养皿可选用悬浮培养皿、标准细胞培养皿、带玻璃盖玻片插件的培养皿，或涂有如聚-L-赖氨酸等物质的培养皿，具体选择取决于细胞对皿底黏附力的需求。
2. 将脑片置于培养皿中，使用体视显微镜在 250 倍下观察。用一根弯曲的铂丝（直径 0.5 mm）压在脑片上表面作为重物，使脑片固定于皿底。
3. 将火焰拉制的微电极尖端置于脑片表面的目标脑区。启动显微操作器，使尖端以 10–30 Hz 的频率进行横向振动，振幅距离约为 100 μm。通过显微操作器将尖端逐渐深入脑片组织，使其在约 30 秒内穿透整个脑片。根据需要重复此步骤，以最大限度地增加从特定脑区获得的分离神经元数量。
4. 将微电极尖端从脑片中移出——用镊子夹起脑片并在溶液中轻轻晃动——然后完全移除并弃去脑片。
5. 让解离的细胞沉降并贴附于培养皿底部，至少静置 10 分钟。

4. 电生理记录

1. 将含有神经元的培养皿置于倒置显微镜载物台上，使用10倍至63倍物镜进行观察。选择细胞膜光滑完整、无起泡现象、细胞核清晰可见但不过大的神经元。若使用相差光学系统，应选择呈相位明亮、略带黄褐色而非过蓝的神经元。用含有适当盐类、营养物质、受体拮抗剂等的细胞外液对细胞进行灌流（我们通常采用上述第3.1节所述的HEPES缓冲盐溶液），并常添加5 μM 2,3-二氧代-6-硝基-1,2,3,4-四氢苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺二钠（NBQX）和25–100 μM D-2-氨基-5-磷酸戊酸（AP5），以阻断离子型谷氨酸受体，从而分离出由GABA_A受体介导的快速抑制性突触后电流（IPSCs）^1,2。
2. 使用Flaming-Brown型或同类拉制仪制备标准的膜片钳玻璃微电极。当电极内充以基于Cl^-的灌注液时，其尖端电阻应为2–4 MΩ（根据目标细胞大小而定）。
3. 采用标准的电生理技术，对已识别的神经元建立全细胞记录模式。
4. 采用无间隙数据采集程序记录自发性突触后电流（sPSCs）。加入0.2–1 μM河豚毒素和/或低Ca²⁺细胞外液，以记录微型突触后电流（mPSCs）。
5. 溶液和药理学试剂可直接施加于细胞。我们采用由熔融方口玻璃管构成的局部快速灌流系统，通过安装在步进电机驱动的微操纵器上的管道进行横向移动实现溶液切换。该方法可在数十至数百毫秒内完成溶液交换，实现细胞外分子环境的快速改变或受体激动剂的快速施加等操作。
6. Akaike及其同事已开发出刺激单个突触前末梢的技术^3,4。将微电极置于可视化的突触末梢附近，施加电刺激（负向电流5–10 μA，持续时间0.1–0.2 ms），记录单个单位的抑制性突触后电流（IPSCs），并可采用“失效率分析”等方法评估突触前和突触后功能的变化。

5. 突触前终末成像

1. 可通过膜片钳电极将多种染料注入突触后神经元。此外，也可使用在特定细胞群体中表达荧光蛋白（FP）（如绿色荧光蛋白GFP）的小鼠制备神经元。
2. 可在来源于在特定中间神经元群体中表达荧光蛋白（FP）的小鼠的振动解离神经元上观察到突触前终末。例如，由谷氨酸脱羧酶65（GAD65）启动子驱动表达GFP的小鼠，其海马区篮状细胞及其他中间神经元的胞体和突起均呈绿色。从海马CA1区振动解离得到的锥体神经元，其胞体和近端树突上可见GFP阳性轴突终末附着（图1A）。从在Thy1启动子调控下表达突触pHluorin（一种与突触小泡相关蛋白VAMP2融合的pH敏感型GFP突变体）的小鼠中振动解离得到的锥体神经元，也具有FP阳性的附着小结，并表现出pH敏感性荧光（图1B）。
3. 可使用AM酯化化合物将钙离子指示剂染料及其他荧光分子加载至突触前小结⁵。图2展示了使用钙指示剂染料Fluo4-AM进行加载的示例。首先，在37°C条件下将1–2 μM的AM酯化染料施加于神经元，持续10分钟。染料可穿透进入细胞内环境，在细胞内酯酶的作用下裂解该分子，释放出游离的、不能透过细胞膜且未被淬灭的染料。该方法可同时标记突触前和突触后细胞结构。加载完成后，用HEPES缓冲盐溶液洗涤细胞，并在37°C下继续孵育10分钟。在使用玻璃微电极形成吉欧姆（GΩ）封接之前，需用外部缓冲液冲洗细胞3次。
4. 随后使用不含染料的细胞内溶液建立全细胞记录模式。记录2–5分钟后，染料基本从突触后神经元中清除，从而可清晰观察到加载了Fluo-4的突触小结。该技术由Ye等⁵首次建立。
5. 可利用高倍率、高数值孔径物镜，结合基于相机或双光子显微镜系统对染料标记的小结进行成像。如图3所示的实验装置可实现同步的全细胞记录与钙成像。图2C所示的神经元及小结图像采用电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机采集。激发光源的光强通过中性密度1.0滤光片衰减至1.2%，并通过虹膜滤光片调节至12%输出。可实时观察并记录绿色突触前小结中的钙瞬变信号，并在事后进行定量分析。

6. 代表性结果：

振动解离神经元的自发性及电流注入诱发的放电活动

图4A展示了从典型的振动解离海马CA1区锥体神经元记录到的电活动。自发的超射动作电位可在从大鼠基底外侧杏仁核、海马和腹侧被盖区解离得到的锥体神经元中观察到^1,5。在对CA1区锥体神经元进行电流钳记录期间，施加超极化电流可产生典型的电压反应，而施加足够强度的去极化电流则会引发超射动作电位：在中等电流水平下表现为典型的延迟放电模式，在较强电流刺激下则表现为不适应性动作电位（图4B）。

振动解离神经元中自发性和微小GABA能抑制性突触后电流

使用基于CsCl的细胞内溶液进行电压钳记录时，可观察到自发性突触电流（图5A）。这些事件在低钙溶液中消失^2,6，且在大多数神经元类型中可被GABA_A受体拮抗剂（如荷包牡丹碱或加巴青）完全阻断（图5B、C），表明这些是由GABA释放并激活该离子型受体亚型所介导的自发性抑制性突触电流（sIPSCs）。然而，在来自基底外侧杏仁核²和腹侧被盖区^5,7等脑区的主要神经元中，阻断GABA_A受体后会暴露出由谷氨酸激活AMPA型受体所介导的持续时间较短的兴奋性突触电流（EPSCs）。有趣的是，应用河豚毒素（TTX）至仅特异性阻断最敏感的电压门控钠通道的浓度时，可降低从多个脑区分离的振动解离神经元中所观察到的sIPSC的频率和幅度（图6A）^2,4,7。因此，钠通道活性参与了断离的突触末梢中GABA的释放。目前尚不清楚这些末梢中是否会发生完整的钠动作电位。值得注意的是，一个封闭良好的直径为1 μm的轴突末梢的输入电阻可能高达GΩ范围。因此，即使少量钠通道开放也可能足以使末梢去极化，从而激活介导兴奋-分泌耦联的钙通道。关于这些钙通道，有证据表明，在海马CA1区及其他部位的振动解离制备中，N型和P/Q型钙通道参与了GABA能末梢的递质释放⁸。

已利用振动解离神经元研究了多种神经递质和受体对突触传递的调节作用及可塑性^3,4,9。已被证实具有此类调节作用的神经递质包括腺苷、γ-氨基丁酸（GABA）、5-羟色胺、内源性大麻素等^2,6,10,11,12。此外，在该制备方法获得的神经元中也观察到了短期突触可塑性现象，例如依赖内源性大麻素的去极化诱导抑制性突触传递抑制（DSI）^2,11。这些发现表明，振动解离神经元制备物中保留了多种由内源性神经调质介导的受体依赖性和跨突触信号传导功能。

振动解离制备中轴突末梢的钙瞬变与囊泡释放

使用上述配备EMCCD的倒置显微镜，我们检测了振动解离获得的神经元-突触小体制备样本中突触前末梢的钙瞬变。图2显示了AM酯化Fluo-4在细胞中的负载以及海马CA1区锥体神经元中突触后染料的稀释现象。在图6B所示的兴趣区域（ROIs）中，部分染料填充的突触小体可观察到自发性钙瞬变。应用1 μM河豚毒素（TTX）后，这些自发性瞬变消失，表明这些钙瞬变由突触小体中自发激活的电压门控钠电流介导，进而引发钙浓度上升。通过快速溶液交换将细胞外KCl浓度从10 mM升高至40 mM，可导致对应于突触前末梢的兴趣区域（ROIs）荧光强度增加（图7A）。同时对突触后神经元进行记录，用于监测自发性抑制性突触电流（sIPSCs），并确定高K⁺去极化是否增加事件频率（图7B）。

为了观察突触前末梢中的囊泡融合，我们使用了在Thy1启动子控制下表达突触pHluorin（synaptopHluorin）构建体的小鼠（标记为spH21小鼠）。突触pHluorin是一种分子构建体，其中ecliptic pHluorin（一种对pH敏感性增强的GFP突变体）¹²与囊泡相关膜蛋白（VAMP2）¹³相连。这种结构将pHluorin基序定位于囊泡腔内，在相对酸性的环境中荧光被淬灭。当囊泡发生融合时，该基序暴露于更接近中性的细胞外环境，导致对应于囊泡/突触前终末的荧光斑点出现荧光增强。对spH21小鼠的海马神经元进行振动解离后，可观察到大小和位置符合GABA能终末预期的荧光斑点（图8A）。施加含高K⁺的外部溶液可增加这些终末的荧光强度，而当使用将细胞外钙浓度降低至0.2 mM的外部溶液时，该效应被阻断（图8B）。因此，在神经元-末梢制备中，去极化诱导的荧光增强似乎反映了GABA能突触处的兴奋-分泌耦联过程。

在神经元-突触小结制备的轴突末梢中，测量突触前钙瞬变和囊泡融合的能力，使我们能够研究神经调质、滥用药物以及突触可塑性对兴奋-分泌耦联和胞吐/胞吞过程中突触前机制的影响。这些技术还可与其他分子工具和基因工程小鼠相结合，以研究特定蛋白质在突触前功能及其调节/可塑性中的作用。

图1. 来自海马CA1区的振动解离神经元（A）GAD65小鼠的微分干涉差（DIC）图像与绿色荧光图像的合并图。合并DIC图像以清晰显示绿色末梢的位置（B）突触小泡蛋白荧光素（spH21）小鼠的荧光图像。比例尺 = 10 μm

图2. 钙离子指示剂加载步骤：（A）整个细胞加载AM酯化染料；（B）全细胞记录过程中染料被稀释；（C）终末区被识别为感兴趣区域（箭头所示）。

图3. 在振动解离神经元的突触前末梢上进行全细胞记录与钙成像同步实验的示意图。EMCCD=电子倍增电荷耦合器件。

图 4. 典型波形显示：（A）来自振动解离CA1神经元的自发动作电位，以及（B）在CA1神经元的电流钳记录中，膜电位对超极化和去极化电流注入的响应。

图 5. （A）CA1区锥体神经元自发性抑制性突触后电流（IPSCs）的代表性波形。（B-C）IPSCs可被加巴青（10 μM；B）或荷包牡丹碱（20 μM；C）阻断。

图6. TTX抑制自发性GABA能突触传递，并消除振动解离海马组织制备中的突触前钙瞬变。(A) 振动解离神经元在TTX给药前和给药期间的记录。注意sIPSCs频率和幅度的降低。(B) 在TTX给药前和给药期间，观察到Fluo-4标记的振动解离神经元突触前末梢中的钙瞬变。注意瞬变信号的完全消失。

图7. 钙离子指示剂成像与sIPSC全细胞记录同步显示高K⁺刺激的作用。(A) 用Fluo-4AM染料负载的突触前终扣随时间变化的荧光强度测量结果。(B) 在施加高K⁺期间，sIPSC频率和幅度同步增加。

图8. 海马CA1区spH21锥体神经元突触前末梢中依赖Ca²⁺的高K⁺反应。(A) 振动解离神经元的荧光图像。(B) 在含有正常细胞外Ca²⁺（2 mM Ca²⁺）的溶液中，施加高K⁺（由黑色条表示）引起荧光信号持续升高；而在低细胞外Ca²⁺（0.2 mM Ca²⁺）条件下未观察到荧光增强。图中数据已归一化至高K⁺处理前的荧光水平，并显示了3个突触末梢的平均反应。

讨论

成功的振动解离要求脑片中含有健康的神经元，并且细胞外间隙具有足够的弹性，使神经元能够无毒性损伤地从脑片中释放出来。因此，该技术在出生后早期（P1-21）效果最佳，因为此时制备的脑片中胶质/间质成分较少，比成年动物脑片更有利于操作。然而，根据我们的经验，为提高脑片内神经元存活率而优化的切片制备方法可能反而不利于振动解离技术的效果。通常情况下，我们为进行in situ记录而制备脑片时，会使用冷的改良aCSF溶液，其中大部分细胞外Na⁺和Ca²⁺被蔗糖替代；但用于振动解离的脑片则可以直接在常规记录用aCSF溶液中制备（例如切片）。当我们准备用于记录脑片中单个神经元电活动的样本时，通常在切片完成后立即把脑片置于35°C的正常aCSF中，并在此温度下孵育30-60分钟，然后再移回室温。然而，用于振动解离的脑片在切片后应立即转移至室温。这些处理步骤可在振动解离后获得更高数量的健康神经元，原因可能是间质组织较为疏松，使神经元更容易通过振动从脑片中脱离。我们并未系统地考察所有切片制备条件，因为我们日常操作已能获得足够数量的神经元，满足当天的记录和成像实验需求。或许通过进一步调整，例如改变切片厚度或预孵育程序，还可进一步提高健康神经元的得率。曾尝试使用极轻微的蛋白酶处理，以期提高细胞产量并使该技术适用于较年长的动物，但即使非常温和的蛋白酶处理也 invariably 会破坏突触功能。因此，尽管蛋白酶联合机械解离的方法未来仍有可能奏效，但截至目前，在前脑神经元中尚未证明其可靠性。

还应注意，经过振动解离后健康神经元的得率相对较低，这意味着该技术主要用于研究数量较多的神经元亚型，主要是投射神经元。使用能够表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠模型，可轻松识别出较小的神经元亚群，从而增加了研究这些稀有神经元的可能性。然而，除非神经元的得率能够显著提高，否则针对这些神经元的数据积累可能仍然较为缓慢。

有多个步骤已被证实对于成功将钙离子感应染料载入神经元至关重要。AM酯化染料的孵育需在37°C下进行，我们曾尝试在较低温度下进行染料负载，但均未成功。染料浓度应根据负载时间和温度进行优化，因为较高浓度的染料负载似乎会降低突触前终末中的钙离子浓度。我们观察到，使用较高浓度染料负载会降低sIPSCs的频率和幅度。在将钙离子感应染料载入振动解离神经元的突触前终末时，必须格外小心，因为小的突触前终末的缓冲能力可能与胞体不同，且终末的大小并不一致。染料负载后，含有神经元的培养皿需用HEPES缓冲的外部溶液清洗，清洗后的恢复时间至关重要。此外，为了形成良好的全细胞记录封接，必须彻底清洗细胞，以去除细胞膜外未被内化的染料分子。

除了将振动解离神经元用于电生理学和活细胞成像外，免疫细胞化学技术也可应用于这些细胞^11,12。这些细胞易于固定，并可用多种抗体及其他细胞标志物进行染色。使用此类细胞可获得清晰的样本，便于观察GABA能突触前终末中的蛋白质表达。利用在GABA能神经元特异性启动子调控下表达荧光蛋白的小鼠，研究者可在振动解离制备样本中识别单个突触终末（图1）。通过激光扫描显微镜以及STED（受激发射损耗显微镜）等新型技术，对这类荧光标记物的成像可实现对终末形态的定量测量。此外，该制备方法也适用于使用报告突触囊泡循环的染料进行可视化观察。Akaike及其同事曾使用苯乙烯染料FM1-43标记GABA能终末，以在活细胞中观察终末结构⁴。

也可通过单细胞逆转录酶PCR来分析振动解离神经元中的RNA表达。该技术通常应用于酶解离的神经元以及细胞培养中生长的神经元。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
振动组织切片机	Leica Microsystems	VT1200S
细胞培养皿（35 mm）	BD 生物科学	353001
玻璃底培养皿	Willco-dish	GWSB-5040 或 GWSB-3522	成像用玻璃厚度为0.16–0.19 mm
压电–电控操作器	EXFO	LSS-3000	也可使用继电器等。
SD9 方波脉冲刺激器	草本科技	SD9K	用于触发压电元件–电控操作器
解剖显微镜	Wild Heerbrugg	TYP 374590	也可使用任意体视显微镜
弗拉明/布朗微量移液器拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
薄壁玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	TW-150F-4	用于火焰拉制的玻璃微电极和膜片钳微电极
六通道灌注阀控制系统	Warner Instruments	VC-6 或 VC-6M
灌流快速步骤	Warner Instruments	SF-77B
配备20-63倍物镜的倒置显微镜	尼康仪器公司	TS200 Diaphot
EMCCD 相机	Andor	iXon电子显微镜+ DU-888
激发荧光照明光源	EXFO	X-Cite 120PC
Fluo-4 AM 钙离子荧光探针	分子探针，Life Technologies	F14201