一种用于半厚脑切片高分辨率荧光成像的快速方法

摘要

本文介绍一种快速、简便的方法，用于在半厚脑切片中对荧光标记的细胞进行成像。通过固定、切片并进行光学透明化处理脑组织，我们描述了如何利用标准的落射荧光或共聚焦成像技术，在完整的神经组织中观察单个细胞及神经元网络。

摘要

基础神经科学和临床神经科学的一个基本目标是更深入地理解正常和病变脑组织中神经元的身份特征、分子构成及其连接模式。为此，人们已投入大量努力来构建高分辨率的神经解剖图谱^1-3。随着分子遗传学的发展以及光学显微镜技术的进步，研究者不仅能够探究神经元的形态，还能分析单个神经元及其相关神经网络的分子与细胞组成⁴。近年来，转基因技术和基因靶向技术在啮齿类动物中的广泛应用，使研究者能够随意“编程”特定的神经元亚群^5-6。可以说，对现代神经科学影响最为深远的贡献之一，便是从海洋无脊椎动物中发现并克隆出编码荧光蛋白（FPs）的基因^7-8，以及随后通过工程化改造，不断扩展可用于活体示踪的报告工具箱⁹。如今，利用细胞类型特异性的启动子活性，驱动荧光蛋白在特定神经元群体中的靶向表达，使得神经解剖学研究达到了基因水平的精确度。

在神经元中构建荧光蛋白（FP）的表达已极大促进了我们对脑结构与功能的理解。然而，对深部脑组织或三维空间中单个神经元及其相关神经网络进行成像仍是一项挑战。由于脂质含量较高，神经组织较为不透明，并具有自发荧光特性。这些固有的生物物理特性使得利用标准的落射荧光显微镜或共聚焦显微镜在数十微米以上的深度难以实现对荧光标记神经元的高分辨率可视化与成像。为克服这一难题，研究人员常采用连续薄层切片成像与重建方法¹⁰，或双光子激光扫描显微技术¹¹。目前这些方法的局限性分别为组织制备过程劳动强度大，或所需仪器成本过高。

在此，我们介绍一种相对快速且简便的方法，通过光学透明化与成像技术，在固定的半厚小鼠脑切片中可视化荧光标记的细胞。在附带的实验方案中，我们描述了以下方法：1）固定脑组织 原位 通过心脏灌注，2）完整脑组织的解剖与取出，3）利用琼脂糖对脑组织进行固定包埋，4）使用新型振动切片机进行精密半厚切片制备，5）通过甘油梯度透明化脑组织，以及6）将组织切片置于载玻片上用于光学显微镜观察和z轴层扫重建（图1).

为了制备脑切片，我们采用了一种相对较新的仪器，称为“Compresstome” VF-200（http://www.precisionary.com/products_vf200.html）。该仪器是一种半自动切片机，配备有电机驱动的进样装置和刀片振动系统，其功能与其他振动切片机相似。与传统的振动切片机不同，待切组织被包埋在琼脂糖凝胶中，并置于不锈钢圆筒内进行固定。组织从圆筒中以设定的厚度被推出，并由向前移动并振动的刀片进行切割。琼脂糖凝胶插件与圆筒系统可实现组织安装的可重复性、精确对齐以及高精度切片。在我们的实际操作中，“Compresstome”能够制备出适用于电生理学、免疫组织化学以及直接固定组织贴片与成像的高质量组织切片。结合光学透明化技术，本文展示了用于高分辨率荧光成像的半厚固定脑切片的制备方法。

方案

1. 原位 脑组织固定

*准备一支10 ml注射器（28号针头），内含磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
*准备一支10 ml注射器（28号针头），内含溶于PBS的4%多聚甲醛（PFA）。另预留5–10 ml PFA/PBS用于灌注后固定。

1. 向实验小鼠腹腔内注射致死剂量的 Avertin 或 Nembutal。
2. 待小鼠麻醉后，用乙醇润湿腹部，并使用解剖针将小鼠固定在铺有软木、石蜡或硅胶弹性体的托盘底部。腹部朝上，将四肢尽可能向外展开并固定在表面。
3. 用镊子在胸骨水平夹住皮肤，横向剪开以暴露肝脏。向两侧剪开，再沿肋骨和膈肌向上剪开。移除肋骨组织瓣，继续剪切直至暴露心脏。
4. 刺破或剪开右心房以排出循环血液。
5. 通过左心室灌注 PBS，冲洗循环系统中残留的血液。
6. 利用同一针孔，通过左心室继续灌注 PBS/PFA，对整只小鼠进行固定。

2. 解剖与脑组织提取

1. 围绕耳道和眼眶进行切割，然后将头、颈和颅骨的皮肤向前剥离，以暴露颅骨。
   *参见图2，了解步骤2.2)至2.5)的示意图
2. 使用骨剪从眼眶经鼻甲骨横向剪开，两侧均需操作。横切位置应位于眼睛和嗅球前方。
3. 从每侧耳道沿纵向剪至眼眶。
4. 使用小型解剖剪，从一侧耳道到....

讨论

鉴于利用荧光蛋白标记神经元亚群并通过光学显微镜进行研究已得到广泛应用，快速筛选、成像和分析完整脑组织中的神经网络变得极为重要。

随着用户友好的病毒载体、体内电穿孔技术以及基因修饰小鼠品系的不断发展，如今研究人员可以获得几乎无限的标记细胞类型用于研究。然而，完整脑组织的图像分析仍然是实验中的一个瓶颈。本文所述方法已被证明在我们常规分析表达荧光报告基因的脑组织时极为有价值。该方法显著缩短了脑切片组织制备与分析所需的时间，适用于低倍率和高分辨率荧光成像，可与免疫细胞化学联合使用，可推广至其他实验动物模型，并且重要的是，适用于那些可能无法获得多光子成像设备的常规实验室环境。但需要注意的是，甘油及其他水性和有机溶液的光学透明化方法在实际应用中存在局限性。本文中我们描述了使用甘油辅助透明厚度达200 µm脑切片的方法。尽管该方法在改善厚度不超过200 µm组织的成像分辨率方面效果良好，但我们未观察到超过此厚度时有进一步改善。其他有机溶剂虽能实现更深层次的组织透明，但总会伴随着荧光信号的损失（或提取）问题。

上述方法的可能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
骨用剪刀	F.S.T.	16044-10	-或同类产品
解剖剪刀	F.S.T.	14084-08	-或同类产品
I-B型琼脂糖	Sigma-Aldrich	A0576
Compresstome	Precisionary Instruments	VF-200	-其他振动切片机亦可兼容
双面粘合剂	Grace Bio-Lab Inc.	SA-S-1L
Superfrost Plus 载玻片	VWR international	48311-703
盖玻片	VWR international	48383-139
甘油	EMD Millipore	GX0185-6	-或同类产品