小鼠骨髓来源树突状细胞的制备及其使用Qdot纳米晶体的标记用于示踪研究

摘要

树突状细胞摄取抗原后迁移至免疫器官，将加工后的抗原呈递给T细胞。量子点纳米晶体标记可提供持久且稳定的荧光信号，从而可通过荧光显微镜追踪树突状细胞在不同器官中的分布。

摘要

树突状细胞（DC）是一类存在于外周组织以及胸腺、骨髓、脾脏、淋巴结和派尔集合淋巴结等免疫器官中的专业抗原呈递细胞（APC）^1-3。位于外周组织中的DC会持续监测机体是否存在抗原，并摄取、加工这些抗原，随后通过主要组织相容性复合物（MHC）分子将其呈递于细胞表面。随后，携带抗原的DC迁移至免疫器官，在那里将加工后的抗原呈递给T淋巴细胞，从而启动特异性免疫应答。评估DC迁移能力的方法之一是使用荧光染料对其进行标记⁴。

在此，我们演示使用Qdot荧光纳米晶体标记小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC）。该标记方法的优势在于，Qdot纳米晶体具有稳定且持久的荧光特性，非常适合在回收的组织中检测标记细胞。为实现这一目的，首先从小鼠骨髓中分离细胞，并在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子存在下培养8天，以诱导DC分化。随后，通过短期体外孵育，用荧光Qdot对这些细胞进行标记。标记后的细胞可用荧光显微镜观察。此时，细胞可直接注射至实验动物体内，或进一步诱导为成熟细胞。 体外 用炎症刺激物孵育。在我们的实验中，树突状细胞（DC）的成熟不会导致荧光信号的丢失，且Qdot染色不影响DC的生物学特性。注射后，通过典型的解剖和固定步骤，可在免疫器官中利用荧光显微镜识别这些细胞。

方案

1. 小鼠股骨和胫骨的解剖及骨髓细胞的培养

1. 通过 CO₂ 窒息法处死2只小鼠，并小心分离胫骨和股骨，避免切断骨端。
2. 用纸巾清除骨骼上附着的所有组织，注意不要折断骨骼。
3. 将骨骼置于35 mm培养皿中，浸入70%乙醇中消毒10分钟。自此步骤起，所有操作均需在生物安全柜内进行，以避免细胞培养污染。
4. 从乙醇中取出骨骼，置于生物安全柜内的培养皿中晾干5分钟。
5. 将股骨从中间切断，胫骨则在其最细的一端剪开。使用无菌注射器吸取1 ml RPMI培养基（不含血清但含抗生素），注入骨骼内部，操作在无菌培养皿中进行。
6. 收集细胞悬液，在4°C下，以1,100 RPM转速于冷冻离心机中使用摆桶转子，在15 ml离心管中离心10分钟，用RPMI培养基洗涤两次。
7. 最后一次洗涤后，将细胞重悬于2 ml ACK裂解缓冲液中，室温孵育5分钟，以去除红细胞。
8. 加入13 ml含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基，重悬细胞，并按照步骤1.6所述条件用该培养基洗涤两次。
9. 计数细胞，用含10% FBS的RPMI培养基调整细胞浓度至2 × 10⁵ 个细胞/ml，并加入rm-GM-CSF（终浓度20 ng/ml）⁵。
10. 将10 ml上述细胞悬液加入无菌、微生物级10 cm培养皿中，在CO₂ 培养箱（37°C，5% CO₂）中进行培养。

讨论

小鼠髓系树突状细胞（DCs）已被广泛用于评估基于DC的疫苗的有效性及优化方案；研究DC与T细胞的相互作用或DC的发育过程；以及确定其在多种疾病中的作用^9-11。本文中，我们展示了如何从小鼠胫骨和股骨骨髓中分离前体细胞并诱导生成树突状细胞。我们在不切断骨端的情况下取出骨骼，从而可通过将骨骼浸入70%乙醇中进行彻底消毒，降低污染风险。为了从骨髓细胞中诱导分化出树突状细胞，我们仅使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），方法如前所述⁵。尽管某些实验方案同时使用白细胞介素-4（IL-4），但已有报道指出，在高浓度GM-CSF条件下，该细胞因子并非必需¹²。事实上，我们此前已证实，此类树突状细胞能够诱导免疫应答¹³。此外，需注意在培养第8天时，仅收集轻度贴壁的细胞，通过培养皿加培养基轻轻冲洗获得，因为牢固贴壁的细胞更倾向于呈现单核细胞样表型。本文中我们展示了使用荧光量子点（Qdot）颗粒标记树突状细胞的方法。相比其他标记方法，该方法具有多项优势：第一，量子点颗粒易于被细胞摄取；第二，其荧光信号强，且不受树突状细胞成熟过程的影响；第三，与使用绿色荧光蛋白（GFP）标记DC不同，使用丙酮等有机溶剂对细胞或组织进行固定后，量子点的荧光信号不会丢失¹⁴，从而在选择染色方案时具有更高的灵活性；最后，由于其荧光信号强度高，即使存在组织自发荧光，仍可清晰观察到标记细胞。如前所述⁶，量子点染色不影响这些细胞的成熟能力。本文进一步证明，经量子点标记的树突状细胞与未标记细胞行为相似，在受到炎症刺激后，均可上调共刺激分子表达，并产生IL-6和一氧化氮。尽管树突状细胞是启动免疫应答的专业化细胞，但已有研究表明其也参与多种病理过程，如癌症和动脉粥样硬化^{4, 15, 16}。此外，树突状细胞还被认为参与血管生成过程^{17, 18}，甚至有研究提出其可能在结构上参与新血管的形成^{19, 20}。因此，能够实现体内追踪树突状细胞并确定其在不同组织中空间定位的方法具有重要价值^{4, 21, 22}。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6 小鼠	Jackson Laboratory		雌性，6-8 周龄
RPMI	Invitrogen	11875-119
胎牛血清，经鉴定合格	Invitrogen	10437-028
抗生素-抗真菌剂	Invitrogen	15240-096
PBS	Invitrogen	10010-049
ACK 裂解缓冲液	Lonza Inc.	10-548E
重组小鼠 GM-CSF	PeproTech Inc	315-03
Qtracker 655 细胞标记试剂盒	Invitrogen	Q25021MP
脂多糖	Invitrogen	tlrl-eblps
重组小鼠 TNF α	PeproTech Inc	315-01A
CD86 抗体	BD Biosciences	553691
CD40 抗体	BD Biosciences	553791
Griess 试剂系统	Promega Corp.	G2930
IL-6 捕获抗体	eBioscience	13-7061-81
IL-6 检测抗体	eBioscience	13-7062-81