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1。收获的组织
- 准备管含有2至5毫升冷染色缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS）与添加0.2％BSA和5mm葡萄糖）。置于冰上管组织收获前。
- 根据卡尔小鼠适当批准的协议（如CO 2吸入颈椎脱位）。
- EDTA或肝素血液收集管进入心脏穿刺，为以后的分析，如红细胞压积，网织红细胞计数或CBC分析，绘制血。
- 收获脾和骨骼，放置在一个单独的管，准备在第1步，从每个鼠标的组织。易于访问以健脾是从左侧。对于骨髓，收获一个或两个股骨。收获的组织置于冰上。
- 如果需要，权衡脾。小鼠接受红细胞生成应激反应可能表现出显着增加脾脏重量。
2。脾细胞的制备
- 使用预先蘸3毫升注射器推杆，轻轻一推，通过一个40微米的无菌细胞过滤器（Fisherbrand目录编号22363547或其他）脾，或脾的一部分（理想情况下，0.1克或更少，相当于约10 8个细胞）放在一个50毫升的锥形管的顶部。在此过程中试管置于冰上。共2毫升染色缓冲细胞通过过滤网清洗。
- 轻轻吸管紧张的细胞悬液，打破了任何小团块。如果有必要，重新株的细胞。
- 清洗细胞两次离心，重新暂停在寒冷的缓冲区。
- 使用血球计数细胞。典型的产量是1-2 x 10 8细胞/脾脏。流式细胞仪检测分析，aliquote 1至2亿个细胞，每个样品，到流式细胞仪染色管（BD猎鹰聚苯乙烯圆底管，352008）或U型底96孔板（屋宇署猎鹰353910）。样品染色体积为200μL，最后的细胞浓度为0.5〜1 × 10 7细胞/毫升或1-2 × 10 6细胞/ 200μL的样品。
3。骨髓细胞的制备
- 准备与附加的26G针，预充冷染色缓冲1或3毫升的注射器。
- 取出股骨的肌肉，以可视化骨清楚。
- 使用尖锐的手术剪刀，剪断关闭股骨的两端，尽可能接近骨的两端。这应该揭示了一个小洞，在每个切端，领先进入骨髓腔，通过股骨的长度，运行。
- 在第1步中使用的预充式注射器，通过这些孔插入针，轻轻冲洗骨髓通过小孔在另一端，成筒，。
- 通过上述脾为40微米的过滤器（参见2.1节），游离轻柔吹打刷新细胞和应变。
- 在寒冷的染色缓冲液离心洗涤细胞两次
- 计数细胞，重悬在2.4节。典型的产量大约为10 7％，股骨细胞。
4。胎肝细胞的制备
- 要准备定时怀孕的雌性小鼠，设置在晚上的交配小鼠;检查阴道塞前翌日上午10时，检测阴道塞的一天是一天0.5。兽医人员可能能够帮助那些不熟悉这种技术，以确定怀孕女性的调查。怀孕也可以由监控鼠标重量。
- 定时怀孕的雌性小鼠扑杀12.5至14.5怀孕天。子宫角的Petri盘成含有冰冷的培养基或染色缓冲中删除。
- 胚胎从每个子宫和胎肝解剖。在解剖显微镜所需的胚胎12.5天（E12.5）或以下。
- 可能是肝脏分离机械吹打在缓冲区，并单独处理，在96孔板，或汇集起来，根据实验要求。
- 在E13.5胎肝〜10 7细胞。细胞染色缓冲洗两次，并在1-2 x 10 6细胞/流式细胞仪分析200μL样品重悬于。
5。抗体染色流式细胞仪
- 准备主抗体染色，预混合被用于所有的样品，对照样品除外，包含以下内容:
- ChromePure兔IgG（杰克逊015-000-003），到终浓度为200μg/ml。检查瓶子上的股权集中度（它可以改变）。这是用来阻止老鼠细胞的Fc受体，这可能用于替代物种鼠IgG或鼠IgG。树种的选择是由在对大鼠原代/鼠标/兔抗体，这些物种在这种情况下，不能使用导演的二次抗体染色协议中可能存在d为封闭抗体。另外，也可能被用来5％兔血清中纯化IgG的地方。另一种替代方法是使用鼠标Fc受体的单克隆抗体或Fab片段。下面的基本协议不包括任何辅助抗体等可用于任何种抗体。
- CD71 - FITC，稀释1:200（0.5mg/ml的股票，BD生物科学，553266）
- Ter119 - PE，稀释1:200（股票0.2mg/ml，BD Biosciences公司，553673）
- 任何额外的利益表面抗原决定簇的抗体，如抗体冲着FAS或FasL的（见1,2 ）。混合抗体溶液轻轻颠倒离心管2-3次。
- 每个细胞样品加入200μL预混合，轻轻地重新悬浮细胞。
- 准备控制细胞样本如下:
- "不染":留在这些细胞染色缓冲，并提供背景的自发荧光的细胞。
- "单色"的控制:一个这样的控制是需要为每个抗体/在协议中使用的颜色。这些控件的细胞可以直接标记的抗体染色，或与主抗体和标记的二抗。这些控制是使用正确的渠道之间的光谱重叠。
- "荧光减一"（FMO）的控制:一个这样的控制是需要在协议中，每个抗体/颜色:细胞除在协议中的所有颜色/抗体染色的颜色/这是FMO控制的抗体。 FMO控制特定通道，该通道的真实背景。它可能包括同一亚型的非特异性抗体，并与测试抗体（亚型控制）相同的荧光标记共轭。
- 45'至1小时，在黑暗中（冰水桶放在铝箔盖）在冰上孵育和有关管制的主要抗体染色。
- 孵化结束，洗细胞染色缓冲3毫升3'到5'加入到每个样品管和旋转约400 XG在4 ° C如果使用96孔板，细胞体积200μL洗三次。
- 如果相关，申请二级抗体染色。应用为第一抗体染色洗。
- 如果相关，与Annexin V的染色适用于孵化年底，制造商的指示使用一个HEPES缓冲。这个污点是适用于在室温15分钟，或在冰1小时。
- 细胞重新悬浮，流式细胞仪检测分析中包含一个细胞防渗的DNA染料染色溶液，排除死细胞。一些DNA的染料都可用，包括碘化丙啶，7 - 氨基放线菌素D（7AAD），或DAPI。在这些选择取决于可用的通道特异性抗体染色渠道，和渠道流流式细胞仪。 7AAD是从BD Biosciences公司（559925），并根据制造商的指示使用。 DAPI染色，在二甲基甲酰胺（DMF）为1mg/ml的股票从粉（罗氏，CAT＃236276），保持在-20 ° C，染色缓冲液稀释1:10,000至1:15,000。
6。流流式细胞仪排序
- 细胞对CD71抗体，Ter119，宗族标记，和生存能力染料流流式细胞仪分析（第5）所述的标记。在标签的细胞浓度可提高到5 × 10 7 / ml的。
- 混合同等体积的每个下面的抗体，使宗族主结构:
- FITC标记的大鼠抗小鼠CD41 MWReg30，BD Pharmingen公司553848
- FITC标记的鼠抗小鼠CD45R/B220，RA3 - 6B2，BD Pharmingen公司553087
- FITC标记的鼠抗鼠CD3e 145 - 2C11，BD Pharmingen公司553061
- FITC标记的鼠抗鼠CD11b/Mac-1 M1/70，BD Pharmingen公司557396
- FITC标记的鼠抗鼠LY - 6G和Ly - 6C（GR - 1）的RB6 - 8C5，BD Pharmingen公司553126
- 1:80主混合使用（这相当于每个人的抗体的股票，这是所有0.5毫克/毫升，以1:400稀释）。
- 使用低压排序条件和广泛的喷嘴。对于咏叹调（BD Biosciences公司），我们用100μ喷嘴，20 psi的压力。
- 收集缓冲液:PBS与添加20％胎牛血清。
- 要检查的排序种群的纯度，重新从每个样品运行在一个缓冲区，它包含一个可行性的染料（7AAD或类似）一个小等份。
7。代表性的成果:
CD71/Ter119成人骨髓或脾脏染色确定了四个亚群的发展序列，标记PROE，尔雅，EryB EryC（图1）1 。形态，这些对应的日益成熟的红细胞。图1说明了浇注序列数据分析阶段，丢弃非常小的事件（包括细胞核，红细胞），汇总的细胞和死细胞。
可同时测量细胞表面蛋白的表达，每个子集，加入有关的抗体，同时Ter119和CD71染色。图1显示了一个细胞表面死亡受体Fas表达的例子。这种测量方法是在与欧洲专利局注入小鼠进行，或在对照组小鼠注射用生理盐水。很明显，EPO抑制Fas表达在体内 1尔雅人口。
细胞内蛋白质或细胞周期状态的表达，也可以测量细胞在每个子集。图2说明了代表刚收获的骨髓细胞的细胞周期分析。这些测量需要，除了细胞表面染色与CD71和Ter119，细胞细胞内标签（见讨论部分）的固定和通透。
在胎儿肝脏中，首先排除非红系细胞通过门控"林"的细胞，CD41负，MAC - 1，GR - 1，B220和CD3（图3）。其余细胞分分为6个亚群，S0到S5。胎儿肝脏中的细胞的精确模式是依赖于胚胎年龄（见讨论部分）。在E13.5胎肝S3子集的一个有代表性的细胞周期分析显示（图4）。
图1 CD71/Ter119红子集A.浇注战略: 在小鼠脾脏。脾细胞处理和标记CD71，Ter119和Fas抗体。此图显示了以下的数据采集步骤的分析策略。直方图我显示了所有收购的事件。对角线门事件，可能是单细胞，但不包括双峰或更大的聚合。这门细胞直方图二是进一步分析。这里非常小的事件，可能的核或碎片，被排除在外。门控单元格显示直方图三，其中的DAPI阳性细胞，有可能半透膜细胞凋亡，进一步的分析排除。直方图四显示可行的脾细胞产生的人口。 PROE门包含CD71 高 Ter119 中间细胞。 Ter119 高细胞进一步分析直方图五高在这里CD71细胞细分成不太成熟，大的"尔雅"的红细胞（CD71高 Ter119高FSC的高）和更小，更成熟的"EryB" 红细胞（CD71高Ter119 高 FSC的低） 。最成熟的红细胞的一个子集EryC（CD71低Ter119高FSC 的低） 。直方图VI，显示细胞表面Fas表达，特别是在尔雅子集，在基础状态下的小鼠（注射用生理盐水），并与单剂量注射的EPO的老鼠，。 Fas抗体染色同时CD71/Ter119染色。Cytospin细胞的每一个指定的子集进行排序的准备。细胞与姬姆萨染色，并与二氨基联苯胺，后者与血红蛋白生成褐色的污渍。刘等人最初发表Cytospin数据，血。 2006年7月1 108（1）:123 - 33。 EPUB 2006年3月9日。
图2 CD71 高 Ter119在小鼠骨髓红细胞的细胞周期分析 。小鼠注射用BrdU腹腔，脾或骨髓收获30至60分钟后。细胞固定和通透，除了被CD71和Ter119染色，染色BrdU掺入到他们的DNA复制与BrdU定向单克隆抗体（固定，通透性和BrdU染色协议是根据制造商的指示）。 BrdU阳性细胞周期S期。间期细胞BrdU阴性和可能解决的G1或G2 / M期，使用DNA染料7AAD。
图3 CD71/Ter119红子集A.浇注战略: 在小鼠胎肝。胎肝细胞标记CD71，Ter119，并在非红系标记（"林"）执导的FITC标记的抗体鸡尾酒。林表达活菌（7AAD阴性）进行了分析，和林细胞进一步细分到S0到S5红子集。雅戈尔，是由E13胎肝细胞在成熟的S4/S5子集的情况下表现出不太成熟的红细胞，从每一个指定的子集进行排序的细胞B. Cytospin的准备工作。细胞与姬姆萨染色，并与二氨基联苯胺，后者与血红蛋白生成褐色的污渍。 Cytospin数据最初published公共科学图书馆生物学流行等 ，8（9）:e1000484。作者:10.1371/journal.pbio.1000484。
图4。胎肝红亚群细胞周期分析。孕鼠注射用BrdU，胎儿肝脏收获30至60分钟后，固定，透，并与抗体对CD71，Ter119和BrdU染色。 S3细胞的细胞周期的状态显示。