本文介绍了一种利用等温滴定 calorimetry 监测具有中等结合亲和力的生物系统结合热力学的通用实验方案。
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摘要
摘要
等温滴定 calorimetry（ITC）是理解结合反应完整热力学图景的有用工具。在生物科学中，大分子相互作用对于理解细胞机制至关重要。实验条件（如缓冲液和温度）可根据所研究的特定结合系统进行优化。然而，由于需要特定的配体和大分子浓度范围才能获得有用的数据，因此需要仔细规划。为了获得可靠的结果，必须准确测定大分子和配体的浓度。在样品制备过程中也需格外小心，因为杂质可能显著影响实验结果。当正确地进行ITC实验及相应的对照实验时，可以获得诸如化学计量比、亲和力和焓变等有用的结合信息。通过在不同缓冲液或温度条件下进行额外实验，可获得关于该系统的更详细信息。本文提供了一个ITC实验基本设置的操作方案。
方案
等温滴定 calorimetry（ITC）是一种成熟的技术，可在一次实验中测定结合相互作用的所有热力学参数（亲和力、焓变和化学计量比）。1 ITC 通过在等温条件下将一种反应物滴定到另一种反应物中来实现。所测得的信号是两种反应物相互作用（结合）时释放或吸收的热量。进行一系列注射，随着限量反应物逐渐饱和，热信号将趋近于零。对等温曲线进行拟合即可获得热力学参数。已有多种综述文献详细描述了该仪器的构造以及数据采集与分析的数学原理。2,3 尽管市场上还存在其他类型的量热仪（最显著的是适用于小体积样品的 ITC200），但本文所述为 MicroCal（现属 GE Healthcare）生产的 VP-ITC 的通用实验方案。
1. 样品制备
- 为了在缓冲液中配制大分子和配体，需要解决一些潜在问题。准确的拟合结果依赖于大分子（通常置于ITC样品池中的组分）和配体（注射针筒中的组分）的适当浓度。由于某些蛋白质在注射针筒所需高浓度下易发生聚集，通常将蛋白质置于样品池中。最佳的大分子浓度由“c”值决定，c是系统预测结合亲和力（可通过ITC实验前的正交方法估算）与总大分子浓度的乘积，即c = Ka*[M]。c的最优范围为10–10001，尽管在特定实验条件下，即使c值低于下限，仍可能获得弱结合系统的准确数据4。因此，确定大分子浓度时需考虑该c值范围（例如，当Ka为106 M-1时，应使用10至1000 μM的大分子浓度）。预先了解系统的结合亲和力有助于通过优化ITC实验设计，减少ITC实验中蛋白质的使用量。配体浓度应足够高（至少为最弱结合位点Kd值的7–25倍），以确保在滴定的前三分之一至一半内达到饱和。准确的数据拟合还要求信号达到饱和。对于高亲和力系统，应使用较低的配体浓度，以避免滴定早期即发生饱和，否则会导致拟合结果不准确。在从滴定曲线中扣除稀释热对照（即配体滴定至缓冲液）后，饱和时的焓变应趋近于零。
- 由于小分子杂质可能在ITC测量中产生假信号，最好尽可能将大分子和配体在缓冲液中进行充分透析。或者，也可使用柱层析、脱盐离心柱或缓冲液置换离心滤膜（例如Centricons）来更换大分子的缓冲液。若配体为小分子，可在大分子透析后使用相同的透析缓冲液配制，或使用适用于小分子的截留分子量透析膜（例如Spectra/Por Float-A-Lyzer，截留分子量100–500 Da）进行透析。配体与大分子溶液之间缓冲液组成的差异可能导致样品中杂质稀释热引起的信号假象。配制完成后，应确保缓冲液、大分子和配体的pH值一致（±0.05 pH单位），以避免因缓冲液质子化效应引起的焓变假象5。务必准备足量的每种组分。对于三次重复实验及一次稀释对照，所需材料量取决于所用ITC仪器。但对于样品池体积约为2 ml的大多数ITC仪器，至少需要6–7 ml的大分子溶液，可方便地在15 ml离心管中配制。对于300 μL的注射针筒，1–2 ml溶液已足够，可在离心管或微量离心管中配制。
- 灰尘及其他颗粒物可能导致ITC热图基线出现假象。实验前必须将其去除。样品母液配制完成后，应将样品在微量离心管中以8000至14,000 RPM离心5分钟，使溶液中的颗粒沉淀。小心移取上清液，避免扰动沉淀，并将其转移至新的离心管或微量离心管中。
若需使用还原剂以维持半胱氨酸的还原状态，应使用低浓度且新鲜配制的β-巯基乙醇、TCEP（三(2-羧乙基)膦）或二硫苏糖醇，以尽量减少因还原剂氧化引起的假象。此外，缓冲液中存在有机溶剂（某些小分子配体为增加溶解度可能需添加甲醇或DMSO）也可能导致信号假象。若配体需使用有机溶剂，则大分子溶液中也必须含有相同浓度的有机溶剂，以避免因有机溶剂稀释热而产生信号。在样品配制过程中，配体与大分子之间可能因共溶剂、盐浓度或pH值存在微小差异。最好检测配体滴定至样品缓冲液，或样品缓冲液滴定至大分子溶液的情况，以确保缓冲液成分差异引起的热信号不会导致仅由假象产生的数据。 - 应使用适合您系统的分析方法（如吸光度测定、HPLC、比色法、蛋白质的BCA法等）仔细测定大分子和配体的浓度，记录其准确浓度。实际浓度与用于拟合等温曲线的浓度之间的差异将导致实验测定的化学计量比、焓变和结合亲和力出现误差。通常需对样品进行脱气处理，以避免因气泡或滴定过程中溶解气体释放引起的信号假象，尤其是在较高温度下。
2. 实验设置
- 在装载大分子和配体之前，务必根据制造商的协议清洗样品池和注射器。使用 Hamilton 注射器用 1.8 ml 蒸馏水冲洗样品池两到三次（操作 Hamilton 注射器时需小心，因其筒体易碎或针头易弯）。接着用 1.8 ml 缓冲液多次冲洗样品池。小心避免产生气泡，向样品池中加入 1.8 ml 大分子溶液。
- 用蒸馏水填充参比池。对于大多数缓冲液，使用蒸馏水作为参比溶液即可。然而，对于离子强度或渗透压特别高的缓冲液，最好使用缓冲液本身作为参比。
- 使用 Hamilton 注射器从参比池和样品池中去除气泡。轻轻将注射器针头沿池壁上下移动，使可能附着在池底部或孔壁上的气泡上升至池顶部。从样品池和参比池中移除任何多余的液体体积。
- 通过管路将塑料注射器连接到注射针的填充口。先用蒸馏水冲洗注射针，再用缓冲液冲洗。通过抽吸空气确保注射针完全排空。将注射针插入配体溶液中，吸入配体溶液直至整个注射器充满。继续多吸入少量过量液体（约 50 μl 或更多）进入端口及连接的管路中。立即关闭注射器的填充口，并断开管路和塑料注射器。再重复排空并重新填充注射器两次，以彻底去除其中的气泡。将注射器从配体溶液中取出，用无尘纸轻轻擦拭外壁以去除液滴，注意不要让注射器尖端接触无尘纸，以免损失液体体积。同时避免碰撞或震动注射器，以防液体从针尖漏出。将注射器放入样品池中。
- 设置等温滴定量热法（ITC）实验参数。对于具有强热信号的结合体系，采用大量低体积的注射可提供更多的拟合数据点（例如 75 次 3 μl 的注射）。对于热信号较弱的体系，则更宜采用少量大体积注射（例如 33 次 8 μl 的注射）。通常情况下，使用较少次数但较高注射体积的方式更为常见。可能需要进行多次滴定以优化适用于您体系的最佳条件。需要注意的是，结合焓可能是放热或吸热的，具体取决于所研究的体系。遗憾的是，某些体系热信号较弱，导致反应热难以测定。此类问题可通过提高大分子浓度、改变实验温度（取决于结合体系的热容）、和/或调节缓冲液的 pH 或离子强度来尝试解决。
- 还需考虑每次注射之间的时间间隔。每次配体注射后，必须给予体系足够时间达到平衡，并使热信号恢复至基线，方可进行下一次注射。对于大多数体系，三到五分钟通常足够。若体系平衡时间超过五分钟，则应延长注射间隔。
- 由于注射针插入样品池后，大分子与配体溶液在注射针内可能发生部分混合，第一次注射将产生不准确的结果。建议前一至两次注射使用较小体积（例如 2 μl），以便后续舍弃这些数据，而后续注射则保持所需设定体积。
- 选择实验温度（最常用为 25 °C，但也可使用 2 至 80 °C 范围内的温度）。最好选择与其他针对该配体-大分子体系开展的实验（如结合实验、动力学实验等）一致的温度。ITC 可设置为在与实验温度不同的条件下进行平衡。若实验温度与室温相差超过 10 °C，则建议将仪器平衡温度设定在实验温度 ±5 °C 范围内，以缩短仪器达到实验温度所需时间。
还需考虑注射器的搅拌速度。搅拌对于滴定过程中配体与大分子的充分混合是必要的，但某些蛋白质在高速搅拌下可能不稳定。在此类情况下，应将搅拌速度设为相对较低的水平。在所有实验参数设置完成后，即可开始实验。 - 实验结束后，应按照制造商的协议对 ITC 仪器进行清洗。若需对大分子-配体复合物混合液进行额外实验，可保留实验结束时样品池中的溶液。
- 至少重复滴定一至两次，以获得可重复的数据。运行一个对照实验，即将配体滴定至样品池中的缓冲液中，以测定配体的稀释热。对于存在协同结合的某些体系，通过将大分子滴定至配体中可获得有关结合过程的额外信息。不同的注射方向可提供补充信息，有助于全局拟合。6
3. 数据分析
- 数据拟合可使用任意数据拟合程序中的宏轻松完成（通常由仪器制造商随设备提供）。加载第一个数据文件，检查原始热图信号中是否存在气泡或其他伪影。若发现任何伪影（如基线上的尖峰或在未进行注射的时间点出现的峰），应记录这些数据点并予以剔除。接着加载配体稀释对照数据，并从结合等温线中减去配体稀释数据。此时应剔除所有异常数据点，包括滴定开始时因稀释伪影导致的前一两个数据点（参见步骤7）。
- 选择用于拟合数据的模型（如单结合位点、双/多结合位点、协同结合等）。可使用结合化学计量比（n）、焓变（ΔH）和结合亲和力（Ka）的初始估计值对数据进行拟合。若已有来自正交实验的结合亲和力或其他参数的先验知识，可输入这些值，以避免拟合过程中陷入局部最小值。完成首次滴定的数据拟合后，对剩余等温线重复步骤15和16。或者，可使用SEDPHAT等程序进行全局拟合6。SEDPHAT在同时拟合二元复合物数据集（即分子A+B）和三元复合物数据集（分子A+B+C）时尤为有用。例如，在分子C结合A-B复合物的过程中，可能难以确定是否存在C与A结合或B与A结合（若A未完全饱和）所产生的信号。
- 为确保ITC数据非人为伪影所致，应将ITC测得的结合亲和力和化学计量比与正交方法的结果进行比较7,8。此外，ITC测得的焓变值可与范特霍夫作图（van't Hoff plot）所得的焓变进行比对9。使用不同浓度的配体或大分子也有助于验证，因为热信号的绝对值应随大分子浓度的增加而增大。若样品池和注射器中的缓冲液不匹配，则最有可能产生伪影。样品不纯也是导致伪影的另一可能原因。
- 我们建议用户首先从已有Kd和化学计量比信息的简单二元复合物滴定实验入手。若存在额外配体结合的情况，用户可尝试更复杂的三元复合物滴定实验，调整配体浓度，甚至交换注射器与样品池中的组分。由于焓是状态函数，两条不同路径形成三元复合物的焓变值之和应具有加和性10。在此过程中，SEDPHAT6很可能发挥重要作用。
4. 代表性结果：
![等温滴定 calorimetry 数据；ΔP 随时间变化以及 ΔH 随 [NADPH]/[EcDHFR] 变化的图表及残差图。](/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg "figure-protocol-1")
图 1. NADPH 辅因子与大肠杆菌（E. coli）染色体二氢叶酸还原酶（ecDHFR）结合反应中表现良好的一次滴定实验的代表性示例。图（A）显示原始热谱图；（B）为使用 Origin 软件中单一位点模型拟合积分后热谱图所得的结合等温线；（C）为使用 SEDPHAT 软件中单结合位点模型对等温线进行拟合的结果及拟合残差。根据 Origin 软件采用单一位点结合模型分析，n = 1.09 ± 0.02，Kd = 0.194 ± 0.001 μM，ΔH = -22.7 ± 0.4 kcal/mol，TΔS = -13.1 ± 0.4 kcal/mol，ΔG = -9.16 ± 0.01 kcal/mol。使用 SEDPHAT 对数据进行拟合得到的 n 值为 0.94 ± 0.01，Kd 为 0.195 ± 0.013 μM，ΔH 为 -22.5 ± 0.2 kcal/mol，TΔS 为 -13.39 kcal/mol，ΔG 为 -9.15 kcal/mol。
讨论
等温滴定量热法（ITC）已广泛应用于配体与大分子相互作用的研究11，相关研究涵盖蛋白质-配体12、DNA-配体13以及RNA-大分子14的相互作用。ITC甚至可用于形成均匀悬浮液的固体材料，例如纳米颗粒15。此外，还可利用三元体系进行研究，即一种配体已结合于大分子上，再向体系中滴定第二种配体，从而测定例如底物与酶-辅因子系统结合过程的热力学参数7。对于结合亲和力极高的分子，常规ITC检测可能超出其检测限，此时可通过使用结合能力较弱的配体进行竞争性结合实验来获得相关信息16。同样，弱结合配体的信息也可通过竞争性实验获得17。ITC还可用于探究水在分子结合过程中的作用18，以及结合过程中焓变对溶剂重排的依赖性19。最近，已有研究利用ITC测定了DNAK变体在结合ADP和ATP时构象变化的热力学参数20。蛋白质-蛋白质相互作用也可通过ITC进行研究，获得有关异源复合物21以及同源缔合过程的信息22。通过在不同温度下进行结合实验，可获得结合过程的热容变化2。此外，通过在具有不同电离焓的缓冲液中开展实验，还可确定结合过程中吸收或释放的质子数5。若在不同pH值下开展额外的ITC实验，则有可能确定参与该过程的功能基团的pKa值23。
总之，精确测定大分子和配体的浓度对于获得良好的等温滴定量热（ITC）实验结果至关重要。样品浓度还需处于适当范围内，以获得可靠的数据。缓冲液的选择也需谨慎，小分子杂质和pH值不匹配会在热谱图中产生伪影。
致谢
本工作由美国国家科学基金会（NSF）资助，项目编号MCB-0817827。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 02-681-282 | |
| 15 mL Falcon 管 | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 2.5 mL Hamilton 注射器 | MicroCal | SYN161714 |
参考文献
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