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Trichuris muris 感染：肠道2型免疫与炎症的一个模型

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DOI：

10.3791/2774

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2011年5月24日

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1The Biomedical Research Centre, University of British Columbia, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

鼠鞭虫（Trichuris muris）感染是一种肠道Th2免疫模型，其中具有抗性的小鼠会产生保护性的Th2反应，而易感小鼠则会产生病理性Th1反应。

摘要

Trichuris muris 是小鼠的一种天然病原体，在生物学和抗原性上与感染人类和家畜的Trichuris物种相似1。通过口服灌胃给予感染性虫卵，虫卵在远端小肠孵化，侵入盲肠和近端结肠隐窝上皮排列的肠上皮细胞（IECs），成熟后成虫将虫卵释放到环境中1。该模型是研究调控CD4+辅助性T细胞（Th）活化因素以及肠道上皮变化的有力工具。在具有抗性的近交系小鼠（如C57BL/6和BALB/c）中，免疫反应以Th2极化细胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）为特征，并伴随虫体排出；而在遗传易感的AKR/J小鼠中，Th1相关细胞因子（IL-12、IL-18、IFN-γ）则促进慢性感染的发生2-6。Th2细胞因子可诱导肠道微环境发生一系列生理变化，包括肠上皮细胞快速更新、杯状细胞分化、细胞募集以及上皮通透性和平滑肌收缩性的改变，这些变化均被认为参与了虫体的排出过程7-15。本文详细描述了一种用于扩增Trichuris muris虫卵的实验方案，可用于后续研究。同时提供了一个示例性的实验收获流程及感染后分析建议。总体而言，本方案将为研究人员提供开展Trichuris muris小鼠感染模型所需的基本技术手段，可用于探究胃肠道中Th细胞的分化倾向以及肠上皮细胞的免疫效应功能。

方案

1. 扩增Trichuris muris虫卵

  1. 以生成新的批次 Trichuris muris 卵，感染20-30只免疫缺陷小鼠（例如 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 或 129S6/SvEvTac-Rag2tm1Fwa RAG2-/-）或6-8周龄遗传易感小鼠（例如AKR/J），通过口服灌胃给予约300个鼠鞭虫（Trichuris muris）卵。
  2. 在第32–35天，通过CO₂处死小鼠2 窒息
  3. 暴露小鼠腹侧，并用70%乙醇润湿腹部。
  4. 用镊子夹住腹部皮肤，用剪刀做一小切口。剪开皮肤以暴露腹腔内容物。
  5. 识别盲肠和近端大肠，并将其切除。
  6. 将盲肠和近端大肠置于含有青霉素（500 U/ml）和DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）的10 cm培养皿中，其中DMEM含有500 μg/ml 链霉素（P/S）。剪开盲肠以暴露其管腔和寄生虫。用镊子将盲肠放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的烧杯中，轻轻振荡以去除粪便。
  7. 将盲肠放回培养皿中，使用光滑弯头镊子（Roboz RS-5047）轻轻取出虫体，置于含5 ml DMEM + P/S的6孔板的一个孔中。
  8. 对所有小鼠重复此过程。
  9. 将6孔板放入含湿润纸巾的密封盒中以维持湿度，并在37℃孵育°4小时，摄氏度
  10. 孵育4小时后，用光滑的弯头镊子取出虫体，将其分至含有5 mL DMEM + P/S的6孔板中的2个新孔内。收集原孔中的内容物，置于15 mL离心管中。以3000 rpm离心，弃上清并保留，作为4小时抗原（经PBS透析后可用于细胞再刺激，每20只小鼠通常可获得10–20 mg蛋白质），将含虫卵的沉淀重悬于高压灭菌的去离子水中。
  11. 将6孔板放回37℃培养箱中°C过夜。移除并处理线虫。将孔内液体收集至离心管中，3000 rpm离心5分钟。弃去上清液，保留沉淀作为过夜抗原（可用于后续实验） 毛首鞭形线虫 经 PBS 透析后进行抗原特异性抗体同种型 ELISA（每 20 只小鼠典型蛋白产量为 10–20 mg），并将含卵的沉淀重悬于高压灭菌的自来水中。
  12. 将4小时和过夜的卵合并，并通过70 μm细胞滤网过滤卵μm 细胞筛以去除残留的线虫，然后转移至 75 cm² 培养瓶中2 锥形瓶。将锥形瓶用锡箔纸包裹，置于室温（RT）避光处静置6周。
  13. 用高压灭菌的自来水清洗卵，并将50个可存活的卵重悬于50 μl. 为此，将卵以3000 rpm离心5分钟，然后重悬于 ˜50 ml 无菌自来水。移除 50 μl 个卵，置于玻璃载片上。使用 40 倍放大倍数，在 50 个 μl. 将卵稀释至50个可存活卵分布在50 μL中 μl. 有关存活卵子的图像，请参见 Kopper 和 Mansfield 的研究16.

2. 用Trichuris muris虫卵（每只小鼠200个虫卵）急性感染实验小鼠

  1. 充分重悬虫卵，并取出足够体积的虫卵悬液用于处理所需小鼠数量的2倍（例如，对于10只小鼠，取200 μl × 10只小鼠 × 2 = 4 ml虫卵），将其置于14 ml带盖离心管中。
  2. 倒置14 ml带盖离心管以混匀。用适当规格的喂养针头（对于体重25克的小鼠，使用18号、1.5英寸针头）连接1 ml注射器吸取200 μl虫卵悬液。一手固定小鼠颈部皮肤，另一手持注射器通过口服灌胃方式给予虫卵。
  3. 等待21天。

3. 实验收获

  1. 第21天使用CO处死小鼠2.
  2. 通过心脏穿刺法采集小鼠血液，使用非肝素化注射器，并于4℃保存°C. 次日分离血清并置于 -20 ℃ 冻存°C. 血清可用于检测 毛首鞭形线虫通过ELISA检测特异性IgG和IgE。
  3. 暴露小鼠腹侧，并用70%乙醇润湿腹部。
  4. 用镊子夹住腹部皮肤，用剪刀做一小切口。剪开皮肤及下方的膜，以暴露腹腔内容物。
  5. 识别小肠、盲肠和结肠。用镊子夹住盲肠并将其拉出腹腔。用另一把镊子将小肠推向右侧，暴露肠系膜淋巴结（mLNs）。小心摘除mLNs，注意不要损伤肠道，将其放入含有2 ml培养基的15 ml离心管中。如需要，可将这些淋巴结进行体外处理和再刺激（4×10⁶）6/ml，在24孔板中每孔1 ml，共24孔 μg/ml αCD3/CD28 或 50μg/ml 4小时 毛首鞭形线虫 Ag）孵育72小时，用于ELISA和细胞内流式细胞术检测细胞因子。
  6. 切除盲肠和结肠。
  7. 使用镊子将远端结肠中的粪便颗粒推出，并置于一个 2 ml Axygen 管中。在 -20 冻存°C. 粪便颗粒可通过蛋白质印迹法分析抵抗素样分子的表达水平β （RELM-β).
  8. 切除盲肠尖端（˜0.5 cm）。用镊子夹住盲肠尖端，在培养皿中用3 ml注射器和22号针头以PBS冲洗以清除粪便。随后将其放入5 ml Falcon螺帽管中的新鲜4%多聚甲醛固定液中。4 ℃保存。°这些样本可进行石蜡包埋、切片并置于载玻片上，用于组织学分析。
  9. 取一段近端结肠组织˜ 1 cm）用于RNA提取。将样品放入含有500 μl裂解液的2 ml Axygen离心管中 μl RNAlater。4℃保存°C. 可通过qPCR分析这些样本的mRNA表达水平。
  10. 将剩余的盲肠组织放入已标记的培养皿中，并于 -20 ℃ 冷冻°C.

4. 盲肠中Trichuris muris虫体的计数

  1. 从冷冻箱中取出盲肠，放入含有培养皿中 ˜5 ml 水
  2. 用剪刀剪开盲肠以暴露其管腔。
  3. 用镊子夹住盲肠，并用力振荡盲肠以去除大部分粪便。
  4. 将盲肠转移至另一含有水的培养皿中，使用光滑的弯头镊子轻轻刮取底层组织上的肠上皮细胞（IECs）。
  5. 将盲肠转移至一个新的含有水的培养皿中，用镊子用力刮取残留组织，将其撕成小块。
  6. 使用解剖显微镜计数所有3个培养皿中的全部线虫。每发现一条线虫，即将其从培养皿中移除，以确保同一条线虫不会被重复计数。若线虫受损（例如断裂成两段），仅计数较粗或较细的一端，以获得准确的计数结果。

5. 代表性结果

Trichuris muris 感染模型可使研究人员量化寄生虫负荷和全身免疫反应，并可通过组织学方法检查远端盲肠内的炎症反应。当暴露所获取的盲肠腔时，可使用解剖显微镜对 Trichuris 虫体进行计数（图 1A-B）。针对 Trichuris 的免疫参数还包括：在具有抗性的动物中发生抗体同种型向 IgG1 的转换（与 Th2 型免疫相关），而在易感动物中则转换为 IgG2a（与 Th1 型免疫相关）（图 1C）。杯状细胞特异性蛋白抵抗素样分子-β（RELM-β）的表达与清除 Trichuris 相关，可通过 Western 印迹分析检测（图 2）。盲肠远端部分可用过碘酸-雪夫（Periodic Acid-Schiff, PAS）染色，以评估杯状细胞反应及感染引发的肠道炎症程度（图 3）。

figure-protocol-1
图1. 免疫力的定量分析 Trichuris muris. （A）抗性（B6）小鼠排出 Trichuris muris 感染后第21天。相比之下，易感型（AKR/J）小鼠则会发展为慢性感染 毛首鞭形线虫，导致寄生虫定植。每根柱状图代表平均值 ± 每组对4-8只动物进行扫描电镜观察。（B）使用解剖显微镜计数线虫。上图显示孤立状态下的线虫，下图显示存在肠上皮细胞和粪便条件下的线虫。（C） 毛首鞭形线虫特异性IgG2a 通过ELISA测定稀释血清（1:2倍比稀释，起始稀释度1:20，终至1:2560）在包被分泌物的酶标板上的抗体滴度 毛首鞭形线虫 抗原（O/N 抗原，5 μg/ml）。易感的 AKR/J 小鼠具有显著更高的水平 毛首鞭形线虫-特异性血清IgG2a水平高于抗性B6小鼠。

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图2. Trichuris muris 的清除与杯状细胞特异性蛋白 RELM-β7 的表达相关。 通过蛋白质印迹分析，可在抗性（B6）小鼠的粪便颗粒中检测到感染 Trichuris 后产生的 RELM-β，但在易感（AKR/J）小鼠中则无法检测到。 每条泳道代表单只动物，(N) = 未处理小鼠，(Tm) = 感染 Trichuris 21 天的小鼠。

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图3. 阑尾远端组织的组织学检查 随后 毛首鞭形线虫 感染. 5-7 μ远端盲肠的PAS染色切片。在抗性（B6）小鼠中可见杯状细胞增生和黏液分泌，而在易感（AKR/J）小鼠中则不明显。 毛首鞭形线虫 感染

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讨论

本方案详细描述了一种标准的高剂量急性Trichuris muris感染模型，可根据研究者的需要进行调整。例如，可在不同时间点处死小鼠并采集组织样本。为确认小鼠是否成功建立完全的蠕虫负荷，可在第14天处死动物，此时所有小鼠的蠕虫负荷应约为200条。亦可将感染持续至32天，此时检测到的所有蠕虫均已成熟，并将在其生命周期内持续存在于宿主体内。此外，本方案还可调整用于建立慢性Trichuris muris感染模型。为此，可将接种的虫卵剂量调整为低剂量感染（约30个虫卵）。在此剂量下，原本具有抗性的小鼠无法诱导保护性Th2反应，反而产生Th1反应，并维持约20条蠕虫的负荷17。

与其它感染模型相比，Trichuris muris 感染模型的一个优势在于，通常情况下感染的小鼠不会出现发病或死亡。然而，研究人员应当注意一些可能影响实验结果的因素。第一个因素是小鼠的遗传背景品系。如结果部分所述，C57BL/6 小鼠具有抗性，而 AKR/J 小鼠易感；同样，其他近交品系也可能表现出不同的感染特征。因此，研究人员必须清楚所用小...

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披露

动物实验严格按照不列颠哥伦比亚大学制定的指南和规定进行。

致谢

本研究工作得到了加拿大卫生研究院（项目编号：MSH-95368、MOP-89773 和 MOP-106623，授予 C.Z.）以及加拿大创新基金会的资助。S.C.M. 获得了加拿大卫生研究院/加拿大胃肠病学协会博士后奖学金。C.Z. 是加拿大卫生研究院新研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物喂食针头（18 x 1½"）Popper & Sons, Inc.7912
平滑弯头镊子Roboz Surgical Instruments Co.RS-5047
DMEMGIBCO, by Life Technologies11965
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)Jackson Laboratory005557这是我们所使用的小鼠品系，但任何免疫缺陷小鼠或易感品系均应适用。
RNA laterQiagen76104
2 ml 离心管Axygen ScientificMCT-200-C
15 ml 离心管Falcon BD352096
6 孔板Falcon BD353046
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710
α-RELMβ 抗体PeproTech Inc0694270Rb

参考文献

  1. Cliffe, L. J., Grencis, R. K. The Trichuris muris system: a paradigm of resistance and susceptibility to intestinal nematode infection. Adv. Parasitol. 57, 255-307 (2004).
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