鼠鞭虫（Trichuris muris）感染是一种肠道Th2免疫模型，其中具有抗性的小鼠会产生保护性的Th2反应，而易感小鼠则会产生病理性Th1反应。
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方法文章
Trichuris muris 感染：肠道2型免疫与炎症的一个模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
Trichuris muris 是小鼠的一种天然病原体，在生物学和抗原性上与感染人类和家畜的Trichuris物种相似1。通过口服灌胃给予感染性虫卵，虫卵在远端小肠孵化，侵入盲肠和近端结肠隐窝上皮排列的肠上皮细胞（IECs），成熟后成虫将虫卵释放到环境中1。该模型是研究调控CD4+辅助性T细胞（Th）活化因素以及肠道上皮变化的有力工具。在具有抗性的近交系小鼠（如C57BL/6和BALB/c）中，免疫反应以Th2极化细胞因子（IL-4、IL-5和IL-13）为特征，并伴随虫体排出；而在遗传易感的AKR/J小鼠中，Th1相关细胞因子（IL-12、IL-18、IFN-γ）则促进慢性感染的发生2-6。Th2细胞因子可诱导肠道微环境发生一系列生理变化，包括肠上皮细胞快速更新、杯状细胞分化、细胞募集以及上皮通透性和平滑肌收缩性的改变，这些变化均被认为参与了虫体的排出过程7-15。本文详细描述了一种用于扩增Trichuris muris虫卵的实验方案，可用于后续研究。同时提供了一个示例性的实验收获流程及感染后分析建议。总体而言，本方案将为研究人员提供开展Trichuris muris小鼠感染模型所需的基本技术手段，可用于探究胃肠道中Th细胞的分化倾向以及肠上皮细胞的免疫效应功能。
方案
1. 扩增Trichuris muris虫卵
- 以生成新的批次 Trichuris muris 卵，感染20-30只免疫缺陷小鼠（例如 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 或 129S6/SvEvTac-Rag2tm1Fwa (RAG2-/-)) 或通过口服灌胃法，向6-8周龄遗传易感小鼠（如 AKR/J）接种约300个鼠鞭虫（Trichuris muris）卵。
- 32–35 天后，通过 CO 处死小鼠2 窒息
- 暴露小鼠腹侧，并用70%乙醇润湿腹部。
- 用镊子夹住腹部皮肤，用剪刀做一小切口。剪开皮肤以暴露腹腔内容物。
- 识别盲肠和近端大肠，并将其切除。
- 将盲肠和近端大肠置于含有含500 U/ml青霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的10 cm培养皿中 500 μg/ml 链霉素（P/S）。剪开盲肠以暴露其管腔和寄生虫。用镊子将盲肠放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的烧杯中，轻轻振荡以去除粪便。
- 将盲肠放回培养皿中，使用光滑弯头镊子（Roboz RS-5047）轻轻取出虫体，并置于含5 ml DMEM + P/S的6孔板的一个孔中。
- 对所有小鼠重复此过程。
- 将6孔板放入含湿润纸巾的密封盒中以维持湿度，并在以下条件下孵育： 37°C 4 小时。
- 4小时后，使用光滑的弯头镊子取出虫体，将其分装至6孔板中的2个新孔，每孔加入5 mL DMEM + P/S。收集原孔中的内容物，转移至15 mL离心管中。以3000 rpm离心，弃去上清液并保留，作为4小时抗原（经PBS透析后可用于细胞再刺激，通常每20只小鼠可获得10–20 mg蛋白质），将含有虫卵的沉淀重悬于高压灭菌的自来水中。
- 将6孔板放回 37°C 过夜。移除并处理掉蠕虫。将孔中的内容物收集至离心管中，3000 rpm离心5分钟。弃去上清液，保留沉淀作为过夜抗原（可用于后续实验） 毛首鞭形线虫 经PBS透析后进行抗原特异性抗体同种型ELISA检测（通常每20只小鼠可获得10–20 mg蛋白质），并将含有虫卵的沉淀重悬于经高压灭菌的自来水中。
- 将4小时和过夜的卵合并，并通过滤网过滤卵液 70μm 滤器以去除残留的蠕虫，然后转移至 75 cm2 锥形瓶。将锥形瓶用铝箔包裹，置于暗处，室温（RT）下静置6周。
- 用高压灭菌的自来水清洗卵，并重悬于含有50个可存活卵的溶液中 50 μl. 为此，将卵在3000 rpm下离心5分钟，并重悬于约50 ml无菌自来水中。去除 50 μl 卵，并置于玻璃载片上。使用40倍放大倍数，计数其中可存活的已孵化卵的数量 50 μl. 将卵稀释至含有50个可存活卵 50 μl有关存活卵子的图像，请参见 Kopper 和 Mansfield 的研究。16.
2. 用Trichuris muris虫卵对实验小鼠进行急性感染（每只小鼠200个虫卵）
- 充分重悬虫卵，并取出足够体积的虫卵悬液用于处理所需小鼠数量的两倍（例如，对于 10 只小鼠，取 200 μl × 10 只小鼠 × 2 = 4 ml 虫卵），置于 14 ml 带盖离心管中。
- 倒置 14 ml 带盖离心管以混匀。用适当规格的喂养针头（对于体重 25 克的小鼠，使用 18 号 1 1/2 英寸针头）连接 1 ml 注射器吸取 200 μl 虫卵悬液。一手固定小鼠颈部皮肤，另一手持注射器通过口服灌胃方式给予虫卵。
- 等待 21 天。
3. 实验收获
- 第21天使用CO2处死小鼠。
- 用非肝素化注射器通过心脏穿刺采集小鼠血液，并在4°C下保存。次日分离血清并置于-20°C冷冻。血清可用于ELISA法检测抗Trichuris特异性IgG和IgE。
- 将小鼠腹侧朝上暴露，用70%乙醇润湿腹部。
- 用镊子夹住腹部皮肤，使用剪刀做一小切口。剪开皮肤及下方膜组织，以暴露腹腔内容物。
- 辨认小肠、盲肠和结肠。用镊子夹住盲肠并将其拉出腹腔。用另一把镊子将小肠推向右侧，暴露肠系膜淋巴结（mLNs）。小心取出mLNs，避免损伤肠道，放入含有2 ml培养基的15 ml离心管中。如需进行体外处理与再刺激，可将细胞以4×106/ml的密度接种于24孔板（每孔1 ml），加入1 μg/ml αCD3/CD28或50 μg/ml Trichuris抗原刺激72小时，随后通过ELISA和胞内流式细胞术分析细胞因子。
- 切除盲肠和结肠。
- 用镊子将远端结肠的粪便颗粒推出，并置于2 ml Axygen离心管中，-20°C冷冻保存。粪便颗粒可通过Western blot检测抵抗素样分子-β（RELM-β）的表达。
- 取盲肠尖端约0.5 cm。为清除粪便，用镊子夹住盲肠尖端，在培养皿中用3 ml注射器配合22号针头以PBS冲洗。随后将其放入5 ml Falcon螺帽管中，加入新鲜配制的4%多聚甲醛固定液。4°C保存。样品可进行石蜡包埋、切片并贴附于载玻片上，用于组织学分析。
- 取近端结肠约1 cm用于RNA提取。将样本放入含500 μl RNAlater的2 ml Axygen离心管中，4°C保存。样品可用于qPCR分析mRNA表达水平。
- 将剩余的盲肠放入标记好的培养皿中，-20°C冷冻保存。
4. 盲肠中Trichuris muris虫体的计数
- 从冷冻箱中取出盲肠，放入含有约 5 ml 水的培养皿中。
- 使用剪刀剪开盲肠，暴露其管腔。
- 用镊子夹住盲肠，剧烈振荡以去除大部分粪便。
- 将盲肠转移至另一含有水的培养皿中，用光滑弯头镊子轻轻刮取肠上皮细胞（IECs），使其与下方组织分离。
- 将盲肠转移至新的含有水的培养皿中，用镊子用力刮擦残留组织，将组织撕成小块。
- 使用解剖显微镜计数三个培养皿中的所有蠕虫。每发现一条蠕虫，应立即将其从培养皿中移除，以避免重复计数。若蠕虫受损（例如断裂成两半），仅计数较粗或较细的一端，以获得准确数量。
5. 代表性结果
Trichuris muris 感染模型可使研究人员定量分析寄生虫负荷和全身性免疫应答，并可通过组织学方法检查盲肠远端的炎症反应。当暴露所获取的盲肠腔时，可使用解剖显微镜对 Trichuris 虫体进行计数（图 1A-B）。针对 Trichuris 的免疫反应参数还包括：在具有抗性的动物中出现抗体同种型向 IgG1 的转换（与 Th2 型免疫相关），而在易感动物中则转换为 IgG2a（与 Th1 型免疫相关）（图 1C）。杯状细胞特异性蛋白抵抗素样分子-β（RELM-β）的表达与清除 Trichuris 相关，可通过 Western 印迹分析检测（图 2）。盲肠远端可用过碘酸-雪夫（Periodic Acid-Schiff, PAS）染色，以评估杯状细胞反应及感染引发的肠道炎症程度（图 3）。
图1. 免疫力的定量分析 Trichuris muris. （A）具有抗性的（B6）小鼠排出 Trichuris muris 感染后第21天。相比之下，易感型（AKR/J）小鼠则会发展为慢性感染 毛首鞭形线虫，导致寄生虫定植。每组每根柱状图代表4-8只动物的平均值±标准误。（B）使用解剖显微镜计数虫体。上图显示分离状态下的虫体，下图显示在肠上皮细胞和粪便存在情况下的虫体。（C） 毛首鞭形线虫特异性IgG2a
通过ELISA测定稀释血清（1:2倍比稀释，起始于1:20稀释度，终止于1:2560稀释度）在包被分泌产物的微孔板上的抗体滴度 毛首鞭形线虫
抗原（O/N 抗原， 5 μg/ml）。易感的 AKR/J 小鼠具有显著更高的水平 毛首鞭形线虫-特异性血清IgG2a水平低于抗性B6小鼠。
图 2. Trichuris muris 的清除与杯状细胞特异性蛋白 RELM-β7 的表达相关。
通过蛋白质印迹分析，可在感染Trichuris后具有抗性的（B6）小鼠粪便颗粒中检测到RELM-β的产生，但在易感的（AKR/J）小鼠中则无法检测到。
每条泳道代表单个小鼠样本，(N) = 未处理，(Tm) = 感染Trichuris 21天的小鼠。
图3. 阑尾远端组织的组织学检查
随后 毛首鞭形线虫 感染. 5-7 μm 远端盲肠的PAS染色切片。在抗性（B6）小鼠中可见杯状细胞增生和黏液分泌，而在易感（AKR/J）小鼠中则不明显。 毛首鞭形线虫 感染
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讨论
本方案详细描述了一种标准的高剂量急性Trichuris muris感染模型，可根据研究者的需要进行调整。例如，可在不同时间点处死小鼠并采集组织样本。为确认小鼠是否成功建立完全的蠕虫负荷，可在第14天处死动物，此时所有小鼠的蠕虫负荷应约为200条。亦可将感染持续至32天，此时检测到的所有蠕虫均已成熟，并将在其生命周期内持续存在于宿主体内。此外，本方案还可调整用于建立慢性Trichuris muris感染模型。为此，可将接种的虫卵剂量调整为低剂量感染（约30个虫卵）。在此剂量下，原本具有抗性的小鼠无法诱导保护性Th2反应，反而产生Th1反应，并维持约20条蠕虫的负荷17。
与其它感染模型相比，Trichuris muris 感染模型的一个优势在于，通常情况下感染的小鼠不会出现发病或死亡。然而，研究人员应当注意一些可能影响实验结果的因素。第一个因素是小鼠的遗传背景品系。如结果部分所述，C57BL/6 小鼠具有抗性，而 AKR/J 小鼠易感；同样，其他近交品系也可能表现出不同的感染特征。因此，研究人员必须清楚所用小...
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披露
动物实验严格按照不列颠哥伦比亚大学制定的指南和规定进行。
致谢
本研究工作得到了加拿大卫生研究院（项目编号：MSH-95368、MOP-89773 和 MOP-106623，授予 C.Z.）以及加拿大创新基金会的资助。S.C.M. 获得了加拿大卫生研究院/加拿大胃肠病学协会博士后奖学金。C.Z. 是加拿大卫生研究院新研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动物喂食针头（18 x 1½"） | Popper & Sons, Inc. | 7912 | |
| 平滑弯头镊子 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5047 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Jackson Laboratory | 005557 | 这是我们所使用的小鼠品系，但任何免疫缺陷小鼠或易感品系均应适用。 |
| RNA later | Qiagen | 76104 | |
| 2 ml 离心管 | Axygen Scientific | MCT-200-C | |
| 15 ml 离心管 | Falcon BD | 352096 | |
| 6 孔板 | Falcon BD | 353046 | |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-RELMβ 抗体 | PeproTech Inc | 0694270Rb |
参考文献
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