טיטרציה Calorimetry מקורר באופן איזוטרמי עבור מדידת מקרומולקולה-ליגנד זיקה

Summary

פרוטוקול כללי לשימוש calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי לפקח על התרמודינמיקה מחייב עבור מערכות ביולוגיות עם זיקות מחייבות מתונה מוצג.

Abstract

Calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי (ITC) הוא כלי שימושי להבנת התמונה התרמודינמית מלאה של התגובה מחייב. בשנת למדעי הביולוגיה, אינטראקציות macromolecular חיוניים להבנת המנגנון של התא. תנאי הניסוי, כגון חיץ וטמפרטורה, ניתן להתאים את המערכת מחייב מסוים הנלמד. עם זאת, תכנון זהיר נדרש מאז ליגנד מסוים טווחי הריכוז מקרומולקולה נחוצים כדי להשיג מידע שימושי. ריכוזים של מקרומולקולה לבין ליגנד צורך לקבוע במדויק את תוצאות אמינות. טיפול גם צריך לקחת בעת הכנת הדגימות כמו זיהומים יכולים להשפיע משמעותית על הניסוי. כאשר ניסויים המרכז לטניס בישראל, יחד עם בקרות, מבוצעות כהלכה, מידע שימושי מחייב, כגון הזיקה stoichiometry ו אנתלפיה, מתקבלים. על ידי הפעלת ניסויים נוספים תחת חוצץ שונה או בתנאי טמפרטורה, מידע מפורט יותר ניתן לקבל על המערכת. פרוטוקול עבור ההתקנה הבסיסית של ניסוי המרכז לטניס בישראל הוא נתון.

Protocol

Calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי (ITC) היא טכניקה מבוססת היטב כי ניתן לקבוע את כל הפרמטרים התרמודינמיים (זיקה, אנתלפיה ו stoichiometry) של אינטראקציה מחייב בניסוי אחד. ITC 1 יצירות titrating one מגיב לתוך מגיב שנייה בתנאים מקורר באופן איזוטרמי. האות הנמדד הוא שוחרר חום או נספג על האינטראקציה (מחייב) של שני המגיבים. סדרה של זריקות מבוצעות ואת האות חום תתקרב לאפס כמו מגיב הגבלת הופך רווי. התאמת של האיזותרמה נותן את הפרמטרים התרמודינמיים. ביקורות קיימות מספר המתארים את המכשור, כמו גם את המתמטיקה של איסוף נתונים וניתוח. Calorimeters 2,3 בעוד אחרים זמינים (בעיקר המרכז לטניס בישראל 200 עם בנפחים קטנים), כאן אנו מתארים פרוטוקול כללי עבור VP-ITC מיוצרים על ידי MicroCal (כיום חלק של GE Healthcare). 1. הכנת דוגמאות על מנת להכין את מקרומולקולה ו ליגנד במאגר, כמה בעיות פוטנציאליות צורך לטפל. מתאים מדויק דורש ריכוז תקין של מקרומולקולה, את המין, כי בדרך כלל הולך בתא מדגם של המרכז לטניס בישראל, ואת ליגנד, מינים הזרקה במזרק. משום חלבונים מסוימים מצטברים על ריכוזים גבוהים הדרושים מינים המזרק הזרקה, לרוב החלבון הוא נטען לתוך התא המדגם. ריכוז אופטימלי מקרומולקולה נקבעת "c", תוצר של זיקה החזוי של המערכת, אשר ניתן להעריך באמצעות שיטות אורתוגונליים לפני השימוש המרכז לטניס בישראל, ואת ריכוז מקרומולקולה הכולל, כאשר c = K * [ז]. ערכים אופטימליים של מגוון ג 1-10, 1 אם כי ניתן לקבל נתונים מדויקים על חלשים מחייבים מערכות תחת תנאים ניסויים ספציפיים עם c-ערכים מתחת לגבול התחתון. 4 לכן, ריכוז מקרומולקולה צריכה להיקבע עם מגוון זה של ג הערכים בראש (כלומר, עבור K של 10 6 מ -1, ריכוזי מקרומולקולה של 1-10 מיקרומטר אמור לשמש). ידע מוקדם של הזיקה מחייב של המערכת יכול למזער את החלבון משמש המרכז לטניס בישראל באמצעות תכנון טוב יותר של הניסוי המרכז לטניס בישראל. ריכוז ליגנד צריך להיות גדול מספיק (7-25 לקפל מרוכז יותר d K עבור אתר ליגנד החלשה מחייב), כך רוויה המתרחשת בתוך השליש הראשון למחצית טיטרציה. התאמה מדויקת של הנתונים מחייב גם הרוויה של האות. עבור מערכות עם זיקה מחייבת יותר, ריכוז ליגנד התחתון אמור לשמש כדי למנוע הרוויה מוקדם מדי טיטרציה, אשר ייתן מתאים מדויק. לאחר החום של שליטה בדילול (כלומר טיטרציה של ליגנד למאגר) כבר מופחתים טיטרציה, את אנתלפיה על הרוויה צריך גישה אפס. בגלל זיהומים מולקולה קטנה יכול להצמיח אותות artifactual את המדידות ITC, עדיף, אם אפשר, כי מקרומולקולה ו ליגנד להיות dialyzed ממצה נגד המאגר. לחלופין, כרומטוגרפיה בעמודה, desalting עמודות ספין, או בולם מסננים חילופי צנטריפוגלי (לדוגמה, Centricons) ניתן להשתמש כדי לשנות את החיץ של מקרומולקולה. אם ליגנד היא מולקולה כימית קטנה, זה יכול להיות מוכן באמצעות חיץ דיאליזה לאחר מקרומולקולה כבר dialyzed או dialyzing נגד קרום דיאליזה עם הפסקות מתאים מולקולות קטנות (כלומר 100-500 דה במשך ספקטרה / por Float-A-Lyzer ). ההבדלים בהרכב חיץ בין ליגנד ופתרונות מקרומולקולה יכול להוביל אות חפצים מהחום של דילול של זיהומים בדגימות. לאחר הכנה, ודא ה-pH של המשחק, מאגר מקרומולקולה ו ליגנד (± 0.05 יחידות pH) כמו חפצים אנתלפיה יכול להתעורר עקב תופעות חיץ protonation. 5 הקפידו להכין מספיק של כל מין. עבור ניסויים בשלושה עותקים ו שליטה בדילול, את כמות החומר הדרוש יהיה תלוי ITC בשימוש. אבל, עבור מכשירים ITC ביותר שיש משוער 2 מ"ל נפח תאים המדגם, לפחות 6-7 מ"ל של תמיסת מקרומולקולה יהיה צורך, ויכול להיות מוכן בנוחות צינורות 15 מ"ל בז. במשך 300 מזרקים הזרקת μL, 1-2 מ"ל של הפתרון צריך להיות הולם, אפשר להכין גם בז צינורות או צינורות microcentrifuge. אבק וחלקיקים אחרים, יכולים לגרום חפצים הבסיס של thermogram המרכז לטניס בישראל. זה הכרחי כי הם יוסרו לפני להפעיל את הניסוי. לאחר הכנה של פתרונות מניות המדגם, דגימות צריך להיות centrifuged צינורות microcentrifuge למשך חמש דקות בשעה 8000 עד 14,000 סל"ד לחלקיקים גלולה בפתרון. הסר את supernatant, נזהר לא להפריע גלולה, ולמקם אותו בצינור חדש בז / microcentrifuge. אם reductants יש צורך לשמור על cysteines מופחת, להשתמש בריכוז נמוך ומניות טריים של β-merca, ptoethanol TCEP (טריס (2-carboxyl) phosphine) או dithiothreitol כדי למזער את כל החפצים עקב חמצון reductant. כמו כן, נוכחותם של ממיסים אורגניים במאגר (משותף לכמה ligands מולקולה קטנה כי ייתכן שיהיה צורך מתנול או DMSO כדי להיות מסיסים) עלולה לגרום חפצים האות. אם ממיסים אורגניים הדרושים ליגנד, אז הפתרון מקרומולקולה חייבים להכיל גם את ריכוז זהה להימנע מכל אות הנובעות מחום דילול של ממיס אורגני. הבדלים קלים בהרכב חיץ בין ליגנד ו מקרומולקולה בשל cosolvents, מלחים או pH אפשריים במהלך הכנת הדגימות. מומלץ לבדוק את הדילול של ליגנד לתוך המאגר מדגם או החיץ מדגם לתוך מקרומולקולה על מנת להבטיח כי אותות חום הנובעים מהבדלים תוכן החיץ לא לגרום נתונים הנובעים אך ורק מן הממצאים. בדוק את ריכוזי מקרומולקולה לבין ליגנד בזהירות באמצעות טכניקות מתאימות למערכת שלך (כגון מדידות ספיגת, HPLC, מבחני colorimetric, מבחני BCA עבור חלבונים, וכו ') כדי להקליט הריכוזים המדויקים שלהם. הבדלים בריכוז בפועל את הריכוז משמש כדי להתאים האיזותרמה יגרום שגיאות stoichiometry, אנתלפיה ועל זיקה מחייבת נקבע מהניסוי. מקובל דגה את הדגימות, כדי למנוע artifacts אות עקב בועות אוויר או שחרור של גזים מומסים במהלך טיטרציה, במיוחד בטמפרטורות גבוהות. 2. הגדרת ניסוי ודא כי התא מדגם מזרק זריקה מנקים פי פרוטוקול של היצרן לפני טעינת מקרומולקולה ו ליגנד. יש לשטוף את התא מדגם פעמיים או שלוש פעמים עם 1.8 מ"ל מים מזוקקים באמצעות מזרק המילטון (להשתמש בזהירות עם המזרק המילטון כמו חבית נשבר בקלות או כפוף מחט). לאחר מכן לשטוף את התא מדגם מספר פעמים עם 1.8 מ"ל של המאגר. טען את תא דגימה עם 1.8 מ"ל של תמיסת מקרומולקולה, להיות זהיר, כדי למנוע היווצרות בועה. מלאו את תא התייחסות עם מים מזוקקים. עבור רוב מאגרים, מים מזוקקים זה בסדר להשתמש כפתרון התייחסות. עם זאת, מאגרים עם עוצמות יוניים גבוהים במיוחד או osmolality, עדיף להשתמש חיץ כנקודת התייחסות. הסר בועות אוויר מתאי התייחסות מדגם באמצעות מזרק המילטון. בעדינות להזיז את המחט של המזרק ו-up-בצדדים של התא לדפוק כל הבועות שעשויים להיות בחלק התחתון של התא מחוברת היטב לחלק העליון של התא. הסר את כל נפח העולה מן המדגם ותאי הפניה. צרף מזרק פלסטיק לנמל המילוי של המזרק הזרקה באמצעות צינור. יש לשטוף את המזרק עם הזרקת מים מזוקקים. פעל על ידי חיץ לשטוף. ודא מזרק זריקה הוא פונה לחלוטין על ידי ציור האוויר דרך המערכת. מניחים את המחט של המזרק זריקה לתוך הפתרון ליגנד ולצייר את הפתרון ליגנד לתוך המזרק להזרקת עד מזרק שלם מלא. המשך ציור נפח עודף קטן (כ 50 μl או יותר) ליציאת צינורות מחוברים. מיד לסגור את נמל המילוי של המזרק ולנתק את המזרק צינורות פלסטיק. טהר ולמלא את המזרק להזרקת עוד פעמיים כדי להסיר בועות מן המזרק. הסר את המזרק מפתרון ליגנד ולנגב את הצד עם kimwipe כדי להסיר כל הטיפות, נזהר שלא לגעת קצה המזרק kimwipe כמו זה עשוי להסיר נפח מ המזרק. כמו כן, להיזהר לא לדפוק או בצנצנת את המזרק כמו זה גם יכול לגרום לאובדן נפח מקצה המזרק. הנח את המזרק הזרקה לתוך התא המדגם. הגדרת פרמטרים להפעלת המרכז לטניס בישראל. עבור מערכות מחייב עם אותות חום חזק, מספר רב של זריקות בנפח נמוך ייתן נקודות נתונים יותר מתאים (למשל 75 זריקות של μl 3). עבור מערכות בעלות אותות חום חלש, מספר קטן של זריקות נפח גדול עדיפים (למשל 33 זריקות של μl 8). הנפוץ ביותר, זריקות פחות עם כרכים הזרקה גבוהה משמשים. זה עלול לקחת כמה titrations כדי לייעל את התנאים הטובים ביותר עבור המערכת שלך. חשוב לציין כי אנתלפיה מחייב יכול להיות אקסותרמית או אנדותרמית, בהתאם למערכת הנלמד. למרבה הצער, כמה מערכות יש אותות חום נמוך, מה שהופך את החום של תגובה קשה לקבוע. בעיות עם מערכות כאלה עלולה להתגבר על ידי הגברת הריכוז של מקרומולקולה, לשנות את הטמפרטורה של הניסוי (בהתאם קיבולת החום של המערכת מחייב), ו / או לשנות את ה-pH או חוזק יוני של המאגר. שקול גם את המרווח זמן בין כל הזרקה. זה הכרחי כי לאחר כל הזרקה של ליגנד, המערכת ניתנת הזמן לאזן את האות חום חוזר הבסיס לפני הזריקה הבאה מתרחשת. עבור רוב המערכות, 04:57 minutes צריך להיות הולם. זמן בין זריקות צריך להיות מוגבר מערכות שבהן איזון אינה מתרחשת בתוך חמש דקות. כי יהיו כמה ערבוב בין מקרומולקולה ופתרונות ליגנד בתוך המזרק זריקה פעם זה מוכנס לתוך התא המדגם, את הזריקה הראשונה תהיה לתת תוצאות מזויף. עדיף להשתמש בדיסקים קטנים (למשל 2 μl) עבור אחת או שתיים זריקות הראשון (כדי שיוכלו אחר כך להיות מושלך) ולשמור את הזריקות הבאות על הערכים הרצויים. בחרו את הטמפרטורה של הניסוי (עם 25 מעלות צלזיוס להיות הנפוץ ביותר, למרות הטמפרטורות בין 2 ל 80 ° C יכול לשמש). עדיף לבחור טמפרטורה שמתאימה ניסויים אחרים (קשירה, קינטיקה וכו ') שבוצעו על מערכת ליגנד-מקרומולקולה. המרכז לטניס בישראל ניתן להגדיר לאזן בטמפרטורה שונה מן הטמפרטורה של הניסוי. אם הניסוי עומד להתבצע בטמפרטורה מעל 10 מעלות צלזיוס הרחק בטמפרטורת החדר, אז עדיף להגדיר את איזון הטמפרטורה של המכשיר בתוך 5 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של הניסוי. זה יקטין את זמן המכשיר ייקח להגיע לטמפרטורה של הניסוי. המהירות ערבוב של המזרק גם צריך להיחשב. ערבוב הוא הכרחי עבור ערבוב נאותה ליגנד ו מקרומולקולה במהלך טיטרציה, אבל כמה חלבונים ערער על ידי בחישה מהירה. במקרים כאלה, מהירות ערבוב צריך להיות מוגדר בשיעור נמוך יחסית. ברגע שכל הפרמטרים של הניסוי הוקמו, אזי ניתן להתחיל בניסוי. לאחר הניסוי סיימה, המרכז לטניס בישראל ניתן לנקות על פי פרוטוקול של היצרן. הפתרון בתא מדגם בסוף הניסוי יכולים להישמר אם ניסויים נוספים על תערובת מקרומולקולה-ליגנד מורכבות הרצוי. חזור על titrations לפחות אחד או שניים יותר פעמים כדי לקבל נתונים לשחזור. הפעל שליטה בו ליגנד הוא טיטרציה למאגר בתא המדגם כדי לקבוע את החום של דילול עבור ליגנד. עבור כמה מערכות שבהן יש מידע שיתופית מחייב, נוסף על התהליך מחייב ניתן להשיג על ידי הזרקת מקרומולקולה לתוך ליגנד. אוריינטציות הזרקה שונים יכולים לתת מידע נוסף, אשר עשוי להיות מועיל עבור הולם העולמי. 6 3. ניתוח נתונים התאמה של הנתונים יכול להתבצע בקלות באמצעות פקודות מאקרו בכל תוכנית נתונים מתאים (מסופק בדרך כלל על ידי היצרן, יחד עם המכשיר). טען את קובץ הנתונים הראשון. בדוק את thermogram גלם סימני בועות אוויר או חפצים אחרים האות. אם קיימים חפצים (כגון דוקרנים הבסיס או פסגות כאשר אין הזרקה בנקודת הזמן), ואז לציין נקודות אלה הנתונים כפי שהם להסירו. בשלב הבא, לטעון את דילול ליגנד נתונים שליטה, להפחית את דילול ליגנד נתונים האיזותרמה מחייב. בשלב זה, להסיר את כל נקודות הנתונים מזויף, כולל אחד או שניים נקודות נתונים הראשונה של טיטרציה שבו חפצים דילול להתרחש (עיין צעד 7). בחר את מודל הנתונים הולם (אחד האתר מחייב, שני / אתרי הקישור מרובים, מחייב שיתוף פעולה, וכו ') כדי לשמש כדי להתאים את הנתונים. הנתונים יכולים להיות מתאימים עם ניחושים הראשונית של פרמטרים מתאימים, stoichiometry (n), אנתלפיה (ΔH) ו זיקה מחייבת (K). אם ידע מוקדם הזיקה מחייב, או פרמטרים אחרים, ידוע מניסויים אורתוגונליים, אז הערכים הללו ניתן להזין. זה עוזר להימנע מתאים להיות לכודים ומינימום מקומיים במהלך הולם. לאחר הנתונים כבר מתאים טיטרציה הראשון, חזור על שלבים 15 ו – 16 למשך שארית איזותרמות. לחלופין, את הנתונים ניתן להתאים באופן גלובלי באמצעות תוכניות כגון SEDPHAT. 6 SEDPHAT עשוי להיות מועיל במיוחד ראוי גלובלית של ערכות נתונים מורכבים בינארי (כלומר, מולקולות A + B) בשילוב עם ערכות נתונים מורכבים משולשת (מולקולות A + B + C). כך, למשל, מחייב C מולקולה מורכבת AB, זה לא תמיד ברור אם ייתכן שיש כל אות עקב המחייב של C ל-A או B ל-A (אם לא רווים לגמרי). על מנת להבטיח כי הנתונים אינם artifactual המרכז לטניס בישראל, הזיקה מחייב stoichiometries המתקבל המרכז לטניס בישראל צריך להיות לעומת שיטת אורתוגונליים. 7,8 בנוסף, ערך אנתלפיה ITC ניתן להשוות אנתלפיה מן העלילה van't הוף. 9 זה גם יכול להועיל להשתמש ריכוזים שונים של ליגנד או מקרומולקולה את הערך המוחלט של האות חום צריך להגדיל עם ריכוז מקרומולקולה גוברת. החפצים הם הסיכוי הטוב ביותר להתעורר אם מאגרים בתא מזרק אינם מתאימים. אפשרות נוספת עבור חפצים עולה ממדגמים טמא. אנו ממליצים להתחיל עם המשתמש הפשוט titrations מורכבות בינארי שבו יש מידע זמין על הקודם K ד ו stoichiometry. ואז, אם ligands נוספים לאגד, המשתמש יכול לנסות יותר מסובך מורכב titrations משולשת, שינוי ריכוזי ליגנד, ואולי החלפת מזרק מרכיבי התא. השוואה בין enthalpies הן נתיבים להיווצרות משולשת מורכבת צריך להיות תוסף כמו אנתלפיה היא פונקציה של המדינה. 10 שוב, SEDPHAT 6 צפוי להיות שימושי למדי כאן. 4. נציג תוצאות: באיור 1. דוגמה מייצגת של טיטרציה מחונך עבור הכריכה של NADPH cofactor כדי E. coli כרומוזומליות dihydrofolate רדוקטאז (ecDHFR). לוח (א) מראה את thermogram גלם; (ב), האיזותרמה מחייב מ להתאים את thermogram משולב באמצעות מודל אחד אתר בתוכנה מקור, ו (ג) את ההתאמה של האיזותרמה באמצעות מודל אתר אחד מחייב מ SEDPHAT יחד עם שאריות לנכון. מתוך התוכנה מקור, באמצעות מודל אתר אחד מחייב, n = 1.09 ± 0.02, K d = 0.194 ± 0.001 מיקרומטר, ΔH = -22.7 ± 0.4 קלוריות / mol, TΔS = -13.1 ± 0.4 קלוריות / mol, ואת ΔG = – 9.16 ± 0.01 kcal / mol. מתאים של הנתונים באמצעות Sedphat להרשות n של 0.94 ± 0.01, ד K של 0.195 ± 0.013 ΔM, ΔH של -22.5 ± 0.2 kcal / mol, TΔS של -13.39 קלוריות / mol ΔG של קלוריות ו -9.15 / mol.

Discussion

המרכז לטניס בישראל כבר נעשה שימוש נרחב בחקר אינטראקציות ליגנד מקרומולקולה, עם ¹¹ מחקרים מסתכל ליגנד חלבון, ¹² ליגנד-DNA ^ו-RNA-13 מקרומולקולה ¹⁴ מחקרים. המרכז לטניס בישראל יכול להיות אפילו לרוץ עם חומרים מוצקים, כגון חלקיקים, כי הטופס השעיות אחיד. ¹⁵ יתר על כן, מערכות משולשת, שבו ליגנד קשור כבר מקרומולקולה לבין ליגנד השני הוא טיטרציה, יכול לשמש כדי לקבוע את התרמודינמיקה של, עבור למשל, מחייב המצע מערכת אנזימים cofactor. ⁷ מחקרים יכול להיות גם ביצע עבור מולקולות עם זיקות מחייבות גבוהה מאוד שבדרך כלל עולה על גבול הגילוי של המרכז לטניס בישראל על ידי ביצוע מבחני התחרות מחייב עם ligands מחייב החלשות. ¹⁶ מידע על הכריכה חלושות ligands ניתן גם להשיג על ידי מבחני התחרות. ¹⁷ תפקיד המים מחייב יכול להיחקר על ידי המרכז לטניס בישראל, ¹⁸ יחד עם התלות של אנתלפיה על ארגון מחדש ממס. ¹⁹ לאחרונה, תרמודינמיקה של שינוי קונפורמציה של וריאנטים DNAK נמדדו על הכריכה של ADP ו – ATP. ²⁰ חלבונים העמותה ניתן ללמוד על ידי המרכז לטניס בישראל, מניב מידע על מתחמי הטרו ^21, כמו גם על הומו אסוציאציה. ²² השפעות טמפרטורה על אנתלפיה מחייב ייתן את קיבולת החום של האירוע מחייבות. ² מספר פרוטונים נספג או שוחרר על הכריכה יכול להיות גם נקבע מניסויים שבוצעו עם enthalpies מאגרים שונים של יינון. ⁵ אם ITC מחקרים נוספים נעשים על ערכי pH שונים, אז PKA של הקבוצה מעורבת עלולה להיות נחוש. ²³

לסיכום, מדידות מדויקות של ריכוז מקרומולקולה לבין ליגנד הם הכרח עבור ניסוי ITC טוב. ריכוזים לדוגמה גם צריך להיות בטווח הנכון כדי לקבל נתונים מהימנים. יש להקפיד עם למאגר כמו זיהומים מולקולה קטנה אי התאמות pH תגרום חפצים thermogram.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
1.7 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-681-282
15 mL falcon tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
2.5 mL Hamilton syringe	MicroCal	SYN161714