用于卵巢和输卵管三维器官培养的海藻酸盐水凝胶

摘要

在三维环境中培养正常细胞是研究细胞转化和肿瘤发生早期事件的替代方法。该方法用于培养正常的卵巢和输卵管细胞，以研究卵巢癌形成过程中的早期事件。

摘要

卵巢癌是女性癌症死亡的第五大原因，在美国的死亡率为63%¹。目前尚不清楚卵巢癌的起源细胞类型，可能是卵巢表面上皮（OSE），也可能是输卵管伞部的远端上皮^2,3。将正常细胞在体外进行原代培养，可使科学家建立特定变化的模型，从而明确导致卵巢癌发生的特定上皮细胞类型，最终确定其起源细胞类型。这将有助于开发更精确的生物标志物、具有组织特异性基因改变的动物模型，以及针对该疾病的更有效的预防策略。

将正常细胞维持在海藻酸盐水凝胶中，可促进细胞在三维环境下的短期体外培养，并允许导入质粒DNA、siRNA和小分子。通过使用手术刀进行有策略的切割，将器官切成小块进行培养，可从单个器官获得多个培养样本，从而增加单只动物可开展的实验数量。这些切口可模拟排卵过程中的某些特征，引发卵巢表面上皮（OSE）增殖，而该过程与卵巢癌的形成相关。对于在塑料表面不易生长的细胞类型（例如OSE），本方法尤为适用，有助于研究正常细胞活动或癌症发生的最初事件⁴。

海藻酸盐水凝胶可用于支持多种类型组织的生长⁵。海藻酸盐是一种线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸的重复单元组成，可通过钙离子交联，产生温和的凝胶化作用，不会损伤组织^6,7。与其他三维细胞培养基质（如Matrigel）类似，海藻酸盐为组织提供机械支撑；然而，蛋白质不与海藻酸盐基质发生反应，因此海藻酸盐可作为合成的细胞外基质，不启动细胞信号传导⁵。海藻酸盐水凝胶可在标准细胞培养基中漂浮，并支持组织在体外的结构生长in vitro。

本文介绍了一种将卵巢和输卵管器官组织制备、分离并包埋于海藻酸盐水凝胶中的方法，该器官培养物可维持培养长达两周。同时描述了通过酶解法释放细胞，以分析器官培养物中的蛋白质和RNA样品。最后，该方法无需基因永生化即可实现小鼠原代细胞类型的生长，使研究人员能够使用基因敲除小鼠和转基因小鼠进行研究。

方案

1. 卵巢解剖与组织分离

1. 制备0.5% (w/v)的海藻酸钠溶液，采用先前描述的方案⁵进行改良，使用无菌PBS并加热至37°C。通过倒置或摇动混合，切勿涡旋。用25 G针头将海藻酸钠吸入1 ml注射器中，并保持在37°C。
2. 制备10 mM无菌CaCl₂溶液，用于组织包封过程中海藻酸钠的交联，并预热至37°C。
3. 每项实验在24孔板中每孔准备1 mL培养基（αMEM + 5单位青霉素和5 μg/mL链霉素）。在培养基中加入各种药物、多肽或病毒。若需在器官包封前进行转染，将组织与Lipofectamine 2000和质粒DNA在37°C下孵育4小时。
4. 从动物体内解剖出器官，去除所有脂肪或残留组织，轻轻剥离包裹卵巢的囊膜，并通过将器官纵向切开的方式将卵巢或输卵管切成四部分。动物通过CO₂窒息安乐死后，再行颈椎脱位。对于输卵管，先用镊子轻轻拉开连接膜，并将管状结构两端向相反方向拉伸，再进行切割。
5. 将单滴海藻酸钠溶液（约1–3 μL）滴加至灭菌的网格纤维上。
6. 使用无菌镊子将一块器官组织移入海藻酸钠液滴中，并用镊子或无菌针头将组织置于液滴中央。
7. 用无菌镊子夹住网格纤维，将含有组织块（类器官）的液滴翻转，使其倒置，利用重力使海藻酸钠形成悬滴。
8. 将镊子轻敲于含有10 mM CaCl₂溶液的10 cm....

讨论

利用海藻酸盐水凝胶开发三维器官培养系统，是一种用于分析多种生物来源的不同组织类型的通用方法。三维培养的应用可扩展至组织工程学和再生医学领域，因为它为细胞生长提供了支架结构¹¹。目前，我们实验室正在开展使用人卵巢和输卵管组织的初步研究；然而，已有文献报道对人和非人灵长类动物卵泡的培养方法^12,13。

使用海藻酸盐水凝胶培养类器官相较于其他类型的水凝胶（如含有胶原蛋白、纤维蛋白或透明质酸的水凝胶）具有多项优势。海藻酸盐在室温和中性pH条件下即可形成凝胶，因而在包埋类器官时对组织造成的干扰极小¹⁴。海藻酸盐不与细胞蛋白发生反应，为组织生长提供了化学惰性的支撑环境⁵。该凝胶可通过海藻酸盐裂解酶进行酶促降解，而该酶不会破坏被包埋的组织，从而可实现培养细胞的回收¹⁵。海藻酸盐水凝胶用于三维组织培养的一个缺点是，其通过离子交联提供的机械支撑会随时间推移而逐渐失去稳定性，因此需要限制培养时间，并在固定前对海藻酸盐重新交联⁵。本实验方案的关键环节包括在整个培养过程中维.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leibovitz L-15 培养基	GIBCO, by Life Technologies	11415
αMEM 培养基	GIBCO, by Life Technologies	12000-022
海藻酸钠	NovaMatrix
二甲胂酸钠	Sigma-Aldrich	C0250
聚丙烯网状纤维	McMaster-Carr		45" 宽卷；0.0041" 孔径
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
青霉素/链霉素	GIBCO, by Life Technologies	15070-063
海藻酸酶	Sigma-Aldrich	A1603
A1603	Sigma-Aldrich	C9697	来源于 Clostridium histolyticum
牛血清白蛋白	MP Biomedicals	103700
胎牛血清	GIBCO, by Life Technologies	Gibco
ITS 溶液	Roche Group	11074547001	胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠
细胞角蛋白 8 抗体	发育研究杂交瘤库	TROMA-1	使用稀释比例为 1:200
DAPI	Vector Laboratories	H1200
溴脱氧尿苷	Sigma-Aldrich	B50002-1G	终浓度为 10 μM