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多重PCR与反向线点杂交分析（mPCR/RLB）

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DOI：

10.3791/2781

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2011年8月6日

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Infectious Diseases and Microbiology, University of Sydney

本文内容

摘要

本文描述了一种低成本、高通量的方法，可同时检测多达43个分子靶标。多重PCR/反向线性杂交（mPCR/RLB）的应用包括微生物分型以及从临床样本中检测多种病原体。

摘要

多重PCR/反向斑点杂交检测技术可在一次多重PCR反应后，通过探针与尼龙膜的杂交，实现对43个样本中多达43个分子靶标的检测，且尼龙膜可重复使用。探针在5'端经氨基修饰，以便固定于膜上；引物在5'端经生物素修饰，从而可通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶与化学发光底物反应，利用感光膜检测杂交后的PCR产物。该技术设备投入和耗材成本低，单个样本检测费用约为2美元，通量高（可同时处理多张膜），且周转时间短（约10小时）。

该技术可通过多种方式加以应用。可设计多个探针以检测单个扩增产物内的序列变异，也可同时扩增多个产物，并使用一个（或多个）探针进行后续检测。在单个检测中亦可结合使用这两种方法。由于能够针对单个靶序列包含多个探针，该检测具有高度特异性。

多重PCR/反向线性杂交（mPCR/RLB）已发表的应用包括检测抗生素耐药基因1,2、对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌3-5和沙门氏菌sp6进行分型、肺炎链球菌7,8、无乳链球菌9及肠道病毒10,11的分子血清型鉴定、分枝杆菌sp12的鉴定、生殖道13-15、呼吸道16及其他部位17病原体的检测，以及支原体的检测与鉴定18。然而，该技术具有高度通用性，其应用几乎不受限制，并不仅限于微生物的分子分析。

多重PCR/反向斑点杂交（mPCR/RLB）的五个步骤包括：a) 引物和探针设计，b) DNA提取与PCR扩增，c) 膜的制备，d) 杂交与检测，以及 e) 膜的再生。

方案

在引物和探针设计时必须仔细考虑。应利用 GenBank 等数据库中目标序列的所有可用信息，识别出适合作为靶点的保守区域。当在单个多重 PCR（mPCR）检测中扩增大量目标序列时，每个扩增产物的长度应相近，且不应超过 300 个碱基对，以避免扩增竞争。该方法的另一种应用是：使用针对保守区域的引物扩增一个较长的目标片段，并通过多个探针来鉴定扩增子内部的序列变异。在这种情况下，扩增的 PCR 产物可以更长。所有引物的退火温度应相近，并相应调整 PCR 反应条件。应避免使用容易形成强二级结构或引物二聚体的引物。可使用 Sigma Aldrich DNA 计算器（http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp）可靠地预测这些特性。

DNA探针的设计应使其退火温度接近60°C。为了最大限度提高特异性，可在检测中为每个目标序列设计两个探针，其中一个与反向引物结合位点附近的正向DNA链杂交，另一个与正向引物结合位点附近的反向DNA链杂交。在此情况下，正向和反向引物都必须进行生物素修饰。如果每个扩增目标仅使用一个探针，则只需对其中一个引物进行生物素修饰。

在为多重PCR/反向斑点杂交（mPCR/RLB）实验设计引物和探针时，强烈建议使用in silico方法预测PCR产物及探针杂交情况，以便与in vitro实验结果进行比对。理想情况下，应使用已知全基因组序列的分离株进行分析。可使用如FastPCR等软件（可从http://primerdigital.com/fastpcr.html获取）完成此目的。当in silico分析显示存在碱基错配，导致探针退火温度较低时，可预测出探针信号微弱或缺失。

DNA提取技术将根据被测样本的不同而有所差异，PCR条件则取决于引物设计。有关DNA提取和PCR试剂及反应条件的更多信息，读者可参考关于各个检测方法的出版物1-19。

每次实验均需设置适当的对照，以确保膜上的每条探针至少产生一个阳性信号和一个阴性信号，同时还需设置无DNA对照。此外，建议在膜的上方加入一条针对所有样本均预期呈阳性的探针（例如：在微生物检测中使用物种或属特异性探针）。该探针既可作为阳性对照，也有助于结果的快速定位与判读。

1. 膜的制备

  1. 配制以下溶液：
    • 100 ml 0.5 M NaHCO₃（pH 8.4）
    • 100 ml 0.5M NaHCO₃3
    • 20 ml 16% EDAC
    • 250 ml 0.1 M NaOH
    • 250 ml 2xSSPE
    • 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS — 置于水浴中加热至 60°C
    • 250 ml 20 mM EDTA
  2. 将烤箱预热至 60°C.
  3. 用70%乙醇清洁Immunetics Miniblotter。
  4. 将寡核苷酸探针稀释于 0.5 M NaHCO₃ 中3 至终浓度为 2 pmol/μl 以及一个体积的 200 μl.
  5. 将Biodyne C尼龙膜裁剪为15 cm × 15 cm。使用铅笔和直尺，在膜的顶部标记出0.5 cm的空白区域，并在此处书写相关信息。
  6. 将膜放入塑料袋中，加入20 ml新配制的16% EDAC溶液，室温下轻轻摇动10分钟。
  7. 用去离子水洗涤膜30秒。
  8. 将膜放入小型转印槽中，使槽道横跨膜面（与铅笔标记线平行）。放入支撑垫并合上转印槽。吸去槽道中的液体。
  9. 在1号和45号泳道中加样 150 μl 0.5 M NaHCO₃3使用 150 μl 依次加入每种探针溶液以填充第2至第44泳道，注意避免产生气泡。若通道中出现气泡，保持移液器位置不变，快速吸取溶液使气泡上浮至移液器顶端，然后重新操作。室温孵育5分钟。
  10. 吸去探针溶液，取出膜，在室温下用 250 ml 0.1 M NaOH 洗涤 9 分钟。
  11. 用250 ml 2xSSPE缓冲液洗涤膜30秒。
  12. 在烘箱中用 250 ml 预热的 2xSSPE/0.1% SDS 洗涤膜 60°C 5 分钟。
  13. 若不立即用于杂交，将膜在240 ml 20 mM EDTA溶液中室温洗涤20分钟（保留剩余10 ml），然后将膜与剩余的10 ml 20 mM EDTA一同密封于塑料袋中，置于冰箱中保存 4°C.
  14. 用Pyroneg去垢剂清洗微型印迹装置并用刷子刷洗。冲洗后晾干。

2. 杂交与检测

  1. 准备以下溶液：
    • 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS — 置于60°C水浴中保存。
    • 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS — 置于60°C水浴中保存
    • 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS — 置于42°C烘箱中保存
    • 500 ml 2xSSPE — 室温保存
    • 500 ml 1% SDS — 初始时置于60°C水浴中保存（用于步骤3）
    • 250 ml 20 mM EDTA — 室温保存（用于步骤3）。
  2. 开启一个60°C的烘箱和一个42°C的烘箱。在加热板上的大烧杯中将水煮沸。
  3. 用70%乙醇清洁Immunetics Miniblotter。
  4. 将10 ml 2xSSPE/0.1% SDS分装至小容器中。在编号的试管中，向150 μl 2xSSPE/0.1% SDS中加入20 μl每种PCR产物。
  5. 使用泡沫塑料支架在100°C下将PCR产物煮沸10分钟。立即置于冰上至少5分钟。
  6. 将膜在60°C烘箱中用剩余的240 ml 2xSSPE/0.1% SDS洗涤5分钟。
  7. 将膜放入miniblotter中并加上背垫。方向应使通道垂直运行（与铅笔线垂直）。
  8. 用负压吸除miniblotter通道中的多余液体。
  9. 向第一和最后一个通道中加入剩余的150 μl 2xSSPE/0.1% SDS。按顺序向其余通道（2–44）中加入已煮沸的PCR产物，注意避免产生气泡。
  10. 将miniblotter平放于60°C烘箱中1小时，以进行杂交反应。
  11. 吸出每个通道中的液体，然后将膜从miniblotter中取出。
  12. 在60°C烘箱中用预热的250 ml 2xSSPE/0.5% SDS洗涤两次，每次10分钟。
  13. 用42°C的2xSSPE/0.5% SDS润湿尼龙分离网，并用其将膜卷起。
  14. 将卷好的膜放入滚筒管中，展开以确保膜紧贴内壁表面。在15 ml 42°C的2xSSPE/0.5% SDS中加入3 μl链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物（Roche Applied Science），混匀后加入滚筒管中。拧紧盖子，在42°C滚筒烘箱中孵育60分钟。确保滚动方向不会使膜收紧。定期检查是否泄漏。
  15. 用Pyroneg洗涤剂和水清洗miniblotter，冲洗后晾干。
  16. 从滚筒管中取出膜。在42°C下用剩余的2xSSPE/0.5% SDS洗涤两次，每次10分钟。
  17. 在室温下用2xSSPE洗涤两次，每次5分钟。
  18. 将烘箱温度升至80°C，并将500 ml 1% SDS放入烘箱中预热。
  19. 配制15 ml Amersham ECL检测试剂（7.5 ml溶液A和7.5 ml溶液B）。弃去2xSSPE，加入检测试剂。手动轻轻摇动2分钟，确保膜完全被溶液覆盖。弃去化学发光溶液。
  20. 裁剪两张大小合适的透明塑料片以适配曝光盒。将膜夹在两张塑料片之间，并放入曝光盒中。
  21. 进入暗室。在红光下将ECL检测胶片放入曝光盒，曝光5分钟。取出胶片时将右下角折角（狗耳标记），以便后续观察时正确辨识方向。
  22. 按照制造商说明，使用自动显影机或化学显影液显影胶片。
  23. 如需要，可重复进行更长或更短时间的曝光。

3. 膜的再生

  1. 在 250 ml 1% SDS 中，80°C 条件下洗涤膜两次，每次 30 分钟。
  2. 在 240 ml 20 mM EDTA 中，室温下洗涤膜 15 分钟。
  3. 将膜与 10 ml 20 mM EDTA 一起密封于塑料袋中，4°C 冷藏以备后续重复使用。

4. 代表性结果：

通过将膜置于打印的网格上观察，或扫描图像后导入BioNumerics（Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium）等软件中查看，可获得最佳结果。每种探针的结果均需参照阳性和阴性对照探针进行判读。结果最好分为阴性、弱阳性或阳性。阳性结果指信号强度等于或强于阳性对照探针；阴性结果指无信号或信号强度与阴性对照相同（即背景信号水平）；弱阳性结果指信号弱于阳性对照探针，但强于阴性对照。弱阳性结果可能由导致探针结合减弱的点突变引起，也可能源于引物二聚体形成的非特异性信号。对每个目标使用两个探针可提高特异性，若仅其中一个探针呈弱阳性，则可安全地将其判读为非特异性信号。若仍有疑问，可进行单重PCR反应，并通过凝胶电泳检测及对扩增产物测序，以确认结果是否真正为阳性。图2展示了一个代表性结果。

胺基-生物素标记DNA检测示意图；尼龙膜上的化学发光。
图1. 多重PCR/反向斑点杂交（mPCR/RLB）原理。（P1）步骤1.9：经胺基修饰的探针共价结合至尼龙膜上。（P2）步骤2.10：经生物素修饰的PCR产物与膜上的探针发生杂交。（P3）步骤2.14：用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与膜孵育，使其结合至生物素。（P4）步骤2.19–2.21：辣根过氧化物酶催化ECL检测试剂中的反应，产生光信号，使感光胶片曝光。随后将膜洗涤，以供重复使用。

点印迹分析；样品与探针的网格；分子相互作用；示意图；数据可视化。
图2. 典型的多重PCR/反向线点杂交（mPCR/RLB）结果。样品1至6为阳性对照——它们共同包含了全部43个探针中每个探针至少一次的阳性信号。每个靶序列（A至U）均使用两个不同的探针进行检测，以提高特异性。探针A1和A2为种特异性探针，预期在每个样品中均为阳性，有助于确定膜的方向。探针A1在膜的底部重复出现。样品7和8为阴性对照。请注意，探针Q1、Q2、T1和T2在阴性对照中出现信号，表明引物可能存在非特异性结合或引物二聚体产物。这些探针或引物需要重新设计。探针C1、D1和F1在膜上呈现条带状扩散，可能是由于链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物或化学发光底物的非特异性吸附所致，但此类信号易于与真正的阳性探针信号区分。探针D1和D2的信号强度相对其他探针较弱，可能由于扩增片段较大，导致扩增效率较低。在多个样品（1、3、4、6、39）中，探针J2为阴性而J1为阳性，最可能的原因是这些样品中J2结合位点发生了突变。

讨论

多重PCR/反向斑点杂交（mPCR/RLB）方法可同时检测大量PCR扩增产物。由于基于化学发光探针的检测具有高灵敏度，因此仅需一次包含大量引物对的多重PCR反应即可扩增DNA模板。

如果一个或多个样本未获得探针信号，可对剩余的PCR产物进行凝胶电泳，以帮助判断问题是出在PCR扩增还是探针杂交环节。若膜上所有探针信号均微弱或缺失，但凝胶电泳结果显示PCR扩增成功，则可能原因包括：膜的标记存在问题、膜在先前使用后再生不当、杂交或链霉亲和素孵育过程中温度设置错误，或链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物及检测试剂存在缺陷。

如果对照样品表明个别探针可能产生假阴性信号，可进行单重PCR结合凝胶检测，并随后进行测序，以确认PCR产物的扩增情况，并检测探针结合位点是否存在序列变异。探针信号弱或缺失可能源于扩增子过大：应尽可能使所有扩增子长度相近，且小于300 bp。扩增子的二级DNA结构也可能导致探针结合不良，此时可能需要重新设计引物。也可调整单个引物或探针的浓度，以优化信号强度。

由于探针与未扩增的引物或引物二聚体产物结合而导致的假阳性信号，可通过进行单重PCR结合凝胶检测及后续测序来分析。若出现此类情况，可能需要重新设计探针。探针结合位点的点突变可能导致信号微弱或缺失。为每个扩增产物设计两条探针，可便于此类问题的检测。通过精心设计引物和探针，可利用这一特性检测靶DNA中的微小序列变异。

总之，尽管目前存在多种可用于多重PCR反应后产物检测的方法，但多重PCR/反向线性杂交（mPCR/RLB）具有高通量、成本低廉且启动费用低的优势。该方法的灵活性使其可广泛应用于多种场景。

致谢

Matthew O'Sullivan 和 Fei Zhou 获得了澳大利亚国家卫生与医学研究理事会研究生医学研究奖学金。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5’ 胺基 C6 修饰的寡核苷酸探针Sigma-Aldrich
NaHCO3Sigma-AldrichS-8875配制成 pH 8.4 的 0.5 M 溶液
NaOHSigma-AldrichS58810.1 M 溶液
20xSSPE 缓冲液Amresco0810-4L
十二烷基硫酸钠 (SDS)Sigma-AldrichL-4390配制成 10% 储存液，勿高压灭菌，最多保存 1 周后使用
乙二胺四乙酸 (EDTA)Sigma-AldrichE9884配制成 0.5 M 溶液，调节 pH 至 8.0 后高压灭菌
N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDAC)Sigma-AldrichE7750使用前立即配制 20 ml 16% 溶液，含 3.2 g EDAC 和 18 ml 超纯水
BiodyneC 0.45 μm 尼龙膜 20x20 cmPall Corporation74480C
去离子纯化水
Liquid Pyroneg 去污剂Johnson DiverseyHH12291
链霉亲和素-过氧化物酶偶联物Roche Group11 089 153 001
Amersham ECL 检测试剂GE HealthcareRPN2105
Amersham ECL 检测试剂GE HealthcareRPN2105
OHP 透明胶片Corporate ExpressEXP 504 OHP
Amersham hyperfilm ECL 高性能化学发光胶片 18x24 cmGE Healthcare28906837
冰
表 1. mPCR/RLB 检测中使用的耗材。
Hybaid Shake’n’Stack 烤箱（2 台），带滚动瓶和尼龙分离网Thermo Fisher Scientific, Inc.HBSNSRS220只要能在使用前维持溶液温度在 42°C 和 60°C，也可使用单台烤箱完成本方法
Belly Dancer 摇床平台Stovall Life Sciences, IBI SciencesEuro BDbo
MiniblotterImmuneticsMN100-45
水浴锅
抽吸装置
加热板
曝光暗盒Sigma-AldrichZ36,009-0
X 射线胶片显影仪也可在暗室中使用显影液、定影液和水盘代替自动显影仪。也可使用化学发光成像仪代替 X 射线胶片
表 2. mPCR/RLB 检测所需设备。

参考文献

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