Cajal间质细胞（ICC）是胃肠道（GI）的起搏细胞。它们在平滑肌细胞与节后神经纤维之间形成复杂的网络，以调节胃肠道的收缩性。本文介绍了用于横截面及全层标本观察小鼠ICC网络的免疫荧光方法。
本文内容
摘要
摘要
Cajal间质细胞（ICC）是源自间充质的胃肠道（GI）道“起搏细胞”，可产生蠕动所必需的自发慢波，并介导来自肠神经系统1的神经输入。不同亚型的ICC在胃肠道肌层中形成独特的网络结构2,3。这些网络的缺失或损伤与多种运动功能障碍相关4。ICC细胞在质膜上表达KIT受体酪氨酸激酶，过去15年来，KIT免疫染色已被用于标记ICC网络5,6。重要的是，正常的KIT活性是ICC发育所必需的5,6。ICC细胞的肿瘤性转化可导致胃肠道间质瘤（GIST），该肿瘤常携带KIT基因的功能获得性突变7,8。我们近期研究表明，ETV1是在ICC/GIST细胞谱系中特异性表达的谱系依赖性存活因子，是调控正常ICC网络形成及GIST肿瘤发生的关键转录调控因子9。我们进一步证实，ETV1在肿瘤发生过程中与激活型KIT突变协同作用。本文中，我们描述了在小鼠中可视化ICC网络的方法，主要基于先前发表的实验方案10,11。最近，氯离子通道anoctamin 1（ANO1）也被鉴定为ICC特异性的膜标志物11,12。由于这两种蛋白均定位于质膜，因此可通过免疫荧光技术用于可视化ICC网络。本文中，我们介绍了通过固定冷冻切片和全层组织制备方法对ICC网络进行可视化观察的技术。
方案
1. 小鼠胃肠道的解剖
- 根据当地IUCAC指南实施小鼠安乐死
- 将小鼠四肢固定于泡沫板表面，用70%乙醇冲洗腹部表面。从膈肌至耻骨沿中线作长切口打开腹腔。在远端食管处和远端大肠处各作一切口，将从胃至肛门的整个胃肠道组织整块取出，使用小剪刀小心剪断十二指肠和盲肠处的韧带。将胃肠道组织置于含PBS的培养皿中。用镊子剥离肠系膜组织（见图1）。为分离胃、小肠和大肠，分别在幽门和回盲交界处进行切割。使用连接喂养针头（老年小鼠）或钝头针（年轻小鼠）的5 ml注射器，以PBS冲洗胃肠道各段的管腔。
- 沿肠系膜缘切开胃、小肠和大肠。为每段胃肠道各取两份组织样本，一份用于全层组织成像，另一份用于冷冻切片。
2. 全组织样本制备与免疫染色
- 将消化道各部分的完整组织放入装有1.0 ml冰冻丙酮的1.5 cm微量离心管中，在4°C下固定至少1小时。样品可在-20°C下保存最多1周。我们通常将样品保存在丙酮中，随后进行冷冻切片制备。
- 用PBS洗涤样品2次。将样品置于含PBS的培养皿中，在解剖显微镜下用镊子夹住一端，用解剖刀小心刮除黏膜层，保留肌层。
- 肌层可切成5 mm大小的组织块，用于不同抗体的染色。染色前在PBS中保存不得超过2天。
- 封闭和孵育步骤可在24孔板的一个孔或1.5 ml微量离心管中进行。加入0.5 ml封闭液（含5%山羊血清、0.1% Triton X-100的PBS），在4°C孵育1小时进行封闭。
- 将一抗用封闭液稀释后加入，于4°C旋转孵育过夜。我们已成功使用ACK-2鼠抗Kit抗体、兔抗Ano1抗体以及兔抗Pgp9.5抗体进行全组织免疫荧光染色。
- 在室温下于旋转摇床上用PBS洗涤5分钟，重复2次。
- 将二抗用封闭液稀释后加入，在室温下旋转孵育2小时。我们通常使用Alexa Fluor 488标记的抗兔抗体和Alexa Fluor 594标记的抗鼠抗体。
- 在室温下于旋转摇床上用PBS洗涤15分钟，重复3次。
- 将组织置于载玻片上，浆膜面朝上，以确保显微镜观察时组织方向正确。此朝向可确保浆膜面紧贴盖玻片，并在显微镜聚焦时首先被观察到。我们通常在解剖显微镜下完成此操作。有时会短暂使用荧光显微镜观察组织以准确判断方向：在荧光显微镜下观察Kit或Ano1时，从盖玻片一侧开始聚焦，应首先看到肌间神经丛中的ICC-MY网络。随后尽可能吸除PBS，注意避免组织完全干燥。加入50 μl硬封片剂（我们使用Prolong Gold），轻轻将盖玻片覆盖于组织上。室温下静置过夜使其固化，之后将载玻片存于-80°C。
- 进行显微观察时，我们使用配备Z轴驱动装置的宽场显微镜，选用20X空气物镜（NA 0.75，平场复消色差）或60X油镜（NA 1.4，平场复消色差），采集2 μm或1 μm的Z轴连续光学切片，覆盖整个肌层。随后使用Autoquant去卷积软件对图像进行去卷积处理。此外，也有许多研究者采用共聚焦显微镜获得类似结果。
3. 冷冻切片制备与免疫染色
- 将消化道各部分组织浆膜面朝下平铺于滤纸上，沿组织边缘剪裁滤纸。将带有组织的滤纸置于含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液中（我们使用前将密封小瓶中的32%多聚甲醛稀释至PBS中），室温固定2小时。根据组织大小，固定可在6孔或12孔板中进行，也可在1.5 ml离心管中完成。若使用孔板，需用封口膜密封以减少PFA挥发。过长的固定时间可能导致抗原遮蔽，特别是对于ACK-2抗Kit抗体。
- 取出组织，转移至含30%蔗糖的PBS溶液中，4 °C条件下静置过夜，直至组织沉底。
- 将组织用30%蔗糖与O.C.T.包埋剂按1:1比例平衡1小时。随后将组织垂直包埋于充满O.C.T.的冷冻模具中，消化道的长轴应与冷冻切片方向平行。在比较不同基因型或不同处理的小鼠时，可将来自不同小鼠的组织共同包埋于同一模具中，以确保后续处理条件一致。在干冰上速冻后，置于-80 °C冰箱中保存。
- 将10 μm冷冻切片切至载玻片上，并存于-80 °C冰箱中。通常每张载玻片切取两个切片。我们通常会对其中一张切片进行H&E染色。
- 进行免疫荧光染色时，首先将载玻片在室温下平衡15分钟，然后使用PAP笔在组织周围画圈。
- 加入150 μl封闭液（与整体免疫染色所用封闭液相同），室温封闭1小时。
- 吸除封闭液，加入150 μl用封闭液稀释的一抗溶液，在湿盒中4 °C孵育过夜。
- 用PBS洗涤2次，每次5分钟。
- 加入用封闭液稀释的二抗溶液，室温孵育2小时。我们通常使用Alexa 488标记的抗兔抗体和Alexa 594标记的抗大鼠抗体。
- 用PBS洗涤3次，每次15分钟。
- 吸除洗涤液时注意避免组织完全干燥。滴加一滴含DAPI的硬封片剂（我们使用Prolong Gold），盖上#1.5盖玻片。室温放置过夜固化后，存于-80 °C冰箱中。
- 使用DAPI、FITC和Texas Red滤光片组合采集三色荧光图像。
4. 代表性结果：
此处以大肠为例。用于免疫荧光的蔗糖保护固定冷冻切片的苏木精-伊红（H&E）染色结果显示，与石蜡切片参考样本相比存在一些人工假象（图2），其中黄线标示环形肌层与纵行肌层之间的肌间神经丛，绿线标示黏膜层与肌层之间的边界。观察冰冻切片时，从浆膜到黏膜方向，首先遇到较薄的纵行肌（LM）层，随后是较厚的环形肌（CM）层。切片应与纵行肌平行，因此LM的细胞核应呈一定程度的拉长状，而CM的细胞核则应较小且呈圆形。在LM与CM之间分布着由Pgp9.5染色阳性的神经元构成的肌间神经丛。Pgp9.5还可标记贯穿CM层的神经元突起。肌间Cajal间质细胞网络（ICC-MY）围绕肌间神经丛分布，由多极性细胞组成。在纵行肌层内，存在稀少的肌内Cajal间质细胞（ICC-IMs），其为双极细胞，与肌纤维平行排列。在环形肌层内，则存在丰富的ICC-IMs，同样为双极细胞，沿环形肌平行走行，在此切面中呈横切状态。在肌层与黏膜下层交界处，黏膜下Cajal间质细胞网络（由ICC-SMPs组成）表现为由多极ICC构成的扁平网络。观察大肠全层组织Kit免疫染色样本时，当从盖玻片方向逐步调焦，应首先观察到ICC-MY网络，随后依次为CM层内的ICC-IM以及ICC-SMP网络（图3）。已有文献描述通过全层组织图像的三维重建对ICC网络进行体积测量的方法10。使用宽场显微镜成像时，原始图像中存在明显的离焦荧光背景，经去卷积处理后可有效去除（图3）。若黏膜去除不完全，将导致较高的背景荧光。ANO1是ICC的另一标志物，KIT与ANO1的共免疫染色显示两者在ICC上的染色完全重叠（图4）。
图1. 典型的小鼠胃肠道解剖图，经许可转载13。
图2. A) 小鼠大肠冰冻切片（按所述方法制备）与参考石蜡包埋切片的代表性H&E染色结果，显示冰冻切片存在一定程度的收缩伪影。黄色线条标示肌间神经丛，蓝色线条分隔黏膜层与肌层。B) 小鼠大肠组织中Kit（红色，ACK-2）和Pgp9.5（绿色）的代表性双重免疫荧光染色，DAPI（蓝色）复染。LM：纵行肌；CM：环形肌。比例尺：20 μm。
图3. 同一视野在三个不同焦平面的Kit（红色，ACK-2）全组织免疫荧光代表性图像：位于LM/CM边界的ICC-MY平面、CM内的ICC-IM平面以及CM/黏膜下层边界的ICC-SMP平面。同时展示原始图像与去卷积处理后的图像。比例尺为20 μm。
图4. 大肠中Ano1（绿色）与Kit（红色，ACK-2）的代表性双重免疫荧光染色图像。比例尺为20 μm。
讨论
Cajal间质细胞最初由Santiago Ramón y Cajal在一个世纪前利用亚甲蓝和铬酸银染色法对胃肠道肌层进行研究时首次描述。Cajal最初认为这些Cajal间质细胞（ICC）是神经元，因为它们具有类似轴突和树突的突起结构。在随后的多年中，由于缺乏特异性标记物，对ICC生物学的研究一直受到限制，直到发现KIT不仅在ICC中表达，而且对其发育至关重要6。自此以后，KIT免疫荧光技术被广泛应用于ICC生物学的研究，并促使人们认识到ICC也存在于其他收缩性器官中，例如膀胱。最近，ANO1被确定为第二个可靠的Cajal间质细胞标记物。
在过去15年中，已有大量研究采用免疫荧光技术，结合不同的固定和封片方法来鉴定ICC。在我们的实验中，与冰冻切片后使用丙酮或甲醛进行后固定的方案相比，预先用多聚甲醛和蔗糖保护处理的“固定-冷冻”冰冻切片效果最佳。对于整体封片样本，我们发现先用丙酮固定，再进行黏膜解剖，可获得最理想的结果。
传统上，ACK-2 一直是用于小鼠 ICC 鉴定的首选 Kit 抗体。它是一种识别细胞外结构域的大鼠单克隆抗体，同时也是一种阻断性抗体，在给予活体小鼠后可引起肠梗阻。然而，ACK-2 的表位会随着多聚甲醛固定的进行而逐渐被破坏，且无法通过标准的抗原修复方法恢复。我们发现，ACK-4 的表位对多聚甲醛固定的耐受性更强。与固定后的冷冻组织块及切片相比，石蜡包埋的组织块及切片能更好地保存形态结构，也更便于长期存档（图 4）。迄今为止，ACK-2 和 ACK-4 均未能在石蜡切片中成功应用。我们已证实，D13A2（一种新型兔单克隆抗体）在胃肠道的固定冷冻切片和石蜡切片中均表现出优异的染色效果。
Kit 在多种其他细胞类型中均有表达，包括黑色素细胞、造血细胞、生殖细胞，尤其是胃肠道中也存在的肥大细胞。幸运的是，大多数肥大细胞位于黏膜层，而非肌层。使用兔抗 Ano1 抗体和大鼠抗 Kit 抗体进行双重染色，可消除每种抗体的非特异性染色（图 4）。还需注意的是，不同亚类的 ICC 之间 Kit 和 Ano1 的相对表达水平似乎存在差异。例如，在小肠中，与深层肌丛 ICC 相比，肌间 ICC 的 Kit 染色明显更强，而 Ano1 染色强度则相近。
致谢
本工作由美国国家癌症研究所（K08CA140946，资助Y.C.）、（5F32CA130372，资助P.C.）、（R01CA102774 和 R01HL055748，资助P.B.）、美国国防部（PC094302，资助Y.C.）、Shuman家族GIST研究基金（资助P.C.）以及Starr癌症联盟（资助P.C.、Y.C.、C.L.S.和P.B.）提供支持。我们感谢MSKCC分子细胞学核心设施的Katia Manova、Ning Fan和Mesurh Turkekul在冷冻切片和免疫染色方面提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠抗 Kit 抗体（克隆 ACK-2） | eBioscience | 14-1172 | 使用浓度为 2μg/ml。过度固定会导致表位丢失。 |
| 大鼠抗 Kit 抗体（克隆 ACK-4） | Cedarlane Labs | CL8936AP | 使用浓度为 2μg/ml。 |
| 兔抗 KIT 抗体（克隆 D13A2） | Cell Signaling Technology | 3074 | 使用稀释比例为 1:100。本表中唯一在石蜡切片中效果良好的抗体。 |
| 兔抗 Pgp9.5 抗体 | Abcam | ab10404 | 标记神经元细胞质。可用于标记肌间神经丛的神经元。使用稀释比例为 1:1000。 |
| 兔抗 Ano1 抗体 | Abcam | ab53212 | 使用浓度为 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 山羊抗大鼠 IgG | Invitrogen | A-11007 | 使用浓度为 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG | Invitrogen | A-11008 | 使用浓度为 2μg/ml |
| 动物喂食针头 | Fisher Scientific | 01-208-87 | 硅胶尖端针头，适用于冲洗成年小鼠的胃肠道 |
| 钝头针头 | BD Biosciences | 305180 | 钝头针头，适用于冲洗断奶前幼鼠的胃肠道 |
| 含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P-36931 | 可使用其他含 DAPI 的硬固化封片介质替代 |
| Tissue-Tek 冷冻模具 | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% 多聚甲醛（10 ml 密封安瓿瓶） | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 打开密封安瓿瓶后，使用前稀释至 4% |
| 封闭缓冲液 | 含 5% 山羊血清和 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液 |
参考文献
- Sanders, K. M. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).
- Ward, S. M., Sanders, K. M. Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).
- Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. J Physiol. 576, 653-658 (2006).
- Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. Development and plasticity of interstitial cells of Cajal. Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).
- Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. J Physiol. 480, 91-97 (1994).
- Huizinga, J. D. W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, 347-349 (1995).
- Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet. 369, 1731-1741 (2007).
- Hirota, S. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science. 279, 577-580 (1998).
- Chi, P. ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST). Nature. , Forthcoming (2010).
- Kwon, J. G. Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors. Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).
- Hwang, S. J. Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles. J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).
- Gomez-Pinilla, P. J. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).
- Sommer, G. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).
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