一种用于半厚脑切片高分辨率荧光成像的快速方法

摘要

本文介绍一种快速、简便的方法，用于在半厚脑切片中对荧光标记的细胞进行成像。通过固定、切片并进行光学透明化处理脑组织，我们描述了如何利用标准的落射荧光或共聚焦成像技术，在完整的神经组织中观察单个细胞及神经元网络。

摘要

基础神经科学和临床神经科学的一个基本目标是更深入地理解正常和病变脑组织中神经元的身份特征、分子构成及其连接模式。为此，人们已投入大量努力来构建高分辨率的神经解剖图谱^1-3。随着分子遗传学的发展以及光学显微镜技术的进步，研究者不仅能够探究神经元的形态，还能分析单个神经元及其相关神经网络的分子与细胞组成⁴。近年来，转基因技术和基因靶向技术在啮齿类动物中的广泛应用，使研究者能够随意“编程”特定的神经元亚群^5-6。可以说，对现代神经科学影响最为深远的贡献之一，便是从海洋无脊椎动物中发现并克隆出编码荧光蛋白（FPs）的基因^7-8，以及随后通过工程化改造，不断扩展可用于活体示踪的报告工具箱⁹。如今，利用细胞类型特异性的启动子活性，驱动荧光蛋白在特定神经元群体中的靶向表达，使得神经解剖学研究达到了基因水平的精确度。

在神经元中构建荧光蛋白（FP）的表达已极大促进了我们对脑结构与功能的理解。然而，对深部脑组织或三维空间中单个神经元及其相关神经网络进行成像仍是一项挑战。由于脂质含量较高，神经组织较为不透明，并具有自发荧光特性。这些固有的生物物理特性使得利用标准的落射荧光显微镜或共聚焦显微镜在数十微米以上的深度难以实现对荧光标记神经元的高分辨率可视化与成像。为克服这一难题，研究人员常采用连续薄层切片成像与重建方法¹⁰，或双光子激光扫描显微技术¹¹。目前这些方法的局限性分别为组织制备过程劳动强度大，或所需仪器成本过高。

在此，我们介绍一种相对快速且简便的方法，通过光学透明化与成像技术，在固定的半厚小鼠脑切片中可视化荧光标记的细胞。在附带的实验方案中，我们描述了以下方法：1）固定脑组织 原位 通过心脏灌注，2）完整脑组织的解剖与取出，3）利用琼脂糖对脑组织进行固定包埋，4）使用新型振动切片机进行精密半厚切片制备，5）通过甘油梯度透明化脑组织，以及6）将组织切片置于载玻片上用于光学显微镜观察和z轴层扫重建（图1).

为了制备脑切片，我们采用了一种相对较新的仪器，称为“Compresstome” VF-200（http://www.precisionary.com/products_vf200.html）。该仪器是一种半自动切片机，配备有电机驱动的进样装置和刀片振动系统，其功能与其他振动切片机相似。与传统的振动切片机不同，待切组织被包埋在琼脂糖凝胶中，并置于不锈钢圆筒内进行固定。组织从圆筒中以设定的厚度被推出，并由向前移动并振动的刀片进行切割。琼脂糖凝胶插件与圆筒系统可实现组织安装的可重复性、精确对齐以及高精度切片。在我们的实际操作中，“Compresstome”能够制备出适用于电生理学、免疫组织化学以及直接固定组织贴片与成像的高质量组织切片。结合光学透明化技术，本文展示了用于高分辨率荧光成像的半厚固定脑切片的制备方法。

方案

1. 原位 脑组织固定

*准备一支10 ml注射器（28号针头），内含磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
*准备一支10 ml注射器（28号针头），内含溶于PBS的4%多聚甲醛（PFA）。另预留5–10 ml PFA/PBS用于灌注后固定。

1. 向实验小鼠腹腔内注射致死剂量的 Avertin 或 Nembutal。
2. 待小鼠麻醉后，用乙醇润湿腹部，并使用解剖针将小鼠固定在铺有软木、石蜡或硅胶弹性体的托盘底部。腹部朝上，将四肢尽可能向外展开并固定在表面。
3. 用镊子在胸骨水平夹住皮肤，横向剪开以暴露肝脏。向两侧剪开，再沿肋骨和膈肌向上剪开。移除肋骨组织瓣，继续剪切直至暴露心脏。
4. 刺破或剪开右心房以排出循环血液。
5. 通过左心室灌注 PBS，冲洗循环系统中残留的血液。
6. 利用同一针孔，通过左心室继续灌注 PBS/PFA，对整只小鼠进行固定。

2. 解剖与脑组织提取

1. 围绕耳道和眼眶进行切割，然后将头、颈和颅骨的皮肤向前剥离，以暴露颅骨。
   *参见图2，了解步骤2.2)至2.5)的示意图
2. 使用骨剪从眼眶经鼻甲骨横向剪开，两侧均需操作。横切位置应位于眼睛和嗅球前方。
3. 从每侧耳道沿纵向剪至眼眶。
4. 使用小型解剖剪，从一侧耳道到另一侧耳道，纵向剪开覆盖小脑的枕骨骨板。
5. 用同一把解剖剪，沿中线向前剪至嗅球水平。
6. 用镊子将各骨板从脑组织上小心移除，注意清除所有结缔组织，以便在抬起骨板时脑组织保持完整。
7. 剪断视神经和脑神经，切断上部颈椎椎骨，并将脑组织取出置于固定液中。
8. 在4°C下后固定1–2小时，随后用PBS洗涤3次，每次15分钟。

3. 琼脂糖包埋

1. 在微波炉中将 2% 高强度、低凝胶点琼脂糖 I-B 型（Sigma 目录号：A0576）溶于 PBS 盐溶液中。
2. 将熔化的琼脂糖转移至试管中，将试管置于温育箱或水浴中（40°–41° C）直至温度平衡。
3. 用氰基丙烯酸酯胶水将固定好的脑组织粘附在样本注射器推杆的末端（图 3A）。在脑组织表面涂布一层饱和蔗糖-PBS 溶液，以利于后续将琼脂糖环从脑切片中释放出来。
4. 将带有脑组织的推杆插入推杆套管内（图 3B）。
5. 用移液器或倾倒方式将温热的琼脂糖注入推杆套管中，完全覆盖脑组织。注意避免在琼脂糖中混入气泡，气泡会影响切片质量。
6. 用低温（0° 至 -25° C）冷却块夹住样本注射器，冷却 1 分钟，使琼脂糖凝固（图 3C）。

4. 使用 Compresstome 对脑切片进行切片

1. 将含有脑组织的样本注射器组装到切片机（Compresstome）中（图 3D）。
2. 将剃须刀片的边缘紧贴样本注射器的出口处（图 3E）。
3. 用 PBS 溶液注满缓冲液储罐。
4. 将千分尺向前旋转一个切片厚度，以将琼脂糖-脑组织块从样本注射器中推出。
5. 按下切片机控制单元上的“开始”按钮，启动切片过程。
6. 重复步骤 4.4）至 4.5），直至获得所需厚度的切片。
7. 用毛刷或移液器将脑切片转移至盛有 PBS 的小管或染色孔板中（图 3F）。

5. 光学透明化

1. 配制体积比为75%的甘油:PBS溶液。
2. 倒出（或用移液器吸出）收集的脑切片中PBS洗涤液的一半体积。
3. 用等体积的甘油/PBS溶液补回已移除的液体。
4. 在4°C下轻轻混匀，使组织切片充分平衡，直至切片下沉。
5. 重复步骤6.2)至6.4)，直至甘油终浓度达到75%。
6. 更换为含90%甘油的PBS溶液，并使其充分平衡。
   *注意：添加甘油溶液时需避免引入气泡。应缓慢倾倒并轻柔混匀，因为气泡会影响组织均匀平衡，并会在后续载玻片封片过程中造成干扰。

6. 用于成像的切片封片

1. 将双面密封胶带（SA-S-1L，Grace Bio-Labs）裁剪成一个开口矩形，使其适配载玻片（Superfrost Plus，25 × 75 × 1 mm，货号 # 48311-703，VWR）的可视区域，胶带边缘宽度为 2–3 mm。
2. 使用移液器或画笔将脑切片置于胶带矩形中心位置，并轻轻抽吸去除多余甘油。
3. 用画笔将脑切片按所需顺序在载玻片上排列整齐。
4. 小心地将盖玻片（24 × 60 mm，货号 # 48383-139，VWR）缓缓放下，覆盖在胶带上，注意避免产生气泡。轻轻按压盖玻片，确保其与胶带充分接触。
5. 从载玻片与盖玻片之间的边缘处抽吸去除多余的甘油。
6. 使用透明指甲油对载玻片和盖玻片进行封片。
7. 成像前让其自然干燥，或长期存放在载玻片盒中，置于 4°C 条件下保存。

7. 代表性结果：

对荧光标记的脑组织进行处理、成像和分析已成为神经生物学研究中不可或缺的技术。许多此类研究需要复杂的遗传操作，以在特定的神经元亚群中实现报告基因的表达，随后进行低分辨率和高分辨率的图像分析。然而，实验和技术上的限制常常使得无法从同一只动物快速获取这类数据。制备光学透明化、半厚的脑切片用于荧光成像，有助于应对这一挑战。在图4和图5中分别展示了利用基因改造的狂犬病毒（表达EGFP）标记的完整厚脑切片，并通过落射荧光显微镜和共聚焦显微镜成像的示例。落射荧光成像使用的是Leica M205 FA，共聚焦图像采集使用的是Zeiss LSM 510。由于本方案操作相对简便，该方法可在不到一天的时间内从表达荧光报告基因的组织中获得有价值的图像数据，且适用于低分辨率和高分辨率的光学显微镜观察。

如果研究者选择加入额外的死后标记方法、免疫组织化学染色或制作更薄的切片，该方案所需时间将相应延长。然而，上述方法代表了一种简单且相对高通量的策略，可用于在完整脑组织中筛选活体报告基因的表达模式。

图1. 半厚脑切片固定、解剖、切片、透明化及封片操作流程示意图。

图2. 提取完整小鼠脑组织的连续切割步骤示意图。

图3. 使用Compresstome安装和切片脑组织的步骤。A）使用超级胶水将脑组织放置到切割冲头上。B）将安装好的脑组织拉入冲头中以进行琼脂糖包埋。C）使用冷却压缩块固化琼脂糖脑塞。D）将琼脂糖脑塞和冲头插入Compresstome切割室。E）将剃刀刀片与冲头装置对齐。F）在Compresstome缓冲室中切割并收集脑切片。

图4. 经甘油透明化处理的小鼠前额皮层厚切片的光学显微图像，该组织表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。A）小鼠脑冠状切片（厚度200 µm），通过病毒载体标记表达EGFP，并使用落射荧光体视显微镜在低分辨率下成像。比例尺，2 mm。

图5. 透明化厚脑切片中荧光标记的第5/6层皮层神经元的高倍放大图像。A) 对（图4）中标注区域进行最大强度投影Z堆栈（厚度150 µm）的高分辨率共聚焦图像。比例尺，25 µm。

讨论

鉴于利用荧光蛋白标记神经元亚群并通过光学显微镜进行研究已得到广泛应用，快速筛选、成像和分析完整脑组织中的神经网络变得极为重要。

随着用户友好的病毒载体、体内电穿孔技术以及基因修饰小鼠品系的不断发展，如今研究人员可以获得几乎无限的标记细胞类型用于研究。然而，完整脑组织的图像分析仍然是实验中的一个瓶颈。本文所述方法已被证明在我们常规分析表达荧光报告基因的脑组织时极为有价值。该方法显著缩短了脑切片组织制备与分析所需的时间，适用于低倍率和高分辨率荧光成像，可与免疫细胞化学联合使用，可推广至其他实验动物模型，并且重要的是，适用于那些可能无法获得多光子成像设备的常规实验室环境。但需要注意的是，甘油及其他水性和有机溶液的光学透明化方法在实际应用中存在局限性。本文中我们描述了使用甘油辅助透明厚度达200 µm脑切片的方法。尽管该方法在改善厚度不超过200 µm组织的成像分辨率方面效果良好，但我们未观察到超过此厚度时有进一步改善。其他有机溶剂虽能实现更深层次的组织透明，但总会伴随着荧光信号的损失（或提取）问题。

上述方法的可能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
骨用剪刀	F.S.T.	16044-10	-或同类产品
解剖剪刀	F.S.T.	14084-08	-或同类产品
I-B型琼脂糖	Sigma-Aldrich	A0576
Compresstome	Precisionary Instruments	VF-200	-其他振动切片机亦可兼容
双面粘合剂	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L
Superfrost Plus 载玻片	VWR international	48311-703
盖玻片	VWR international	48383-139
甘油	EMD Millipore	GX0185-6	-或同类产品