本文描述了一种评估钩端螺旋体蛋白表面暴露的高效方法。该方法专门设计用于避免破坏钩端螺旋体细胞脆弱的外膜。该技术需要使用多个阴性对照，以评估外膜的完整性及抗体反应的特异性。
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摘要
摘要
细菌表面蛋白参与与宿主细胞的直接接触，并从环境中摄取营养物质1。因此，细胞定位可为细菌蛋白的功能作用提供线索。细菌蛋白的表面定位是鉴定参与致病机制的毒力因子的关键步骤。
钩端螺旋体膜的分馏方法2-5可能对某一类外膜蛋白（OMPs）具有选择性，例如脂蛋白与跨膜OMPs之间的区分，因此可能导致错误分类。这可能是由于结构差异以及它们与外膜结合方式的不同所致。脂蛋白通过其N端脂质部分（三个脂肪酸）与脂双层中的磷脂之间的疏水相互作用与膜结合6, 7。相比之下，跨膜OMPs通常通过呈桶状结构排列的两亲性β-折叠片整合到脂双层中8, 9。此外，某种蛋白存在于外膜中并不一定意味着该蛋白或其结构域暴露于细胞表面。已知螺旋体的外膜较为脆弱，因此需要采用温和的细胞操作方法，并加入亚表面蛋白对照，以评估外膜的完整性。
本文介绍一种免疫荧光检测法（IFA），用于直接评估完整钩端螺旋体表面蛋白的暴露情况。该方法基于抗原特异性抗体对钩端螺旋体表面蛋白的识别。此处，在抗体结合天然、暴露于表面的表位后，检测针对OmpL5410的特异性抗体。通过比较抗体对完整细胞与透化细胞的反应性，可评估蛋白的细胞分布情况，并判断其是否选择性地存在于钩端螺旋体表面。应使用针对一种或多种位于周质空间的亚表面蛋白的抗体来评估外膜的完整性。
表面IFA方法可用于分析任何可用特异性抗体检测的钩端螺旋体蛋白的表面暴露情况。该方法的有效性与局限性取决于所用抗体是否能够结合天然表位。由于抗体通常针对重组蛋白制备，可能无法识别天然、表面暴露蛋白的表位。尽管如此，表面IFA方法仍是研究完整细菌表面组分的有力工具。该方法不仅适用于钩端螺旋体，也可用于其他螺旋体及革兰氏阴性细菌。对于外膜蛋白（OMPs）表面暴露情况的更可靠结论，建议采用包括多种细胞定位方法在内的综合策略10。
方案
1. 固定 钩端螺旋体 到玻璃载玻片
- 钩端螺旋体（Leptospira interrogans）属于生物安全二级（BSL2）病原体。操作活细胞时需采取适当的防护措施，例如佩戴手套、穿上实验服，并在生物安全柜中进行移液操作。
- 将钩端螺旋体在EMJH培养基中培养，添加1%兔血清，在30°C条件下培养约6天，直至进入对数中期至对数后期（细胞密度为5 × 107 至 5 × 108 个细胞/mL）。
- 在室温下以约2000 × g离心7分钟，收集菌体。
- 通过抽吸去除上清液，并用含5 mM MgCl2的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）轻柔重悬菌体沉淀，调整终浓度为5 × 108 个细胞/mL。
- 将1 mL细胞悬液加入双孔玻片的每个孔中，在30°C孵育80分钟，使细胞贴附于玻片表面。
- 小心抽吸去除含有未贴附细胞的液体。
- 向每孔加入1 mL含2%多聚甲醛的PBS-5 mM MgCl2溶液，固定残留的完整细菌，在30°C孵育40分钟。这些玻片用于检测表面暴露的蛋白质。
- 对于检测亚表面蛋白的对照玻片，使用1 mL/孔的预冷无水甲醇（-20°C）固定并通透外膜，在-20°C孵育20分钟。甲醇具有多重作用：可通透外膜、使蛋白质变性，并将细胞固定于玻片上。
- 通过抽吸去除固定剂。
2. 使用特异性抗体进行标记
- 通过每孔加入 1 ml 封闭缓冲液（Difco Leptospira Enrichment EMJH）来封闭非特异性结合。在 30°C 下孵育 90 分钟。
- 将特异性抗体（免疫兔血清或小鼠单克隆抗体，此处为针对 OmpL5410、FlaA112 和 OmpL113 的多克隆兔血清）以及作为阴性对照使用的前免疫兔血清或不含抗体的小鼠腹水液，用封闭缓冲液稀释。每种抗体的稀释比例需根据抗体效价、抗原-抗体反应性以及细胞中蛋白的丰度通过实验确定。通常的稀释范围为 1:50 至 1:600。
- 吸去封闭缓冲液，每孔加入 1 ml 稀释后的初级抗体。
- 在 30°C 下孵育 1 小时。
- 吸去液体，用 PBS 洗涤各孔三次（每孔 1 ml）。
3. 钩端螺旋体的可视化
- 在封闭缓冲液中加入Alexa Fluor 488标记的二抗（山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG），按1:2000稀释，并加入荧光核酸染料4’6-二脒基-2-苯基-吲哚二盐酸盐（DAPI），使其终浓度为0.25 μg/ml，每孔加入1 ml。此步骤分别用于检测抗体结合情况以及不依赖抗体结合的所有螺旋体的存在。
- 将载玻片在30°C下孵育45分钟。
- 通过抽吸去除液体，并用PBS洗涤两次，再用蒸馏水洗涤一次（每孔1 ml）。
- 从玻璃载玻片上移除反应腔和粘性条带，在空气中干燥约10分钟。
- 加入ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂（每张载玻片2 × 20 μl），并加盖24 × 50 mm的盖玻片。
- 在室温避光条件下孵育过夜。此步骤是为使封片剂充分固化（硬化）所必需的。
- 用指甲油密封盖玻片边缘。
- 使用荧光显微镜观察染色结果，DAPI采用青蓝色检测滤光片，Alexa Fluor 488采用绿色检测滤光片。为确保准确反映样本情况，需对每个样本的整个反应腔区域进行评估。
- 通过成像记录每个样本的代表性视野数据。在采集Alexa Fluor 488荧光图像时，所有样本应使用相同的曝光时间。保持一致的曝光时间有助于更准确地比较测试抗原组与对照组之间的结果。
4. 代表性结果：
使用针对表面和亚表面蛋白的抗体对问号钩端螺旋体细胞进行表面免疫荧光分析（IFA）的结果示例如图2所示。当在完整钩端螺旋体样本中检测到目标蛋白存在显著荧光信号，且该蛋白为表面暴露蛋白时，判定为阳性结果（图2A）。通常情况下，在阳性实验中（此处为表面暴露的OmpL54），完整细胞与透化细胞中的荧光强度大致相同（图2A）。必须设置外膜完整性阴性对照，使用针对亚表面蛋白（最好是周质蛋白）的抗体（例如钩端螺旋体FlaA1，图2B）。只有当实验数据显示外膜在整个实验过程中保持完整时——即针对亚表面蛋白的抗体不与完整细胞发生反应（无荧光或荧光信号明显弱于透化样本，如图2B所示）——才能得出目标蛋白位于表面的结论。此外，使用前免疫血清（针对多克隆抗体情况）作为额外的阴性对照实验，对于获得明确的数据至关重要，其在完整或透化细胞中均不应产生显著荧光信号（图2A，2C）。当结果为阴性（未观察到Alexa Fluor 488荧光）时，必须使用DAPI染色以可视化钩端螺旋体。使用碘化丙啶进行复染是DAPI的一种可接受替代方案。
该方法属于定性而非定量分析，因为荧光信号较强可能是由于单个抗原中存在多个暴露于表面的抗原表位被识别，而其他丰度相当但表面暴露表位较少的抗原则信号较弱。因此，荧光强度仅可用于比较同一抗体在不同条件下的反应性，例如完整细胞与透化细胞之间的比较，而不能用于不同蛋白质之间荧光强度的比较。当获得模糊结果时，这一区别尤为重要，例如在完整细胞中观察到的荧光显著弱于透化细胞时（图2C）。此类结果可能表明：目标蛋白位于细胞亚表面位置（完整细胞存在一定程度的非特异性背景染色），或抗体优先结合经甲醇透化后暴露的非天然构象表位，或该蛋白具有多个定位位点——正如另一种螺旋体Borrelia burgdorferi14的Erp和Elp蛋白所描述的情况。无论哪种情况，此类模糊的IFA结果均需采用其他方法进一步验证，例如细胞表面生物素标记或表面蛋白酶解实验，以确定目标蛋白是否真正暴露于细胞表面10。
图 1. 钩端螺旋体表面免疫荧光检测流程图。首先，将 1 ml 细胞悬液加入多孔载玻片的每孔中（每次实验至少使用两张双孔载玻片），使钩端螺旋体贴壁，进行孵育。接着，通过向具有完整外膜（OM）的样本每孔加入 1 ml 的 2% 甲醛（PFA），或向外膜已通透化的样本每孔加入 1 ml 的 100% 冷甲醇，将钩端螺旋体固定于载玻片上。随后，加入识别表面暴露蛋白的抗体以及针对胞内蛋白的对照抗体（一抗），在 30°C 下孵育 90 分钟。然后，通过每孔加入 1 ml Alexa Fluor 488 标记的二抗孵育，检测一抗的结合情况。最后，通过荧光显微镜观察细胞。
图 2. 钩端螺旋体蛋白的表面免疫荧光分析。采用免疫血清和前免疫血清对问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）螺旋体进行探测，并以DAPI复染阴性结果，以显示螺旋体的存在。使用绿色荧光滤光片检测Alexa Fluor 488标记的二抗与表面暴露蛋白的结合，使用蓝色/青色荧光滤光片检测DAPI与细胞DNA的结合。A) 使用识别表面暴露蛋白OmpL5410的抗体探测钩端螺旋体。B) 使用针对周质层下蛋白FlaA1的抗体探测细胞（阴性对照）。C) 使用针对钩端螺旋体孔蛋白OmpL1的抗体探测细胞。兔血清与钩端螺旋体的结合通过Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG片段进行检测。所有图像均在曝光4秒后采集。
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讨论
我们的表面免疫荧光检测（IFA）技术类似于用于证明多种伯氏螺旋体15, 16和钩端螺旋体12, 17蛋白表面暴露的方法。本文所述表面IFA方法的细节经过优化，旨在尽量减少对细胞的操作，以维持外膜完整性，同时利用钩端螺旋体细胞易于黏附于玻璃载片的特性。该方法采用较低浓度的多聚甲醛（2% vs 4%），使用可稳定外膜的缓冲液（PBS + 5 mM MgCl2）进行洗涤，并且洗涤步骤少于先前发表的方案12, 17。此外，我们的表面IFA方法强调了对照实验的重要性，这些对照对于准确解读数据至关重要。该方法的一个局限性在于，需要有能够识别目标蛋白表面暴露表位的特异性抗体。在某些情况下，其他表面蛋白或脂多糖可能造成空间位阻，从而阻碍抗体与抗原的结合。尽管如此，表面IFA方法是一种相对简便的技术，可用于直接评估蛋白的表面暴露情况，既可单独使用，也可与其他技术（如免疫金标记、表面蛋白酶解等）联合应用。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由美国国家过敏与传染病研究所的公共卫生服务基金资助项目 AI-34431（资助 D.A.H.）以及退伍军人事务部医学研究基金（资助 D.A.H.）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 双孔玻片 | Lab-Tek | 177380 | |
| 兔血清 | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira 增菌培养基 EMJH | BD Biosciences | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG (H+L) | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) | Invitrogen | A-11029 | |
| 4’6-二脒基-2-苯基-吲哚二盐酸盐 (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | 使用前平衡至室温 |
| Fisherfinest Premium 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-544-14 | |
| 荧光显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop 40 |
参考文献
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