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小鼠骨髓来源树突状细胞的制备及其使用Qdot纳米晶体的标记用于示踪研究

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DOI：

10.3791/2785

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2011年6月2日

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1Molecular and Cell Biology Program, Ohio University, 2Department of Biomedical Sciences, College of Osteopathic Medicine, Ohio University, 3Department of Biomedical Engineering, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

树突状细胞摄取抗原后迁移至免疫器官，将加工后的抗原呈递给T细胞。量子点纳米晶体标记可提供持久且稳定的荧光信号，从而可通过荧光显微镜追踪树突状细胞在不同器官中的分布。

摘要

树突状细胞（DC）是一类存在于外周组织以及胸腺、骨髓、脾脏、淋巴结和派尔集合淋巴结等免疫器官中的专业抗原呈递细胞（APC）1-3。位于外周组织中的DC会持续监测机体是否存在抗原，并摄取、加工这些抗原，随后通过主要组织相容性复合物（MHC）分子将其呈递于细胞表面。随后，携带抗原的DC迁移至免疫器官，在那里将加工后的抗原呈递给T淋巴细胞，从而启动特异性免疫应答。评估DC迁移能力的方法之一是使用荧光染料对其进行标记4。

在此，我们演示使用Qdot荧光纳米晶体标记小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）。该标记方法的优势在于，Qdot纳米晶体具有稳定且持久的荧光特性，非常适合在回收的组织中检测标记细胞。为实现这一目的，首先从小鼠骨髓中分离细胞，并在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子存在下培养8天，以诱导DC分化。随后，通过短期体外孵育，用荧光Qdot对这些细胞进行标记。标记后的细胞可用荧光显微镜观察。此时，细胞可直接注射至实验动物体内，或进一步诱导为成熟细胞。 体外 用炎症刺激物孵育。在我们的实验中，树突状细胞（DC）的成熟不会导致荧光信号的丢失，且Qdot染色不影响DC的生物学特性。注射后，通过典型的解剖和固定步骤，可在免疫器官中利用荧光显微镜识别这些细胞。

方案

1. 小鼠股骨和胫骨的解剖及骨髓细胞的培养

  1. 通过 CO2 窒息法处死 2 只小鼠，小心分离胫骨和股骨，避免切割骨端。
  2. 用纸巾清除骨骼上附着的所有组织，注意不要折断骨骼。
  3. 将骨骼置于含 70% 乙醇的 35 mm 培养皿中浸泡 10 分钟以进行消毒。自此步骤起，所有操作均应在生物安全柜内进行，以避免细胞培养污染。
  4. 从乙醇中取出骨骼，置于生物安全柜内的培养皿中晾干 5 分钟。
  5. 将股骨切成两半，胫骨从最细的一端切断。在无菌培养皿中，使用无菌注射器向骨髓腔内注入 1 ml RPMI 培养基（不含血清但含抗生素）。
  6. 收集细胞悬液，并在 4°C 预冷的离心机中以 1,100 RPM 转速离心 10 分钟（使用摆动桶转子），在 15 ml 离心管中用 RPMI 培养基洗涤两次。
  7. 最后一次洗涤后，将细胞重悬于 2 ml ACK 裂解缓冲液中，室温孵育 5 分钟以去除红细胞。
  8. 加入 13 ml 含 10% FBS 的 RPMI 培养基，重悬细胞，并按 1.6 所述相同条件在此培养基中洗涤两次。
  9. 计数细胞，用含 10% FBS 的 RPMI 培养基调整细胞浓度至 2 × 105 个细胞/ml，并加入 rm-GM-CSF（终浓度为 20 ng/ml）5。
  10. 将 10 ml 该细胞悬液加入无菌、微生物级 10 cm 培养皿中，在 CO2 培养箱（37°C，5% CO2）中培养。
  11. 三天后，向每个制备好的培养皿中加入另外 10 ml 含 10% FBS 的 RPMI 培养基，其中含 20 ng/ml rmGM-CSF。
  12. 再过三天后，从每个培养皿中回收 10 ml 细胞悬液，按 1.6 所述条件离心，用相同体积的含 rmGM-CSF 的 RPMI 10% FBS 重悬后返回原培养皿。继续在 CO2 培养箱中培养 2 天。

2. 树突状细胞的收集与标记

  1. 培养 8 天后，通过用新鲜培养基冲洗培养皿收集松散贴壁的细胞。在我们实验室条件下，该方案可获得约 2-4 × 108 个树突状细胞（DC）。细胞可通过流式细胞术分析 DC 表型。
  2. 收集的细胞随后严格按照试剂盒说明书使用 Qtracker 655 细胞标记试剂盒进行标记。
  3. 我们使用 10 nM 浓度的量子点（Qdots）标记小鼠骨髓来源的树突状细胞获得了优异的结果。具体操作为：将 Qtracker 细胞标记试剂盒组分 A 和 B 各取等体积混合，室温孵育 5 分钟，然后立即用新鲜培养基按 1:100 稀释，并涡旋震荡 30 秒。
  4. 为标记 5 × 106 个 DC，取 5 μl 试剂盒组分 A 和 5 μl 组分 B 加入离心管中，混匀后室温孵育 5 分钟。然后加入 1 ml RPMI 10% FBS，涡旋震荡 30 秒。
  5. 加入含 5 × 106 个 DC 的细胞悬液 0.5 ml，37°C 孵育 60 分钟。
  6. 随后用 RPMI 10% FBS 洗涤细胞两次（1,100 转/分钟）。细胞可重悬于 RPMI 培养基中继续培养，或重悬于 PBS 中用于实验小鼠的注射。

3. 标记的DC的评估

  1. 可通过荧光显微镜评估细胞标记效果。为此，取一滴细胞悬液滴加到显微镜载玻片上，加盖盖玻片，使用荧光显微镜进行观察，并注意这些量子点的发射光谱和激发光谱分别为 565 nm 和 405–525 nm（图 3）。
  2. 此时，标记后的细胞可用于动物注射，或通过在 LPS（100 ng/ml）和 TNF-α（20 ng/ml）存在下，于 37°C、5% CO2 条件下培养 48 小时以诱导成熟。树突状细胞成熟过程不影响荧光标记效果（图 4）。

4. 代表性结果：

本文描述了如何制备小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC），以及如何用荧光量子点（Qdots）对其进行标记。图1总结了获取该细胞的流程，而图2展示了用量子点标记细胞的步骤。如图3所示，几乎所有细胞均可通过该方法被标记，且该标记效果不受炎症因子诱导DC成熟的影响（图4）。图5显示，在给予炎症刺激后，经量子点标记的DC（图5a）与未标记细胞行为相似。两种细胞在成熟刺激下均能类似地上调共刺激分子的表达（图5b），并产生相似水平的IL-6（图5c）和一氧化氮（图5d）。这与先前已发表的数据一致，表明量子点标记不影响DC分化为成熟细胞并激发免疫应答的能力[6]。这些细胞随后可用于注射实验动物。如图6所示，在将标记的DC经静脉注射入小鼠体内2天后，我们可在脾脏中检测到量子点标记的细胞。该结果也与此前发表的研究相符，后者表明可通过非侵入性成像和流式细胞术，利用量子点纳米晶体在活体（in vivo）中评估DC的迁移[6]。

小鼠骨髓提取示意图；骨髓细胞在GM-CSF存在下培养用于细胞研究。
图1. 从骨髓生成树突状细胞的流程图。此处展示了获得骨髓来源树突状细胞（DC）的过程。分离小鼠的胫骨和股骨，并清除周围组织。保留骨端，用培养基冲洗骨髓腔。去除红细胞后，骨髓细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下培养8天，以诱导其分化为树突状细胞。

使用显微镜对树突状细胞进行荧光标记的流程图；展示逐步操作过程。
图 2. 标记步骤流程图。将Qtracker细胞标记试剂盒组分A和组分B等量混合于EP管中。从含GM-CSF培养8天的骨髓培养物中收集树突状细胞，并与标记染料在37°C孵育60分钟。随后用培养基洗涤细胞，以去除过量的标记颗粒。

荧光显微镜图像，细胞结构高亮显示，红色发射，显微分析。
图3. 树突状细胞标记后立即拍摄的荧光显微照片。将一滴标记后的细胞置于玻片上，并加盖盖玻片。随后在荧光显微镜下观察样品，并使用Micropublisher 5.0数字CCD彩色相机（Qimaging，加拿大不列颠哥伦比亚省萨里市）采集图像。

细胞成像，荧光显微镜，红蓝染色细胞，DNA鉴定，显微镜研究。
图4. 树突状细胞体外成熟48小时后的荧光显微摄影。将标记的树突状细胞接种于玻璃片上，在CO2培养箱（37°C，5% CO2）中加入LPS（100 ng/ml）和TNF-α（20 ng/ml）共同培养48小时。随后，样本用PBS洗涤（5分钟，2次），丙酮固定（15分钟，4°C），并用DAPI复染。按上述方法在荧光显微镜下观察细胞。

流式细胞术分析：CD40、CD86 的直方图；IL-6 浓度、硝酸盐水平的柱状图。
图5. Qdot标记的成熟树突状细胞的生物学活性标记的DCs成熟 体外 如上所述的样本通过流式细胞术进行分析（A）和（B）。（A）Qdot标记的细胞在FL3（PercP）通道中显示出强信号。阴影直方图：未标记对照。（B）Qdot标记和未标记的树突状细胞（DCs） дополнительно 使用针对成熟标志物CD86和CD40的特异性抗体以及同型对照抗体进行染色。随后在FACSort流式细胞仪（Becton Dickinson，San Jose，CA）上分析细胞。此外，通过ELISA分析和Griess法检测成熟Qdot标记DCs及其对照组上清液中IL-6（C）和一氧化氮（NO）的水平，检测方法如我们先前所述。 7, 8图中所示所有数据均来自两次或三次独立实验，结果相似。采用 GraphPad 软件进行单因素方差分析（ANOVA）对数据进行分析。

荧光显微镜图像，蛋白质定位，细胞核染成蓝色，红色信号呈点状。
图 6. 在分离组织中标记树突状细胞（DCs）的检测。将标记成熟的树突状细胞（1×106 个细胞）通过静脉注射至 C57BL/6 小鼠体内。（A）两天后处死小鼠并收集脾脏，迅速冷冻后包埋于 OCT 包埋剂中，并使用冷冻切片机制备 8 μM 切片。随后，样本用丙酮固定（15 分钟，4°C），并用 DAPI 复染。细胞在荧光显微镜下按上述方法进行观察。图 6a：40 倍放大，图 6b：100 倍放大，图 6C：400 倍放大。

讨论

小鼠髓系树突状细胞（DCs）已被广泛用于评估基于DC的疫苗的有效性及优化方案；研究DC与T细胞的相互作用或DC的发育过程；以及确定其在多种疾病中的作用9-11。本文中，我们展示了如何从小鼠胫骨和股骨骨髓中分离前体细胞并诱导生成树突状细胞。我们在不切断骨端的情况下取出骨骼，从而可通过将骨骼浸入70%乙醇中进行彻底消毒，降低污染风险。为了从骨髓细胞中诱导分化出树突状细胞，我们仅使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），方法如前所述5。尽管某些实验方案同时使用白细胞介素-4（IL-4），但已有报道指出，在高浓度GM-CSF条件下，该细胞因子并非必需12。事实上，我们此前已证实，此类树突状细胞能够诱导免疫应答13。此外，需注意在培养第8天时，仅收集轻度贴壁的细胞，通过培养皿加培养基轻轻冲洗获得，因为牢固贴壁的细胞更倾向于呈现单核细胞样表型。本文中我们展示了使用荧光量子点（Qdot）颗粒标记树突状细胞的方法。相比其他标记方法，该方法具有多项优势：第一，量子点颗粒易于被细胞摄取；第二，其荧光信号强，且不受树突状细胞成熟过程的影响；第三，与使用绿色荧光蛋白（GFP）标记DC不同，使用丙酮等有机溶剂对细胞或组织进行固定后，量子点的荧光信号不会丢失14，从而在选择染色方案时具有更高的灵活性；最后，由于其荧光信号强度高，即使存在组织自发荧光，仍可清晰观察到标记细胞。如前所述6，量子点染色不影响这些细胞的成熟能力。本文进一步证明，经量子点标记的树突状细胞与未标记细胞行为相似，在受到炎症刺激后，均可上调共刺激分子表达，并产生IL-6和一氧化氮。尽管树突状细胞是启动免疫应答的专业化细胞，但已有研究表明其也参与多种病理过程，如癌症和动脉粥样硬化4, 15, 16。此外，树突状细胞还被认为参与血管生成过程17, 18，甚至有研究提出其可能在结构上参与新血管的形成19, 20。因此，能够实现体内追踪树突状细胞并确定其在不同组织中空间定位的方法具有重要价值4, 21, 22。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R15 CA137499-01（F.B.），以及俄亥俄大学（F.B.）的启动资金支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C57BL/6 小鼠Jackson Laboratory雌性，6-8 周龄
RPMIInvitrogen11875-119
胎牛血清，经鉴定合格Invitrogen10437-028
抗生素-抗真菌剂Invitrogen15240-096
PBSInvitrogen10010-049
ACK 裂解缓冲液Lonza Inc.10-548E
重组小鼠 GM-CSFPeproTech Inc315-03
Qtracker 655 细胞标记试剂盒InvitrogenQ25021MP
脂多糖Invitrogentlrl-eblps
重组小鼠 TNF αPeproTech Inc315-01A
CD86 抗体BD Biosciences553691
CD40 抗体BD Biosciences553791
Griess 试剂系统Promega Corp.G2930
IL-6 捕获抗体eBioscience13-7061-81
IL-6 检测抗体eBioscience13-7062-81

参考文献

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