本文描述了一种用于监测细胞器向酵母液泡酸性腔内递送以进行降解和回收的稳健方法。该方法依赖于利用基因编码的双发射荧光pH生物传感器对目标细胞器进行特异性标记，并通过荧光显微镜观察单个细胞。
本文内容
摘要
摘要
自噬在多种不同条件下对细胞组分的更新具有重要作用。它不仅具有重要的稳态调节功能，还是一种质量控制机制，能够靶向并选择性降解包括细胞器在内的细胞物质1-4。例如，受损或多余的线粒体 （图 1），若无法通过自噬作用清除，则可能对细胞稳态和细胞存活构成威胁。在酵母中， 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），营养缺乏（例如氮缺乏）或损伤可通过自噬选择性地促进线粒体的 turnover，这一过程称为线粒体自噬（mitophagy） 5-9.
我们描述了一种简单的荧光显微镜方法用于评估自噬。为便于说明，本文仅阐述该方法如何用于监测酵母细胞中的线粒体自噬（mitophagy）。该检测利用一种荧光报告蛋白Rosella，它是一种双发射生物传感器，由一种相对pH稳定的红色荧光蛋白与一种pH敏感的绿色荧光蛋白连接而成。该报告蛋白的工作原理基于活细胞中液泡（pH ~ 5.0–5.5）与线粒体（pH ~ 8.2）之间的pH差异。在正常生长条件下，野生型细胞表现出红色和绿色荧光，其分布模式具有线粒体的典型特征，且荧光信号不与液泡相关。当细胞处于氮饥饿状态（可诱导线粒体自噬的条件）时，除了线粒体上呈现红绿荧光外，细胞中还会在酸性液泡腔内积累红色荧光而无绿色荧光，表明线粒体已被运送至液泡。通过统计仅具有红色荧光液泡而无绿色荧光液泡的细胞数量，可作为衡量细胞线粒体自噬活性的指标5,10-12。
方案
选择合适的对照酵母菌株
该实验依赖于实验人员通过肉眼评估酵母液泡中红色荧光的积累情况。因此，该实验具有主观性，需选择适当的对照菌株和培养条件。野生型对照用于指示正常情况下预期的自噬水平；作为阴性对照，可选用缺乏核心自噬基因（例如 ATG3）表达的菌株，此类菌株无法将物质（如线粒体、细胞核）运送至液泡
1. 用质粒DNA转化酵母细胞
通过使用乙酸锂（LiAcetate）处理，可轻松使酵母细胞具备转化能力。市面上可购买到相关商用试剂盒（例如 EasyComp，Invitrogen），亦有已发表的实验方案可供参考13。
本方案中，我们使用野生型菌株 BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）以及由此衍生的全面基因敲除突变株文库中的部分成员（例如 Δatg3），每个突变株缺失一个不同的非必需基因的表达。该基因敲除菌株文库是利用基于 Rosella 的探针研究自噬过程的有力工具。 本方案所采用的报告蛋白为线粒体定位的 mt-Rosella（图 2A），由质粒 pAS1NB:mt-Rosella12 编码。
以下步骤基于使用 EasyComp 转化试剂盒制备并储存于 -80°C 的感受态细胞，以便于后续使用。
- 在将Solution III（EasyComp Transformation Kit）加入酵母细胞前，于室温下平衡30分钟。
- 向一个无菌的1.7 ml扣盖塑料微量离心管中加入2-2.5 μl（约100 ng/μl）编码报告基因（pAS1NB:mt-Rosella）的质粒DNA。
- 加入5 μl新鲜解冻的感受态酵母细胞，通过轻柔移液混匀。
- 加入50 μl Solution III（EasyComp Transformation Kit），涡旋混匀。将转化反应在28-30°C孵育1小时，每15分钟使用涡旋振荡器或用手指轻弹管壁进行剧烈混匀。
- 小心地将转化混合物转移至一张补充有组氨酸、甲硫氨酸和尿嘧啶的YMM琼脂培养板上，用无菌玻璃涂布器将细胞在琼脂表面轻轻涂布均匀。此阶段酵母细胞较为脆弱，轻柔操作可提高转化子的产量。
- 将培养板在28-30°C孵育2至4天，或直至菌落生长至直径约2-3 mm。
2. 确认 Rosella 在酵母细胞中的表达
在开展详细实验之前，应确认Rosella的正确定位和高效表达。
- 使用无菌牙签从转化平板上为每种菌株挑选5个单菌落，并分别将其重悬于50 μl无菌水中，置于单独的无菌1.7 ml螺口塑料微量离心管中。
- 取10 μl每种细胞悬液分别滴加到标记好的玻璃显微镜载玻片（76 x 26 mm）上，并用正方形盖玻片（22 x 22 mm）覆盖细胞悬液。
- 立即使用荧光显微镜（例如Olympus Fluoview FV500）观察细胞的荧光发射情况。观察是否存在强烈的绿色和红色荧光，并确认具有线粒体定位特征的荧光标记模式（图2B 和 2C）。
- 以该方式完成荧光观察的每个菌落的剩余部分应接种至新鲜的YMM生长平板上。
- 将平板在28-30°C下培养2天，直至菌落直径达到约2-3 mm。
3. 细胞生长与自噬诱导
可以通过多种不同的实验条件诱导自噬，包括进入静止期、改变碳源、施用雷帕霉素或氮饥饿。我们通常采用氮饥饿作为诱导线粒体自噬的方法。
- 挑取单菌落接种于10 ml含有乙醇及相应营养缺陷型补充物的生长培养基中。
- 将酵母培养物在28–30°C条件下以200 rpm转速振荡培养约48小时，使细胞处于对数生长中期。
- 取1 ml培养物两份，于无菌的1.7 ml螺旋盖塑料离心管中，在室温下以2,000 × g离心2分钟，收集细胞沉淀。小心移除并弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。
- 用1 ml无菌蒸馏水重悬细胞，再经离心洗涤三次，以去除残留培养基。
- 第三次洗涤后，将细胞重悬于100 ml生长培养基或氮饥饿培养基中。
- 将重悬的细胞重新接种至10 ml新鲜生长培养基或10 ml氮饥饿培养基中，于振荡条件下培养6–12小时，以诱导线粒体自噬。饥饿处理后，制备细胞样品用于荧光显微镜观察。
注意：使用 CMAC-Arg 对液泡进行标记
初次建立该检测方法时，建议通过荧光显微镜确认Rosella是否成功递送至液泡。尽管酵母液泡是一种较大的细胞器，通常可通过透射光图像确定其位置，但在某些酵母菌株以及特定培养条件下，液泡可能发生碎片化而难以定位。
可以使用基于香豆素的液泡染料（如 CMAC-Arg（7-氨基-4-氯甲基香豆素-L-精氨酸酰胺））对液泡进行有效标记。液泡蛋白酶作用于该染料后，可产生明亮的蓝色荧光，从而标记液泡。这种蓝色荧光发射信号可轻松与 Rosella11 的红色和绿色荧光发射区分开来。CMAC-Arg 标记并非必须常规进行，但对于不熟悉酵母细胞中液泡位置和形态的研究者，建议使用此方法。
4. 使用 CMAC-Arg 对液泡进行标记
- 在成像前，向生长中或氮饥饿的细胞中加入 CMAC-Arg（终浓度为 100 mM）。CMAC-Arg 溶液可预先配制，但由于该溶液对光敏感，需避免光照。
- 在 28–30°C 条件下，以 200 rpm 转速振荡培养 30 分钟。
- 在室温下以 2,000 × g 离心 2 分钟，收集细胞沉淀。
- 弃去上清液。
- 用无菌蒸馏水重悬细胞，离心洗涤三次，以去除残留培养基和过量的 CMAC-Arg 染料。
- 按照下文所述方法将细胞固定后进行成像。
5. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察活酵母细胞的制片
- 将2 mg低熔点琼脂糖分别加入1 ml培养基和氮饥饿培养基中，于70°C孵育使其融化。融化的琼脂糖保持在70°C。
- 取1 ml各细胞培养物，于室温下以2,000 × g离心2分钟，轻柔收集细胞沉淀，并弃去上清液。
- 用1 ml无菌蒸馏水重悬细胞，按步骤5.2进行离心，重复洗涤三次。
- 将洗涤后的细胞重悬于100 μl无菌蒸馏水中。
- 在标记好的玻璃显微镜载玻片（76 × 26 mm）上滴加20 μl融化的琼脂糖，用于固定细胞。
- 立即在琼脂糖基质上滴加10 μl洗涤后的细胞悬液。
- 用盖玻片（22 × 22 mm）覆盖琼脂糖区域，细胞将在盖玻片下方的琼脂糖表面扩散开来。
- 为防止成像过程中脱水及盖玻片移动，需用一层薄薄的指甲油小心封固盖玻片边缘。
- 待指甲油完全干燥后（约10分钟），即可进行荧光显微镜观察。注意：指甲油可能对显微镜物镜造成损害。
- 采用此方法固定的细胞，在固定后1小时内均可进行观察。
6. 使用共聚焦激光扫描显微镜观察自噬
通常通过测定在诱导自噬前后显示红色液泡荧光的细胞数量，来评估细胞群体中的自噬水平。理想情况下，应在诱导自噬后的选定时间点监测自噬的进程（图3）。最佳方法是通过显微镜双目镜直接观察。必须使用正确的对照（例如，Δatg3 突变体），并在观察不同样品时保持显微镜设置不变（例如，中性密度滤光片的使用、滤光片的选择）。
酵母细胞相对较小，需要使用高质量的荧光显微镜（例如 Olympus Fluoview FV500），并配备适用于分别观察 GFP 和/或 pHluorin（绿色荧光发射）（FITC 滤光片）以及 DsRed.T3（红色荧光发射）（TRITC 滤光片）的激发/发射滤光片。
- 使用60倍水镜，交替采用FITC和TRITC滤光片观察未饥饿的野生型细胞。野生型细胞应显示出线粒体典型的细胞周边分布，同时呈现红色和绿色荧光。请注意，线粒体的这种分布依赖于共聚焦显微镜的针孔设置。我们通常采用较低的针孔值 125 μm 仅能观察到线粒体呈一系列点状结构，分布于细胞周边图 2C，以便液泡不被遮挡12. 如果针孔值较高（200 μm用于观察遍布细胞内的典型线粒体丝状网络结构及其所发生的变化11细胞中不应有其他结构被荧光标记。
- 依次观察细胞在转移至饥饿培养基后各时间点的情况。交替使用绿色和红色发射滤光片进行观察。在饥饿处理6小时时，应在液泡中观察到红色荧光，而无相应的绿色荧光信号。液泡定位可通过CMAC-Arg进一步单独验证图 2C观察约200个细胞，计数其中仅在液泡内显示红色荧光的细胞数量（即线粒体被液泡摄取）。
- 统计所有观察时间点的液泡积累数量 >200 个细胞，然后绘制显示液泡积累的细胞百分比。
- 检测饥饿前及饥饿6小时后表达mt-Rosella的自噬阴性对照细胞。
7. 代表性结果：
此处展示了利用在野生型和Δatg3突变体细胞中表达的mt-Rosella所获得的典型结果。在以乙醇作为碳源的生长条件下，野生型和Δatg3突变体细胞均表现出典型的酵母细胞线粒体荧光分布（红色和绿色）。在液泡中未检测到红色和绿色荧光信号（图2B和图2C）。当细胞经历氮饥饿处理6小时或更长时间后，除了对应于线粒体的红色和绿色荧光外，野生型细胞还在液泡腔内出现红色荧光的积累，但无绿色荧光积累（图2B；图3）。然而，在Δatg3突变体细胞中，液泡腔内既无红色也无绿色荧光的积累（图2C；图3）。
图1. 上方，酵母细胞中细胞器和区室的示意图。下方，展示以液泡为中心的酵母细胞视图，显示不同细胞器和区室的自噬降解过程。各种细胞器特异性自噬类型（例如线粒体自噬、细胞核自噬）之间的一些差异包括被包裹内容物的特异性（货物选择）、不同的细胞内需求和胞外信号（例如饥饿、损伤）、特定信号、ATG 基因以及时间依赖性。
图2. （A） mt-Rosella的示意图。线粒体导向序列（此处为柠檬酸合酶的序列）用于将Rosella生物传感器靶向至线粒体基质。图中显示了红色荧光蛋白（DsRed.T3）和绿色荧光蛋白（pHluorin）的激发和发射最大值。在高pH值（线粒体pH值约8.2）下，该生物传感器同时发出红色和绿色荧光；而在低pH值（液泡pH值约5.5）下，仅发出红色荧光。
（B） 表达mt-Rosella的野生型细胞与Δatg3突变体细胞预期结果的示意图。
（C） 通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获得的野生型细胞在生长状态和氮饥饿条件下的实际结果。从左至右：DIC（相差图像）、RFP（DsRed.T3）荧光发射、GFP（pHluorin）荧光发射、CMAC-Arg荧光以及合并图像。
（D） 通过荧光显微镜获得的Δatg3突变体细胞在生长状态和氮饥饿条件下的实际结果。从左至右：DIC（相差图像）、RFP（DsRed.T3）荧光发射、GFP（pHluorin）荧光发射、CMAC-Arg荧光以及合并图像。
图3. 表达mt-Rosella并在氮饥饿条件下培养的野生型和Δatg3突变体细胞中，在48小时时间过程中显示液泡内红色荧光的细胞百分比。在开始氮饥饿后的0、6、12、24和48小时记录显示液泡内红色荧光累积的细胞百分比。
讨论
在图2B和图2C所示的代表性图像中可以清楚地看到，利用细胞器特异性的荧光报告分子和荧光显微镜技术，能够提供生长状态和氮饥饿状态下细胞中线粒体定位/分布的证据，并可实现线粒体自噬的可视化。
需要强调的是，该方法并不局限于监测线粒体自噬。通过适当的标记，也可用于监测其他细胞组分或细胞器（如核糖体、脂滴、过氧化物酶体、内质网和细胞核）的自噬过程。有关Rosella生物传感器构建体、细胞培养条件以及细胞核（即核自噬）降解的典型结果的详细信息已有报道11,12，说明了该方法更广泛的应用前景。
使用细胞器特异性荧光报告分子监测自噬过程时，需注意报告分子构建设计的多个方面。这些方面包括：（1）选择适当的靶向信号并将其与报告分子融合，以实现细胞器特异性靶向；（2）选择合适的荧光蛋白；（3）具有强荧光发射能力；（4）在细胞内正确定位于目标细胞器或呈现正确的分布模式。一旦细胞器特异性报告分子在选定的酵母宿主菌株中成功表达，接下来需考虑的第二组因素包括：（1）酵母的培养条件；（2）细胞样品的制备；（3）成像参数的设置，需特别注意共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的参数（如激光强度、扫描速率与模式、针孔大小、缩放倍数、所用物镜或CCD相机的曝光时间）在整个实验过程中应保持一致，以确保对照组（正常生长细胞）与饥饿处理组样品之间可进行有效比较；（4）自噬的诱导以及报告分子成功递送至液泡内。
总体而言，这种荧光显微镜方法操作简便、相对快速，具有应用于高通量筛选的潜力，可用于发现增强或抑制自噬的新药，以及调控或调节自噬的相关基因。
致谢
本工作得到澳大利亚研究理事会基金 DP0986937 的资助。
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