一种通过流式细胞术直接在新鲜分离的小鼠骨髓、脾脏或胎肝中鉴定和分析分化阶段特异性小鼠红系祖细胞和前体细胞的分子方法。该检测基于细胞表面标志物CD71、Ter119以及细胞大小。
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方法文章
利用CD71/TER119流式细胞术检测鉴定与分析小鼠红系祖细胞
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
红细胞生成的研究旨在阐明红细胞如何由早期造血细胞和红系祖细胞发育而来。具体而言，红细胞的生成速率由激素促红细胞生成素（Epo）调控，该激素的合成由组织缺氧触发。当组织氧供不足时，Epo水平迅速升高，从而加快红细胞生成速率，这一过程称为红细胞生成应激反应。循环中红细胞数量的增加可改善组织的氧输送。因此，有效的红细胞生成应激反应对于机体在高海拔、贫血、出血、化疗或干细胞移植等生理和病理条件下的存活与恢复至关重要。
小鼠是研究红细胞生成及其应激反应的关键模型。小鼠确定型（成年型）红细胞生成发生在胚胎期12.5至15.5天的胎肝中，以及新生小鼠的脾脏和成年小鼠的脾脏与骨髓中。传统鉴定组织中红系祖细胞的方法依赖于这些细胞在含有促红细胞生成素（Epo）的半固体培养基中形成红细胞集落的能力。其红系前体细胞后代则基于形态学标准进行鉴定。然而，这两种经典方法均无法获得大量特定分化阶段的红系细胞用于分子水平研究。本文介绍一种通过流式细胞术直接在新鲜分离的小鼠组织中鉴定和研究特定分化阶段红系祖细胞及前体细胞的方法。该检测方法依赖于细胞表面标志物CD71、Ter119以及流式细胞术中的“前向散射”（forward-scatter）参数（该参数反映细胞大小）。CD71/Ter119检测可用于研究红系祖细胞在体内应对红细胞生成应激时的变化，例如在贫血小鼠或处于低氧环境饲养的小鼠中。该方法也可直接用于分析基因修饰成年小鼠或胚胎组织中的红系祖细胞，以评估特定分子通路在红细胞生成过程中的作用。
方案
1. 组织的采集
- 准备含有 2 至 5 ml 冷染色缓冲液（含 0.2% BSA 和 5 mM 葡萄糖的磷酸盐缓冲液（PBS））的离心管。组织采集前将离心管置于冰上。
- 根据适当的批准方案处死小鼠（例如，先吸入 CO2，随后进行颈椎脱位）。
- 通过心脏穿刺将血液收集至含 EDTA 或肝素的采血管中，用于后续分析，例如 hematocrit、网织红细胞计数或全血细胞计数（CBC）分析。
- 取出脾脏和骨骼，将每只小鼠的组织分别放入步骤 1 中准备好的离心管中。从左侧可较容易地获取脾脏。对于骨髓，可采集一侧或双侧股骨。采集的组织应保持在冰上。
- 如有需要，称量脾脏重量。经历促红细胞生成应激反应的小鼠脾脏重量通常会显著增加。
2. 脾细胞的制备
- 使用预先润湿的3 ml注射器活塞，将脾脏或部分脾脏（理想情况下，重量不超过0.1克，相当于约108个细胞）轻轻推过置于50 ml锥形管顶部的40 μm无菌细胞筛（Fisherbrand目录号22363547或其他同类产品）。操作过程中将锥形管置于冰上。用总共2 ml染色缓冲液冲洗细胞通过细胞筛。
- 轻柔吹打滤过的细胞悬液，以分散任何细小的团块。如有必要，可再次过滤细胞。
- 通过离心洗涤细胞两次，并重新悬浮于冷缓冲液中。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。通常每只脾脏可获得1-2 × 108个细胞。进行流式细胞术分析时，每份样品分装100万至200万个细胞，可分装至FACS染色管（BD Falcon聚苯乙烯圆底管，352008）或U型底96孔板（BD Falcon 353910）中。每份样品染色体积为200 μl，最终细胞浓度为0.5至1 × 107个细胞/ml，或每200 μl样品含1-2 × 106个细胞。
3. 骨髓细胞的制备
- 准备1 ml或3 ml注射器，连接26G针头，并预先装入冷染色缓冲液。
- 去除附着在股骨上的肌肉，以便清晰观察骨骼。
- 使用锋利的手术剪尽可能靠近股骨两端将其剪断。每个切割端应露出一个小孔，通向贯穿股骨全长的骨髓腔。
- 使用步骤1中的预装注射器，将针头穿过其中一个孔，从另一端的孔中轻柔地将骨髓冲洗到离心管中。
- 通过轻柔吹打使冲洗下来的细胞解离，并经一滤器过滤 40 μm 筛网，与上述脾脏处理相同（见第节 2.1).
- 用预冷的染色缓冲液通过离心洗涤细胞两次
- 计数细胞并按照第节中的方法重新悬浮 2.4典型的产量约为107 每根股骨的细胞数
4. 胎肝细胞的制备
- 为准备特定妊娠阶段的雌性小鼠，应在傍晚安排小鼠交配，并于次日上午10点前检查阴道栓；发现阴道栓的当天记为妊娠0.5天。对于不熟悉该技术的研究人员，兽医人员可协助鉴定妊娠雌鼠。也可通过监测小鼠体重变化来确定是否妊娠。
- 在妊娠第12.5至14.5天处死特定妊娠阶段的雌性小鼠，将子宫角取出并置于含有冰上预冷的培养基或染色缓冲液的培养皿中。
- 从每只子宫中取出胚胎，并解剖获取胎肝。对于妊娠12.5天（E12.5）或更早期的胚胎，需要使用解剖显微镜进行操作。
- 胎肝可通过在缓冲液中吹打进行机械解离，根据实验需求，可将样品分别处理于96孔板中，或合并处理。
- 妊娠13.5天（E13.5）的胎肝约含有107个细胞。细胞用染色缓冲液洗涤两次后，重悬于200 μl体积中，浓度为1–2 × 106 个细胞/样本，用于流式细胞术分析。
5. 流式细胞术抗体染色
- 为所有样本（对照样本除外）配制一种一抗染色预混液，包含以下组分：
- ChromePure 兔 IgG（Jackson，015-000-003），终浓度为 200μg/ml。请检查瓶上标注的原液浓度（可能有所差异）。该试剂用于阻断小鼠细胞中的 Fc 受体；可用于此目的的其他物种包括小鼠 IgG 或大鼠 IgG。阻断抗体的物种选择取决于染色方案中是否使用针对大鼠/小鼠/兔一抗的二抗，若存在此类二抗，则相应物种的 IgG 不可作为阻断抗体使用。此外，也可用 5% 兔血清替代纯化的 IgG。另一种替代方案是使用针对小鼠 Fc 受体的单克隆抗体或 Fab 片段。下述基本方案中不包含任何二抗，因此三种物种的 IgG 均可使用。
- CD71-FITC，按 1:200 稀释（原液 0.5mg/ml，BD-Biosciences，553266）
- Ter119-PE，按 1:200 稀释（原液 0.2mg/ml，BD-Biosciences，553673）
- 任何其他针对目标表面表位的一抗，例如抗 Fas 或 FasL 抗体（见 1,2）。通过轻轻颠倒混匀管 2–3 次，温和混匀抗体溶液。
- 向每个细胞样本中加入 200 μl 预混液，并轻轻重悬细胞。
- 按如下方式制备对照细胞样本：
- “未染色”对照：这些细胞仅保留在染色缓冲液中，用于提供细胞自身的背景自发荧光。
- “单色”对照：本方案中每种抗体/荧光染料均需设置一个此类对照。这些对照细胞使用直接偶联荧光染料的一抗染色，或同时使用一抗和偶联荧光染料的二抗进行染色。此类对照用于校正通道间的光谱重叠。
- “减去一色荧光”（FMO）对照：本方案中每种抗体/荧光染料均需设置一个 FMO 对照。细胞使用除该 FMO 对照所对应的抗体/荧光染料外的所有其他抗体/荧光染料进行染色。特定通道的 FMO 对照可提供该通道的真实背景信号。该对照中可包含同型对照抗体（即与待测抗体相同同型、偶联相同荧光染料的非特异性抗体）。
- 将样本及相应对照在冰上避光孵育 45 分钟至 1 小时（在冰桶外包裹铝箔）。
- 孵育结束后，向每管样本中加入 3ml 染色缓冲液洗涤细胞，并在 4°C 下以约 400 × g 离心 3 至 5 分钟。若使用 96 孔板，则每孔用 200 μl 染色缓冲液洗涤三次。
- 如需进行二抗染色，请在此步骤中进行。操作方式与一抗染色相同，包括染色与洗涤步骤。
- 如需进行 Annexin V 染色，则在孵育结束后按照制造商说明书使用 HEPES 缓冲液进行染色。该染色可在室温下进行 15 分钟，或在冰上进行 1 小时。
- 将细胞重悬于含有细胞不可透过性 DNA 染料的染色液中，用于流式细胞术分析，以排除死细胞。可选的 DNA 染料包括碘化丙啶（Propidium Iodide）、7-氨基放线菌素 D（7AAD）或 DAPI。具体选择取决于抗体染色所占用的检测通道以及流式细胞仪可用的检测通道。7AAD 来自 BD-Biosciences（559925），按制造商说明书使用。对于 DAPI 染色，使用粉末（Roche，货号 # 236276）以二甲基甲酰胺（DMF）配制 1mg/ml 储存液，-20°C 保存，并在染色缓冲液中稀释 10,000 至 15,000 倍使用。
6. 流式细胞分选
- 按照流式细胞术分析（第5节）所述方法，使用抗CD71、Ter119、谱系标记物抗体及活细胞染料对细胞进行标记。标记过程中细胞浓度可提高至5 × 107/ml。
- 将以下每种抗体取等体积混合，配制谱系主混合液：
- FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553848
- FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087
- FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061
- FITC Rat Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396
- FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126
- 主混合液使用稀释比例为1:80（相当于将每种浓度均为0.5 mg/ml的单个抗体原液按1:400稀释）。
- 采用低压分选条件和大口径喷嘴。对于Aria（BD Biosciences）仪器，我们使用100 μm喷嘴和20 psi压力。
- 收集缓冲液：添加20%胎牛血清的PBS。
- 为检测分选后细胞群的纯度，取每份样品少量等分试样，重新在含有活细胞染料（7AAD或类似染料）的缓冲液中上机检测。
7. 代表性结果：
成年小鼠骨髓或脾脏的CD71/Ter119染色可鉴定出四个发育阶段的细胞亚群，分别标记为ProE、EryA、EryB和EryC（图1）1。从形态学上看，这些亚群对应于逐渐成熟的有核红细胞。图1展示了数据分析阶段的设门流程，该流程排除了体积过小的事件（包括细胞核、红细胞）、聚集的细胞以及死亡细胞。
可通过在对 Ter119 和 CD71 进行染色的同时加入相应抗体，同步检测上述各亚群细胞表面蛋白的表达。图1展示了死亡受体Fas细胞表面表达的一个示例 1该检测在注射了促红细胞生成素（Epo）的小鼠或注射生理盐水的对照小鼠中进行。结果显示，Epo可抑制EryA细胞群中Fas的表达。 体内 1.
还可对各亚群细胞内的细胞内蛋白表达或细胞周期状态进行检测。图2展示了新鲜分离的骨髓细胞的代表性细胞周期分析结果。这些检测除需要使用CD71和Ter119进行细胞表面染色外，还需对细胞进行固定和透化处理，以便进行细胞内标记（详见讨论部分）。
在胎肝中，首先通过设门排除表达 CD41、Mac-1、Gr-1、B220 和 CD3 的“Lin-”非红系细胞（图3）。剩余细胞进一步分为6个亚群，即 S0 至 S5。胎肝中细胞的精确分布模式取决于胚胎发育年龄（见讨论部分）。图4展示了 E13.5 胎肝中 S3 亚群的代表性细胞周期分析结果。
图1. 小鼠脾脏中的CD71/Ter119红系细胞亚群。 A. 分选策略：脾脏细胞经处理后，使用针对CD71、Ter119和Fas的抗体进行标记。本图展示了数据采集完成后的分析策略。图I显示所有采集到的事件。对角门控代表可能为单个细胞的事件，排除双联体或更大的聚集体。该门控内的细胞进一步在图II中分析。此处排除体积非常小的事件，这些事件可能为细胞核或碎片。被门控的细胞在图III中显示，其中排除DAPI阳性细胞，这些细胞可能为细胞膜通透性的凋亡细胞，不进入后续分析。图IV显示最终获得的活脾细胞群体。ProE门包含CD71highTer119intermediate细胞。Ter119high细胞进一步在图V中分析。在此，CD71high细胞被细分为较不成熟的、体积较大的“EryA”型成红细胞（CD71highTer119highFSChigh）和较小的、更成熟的“EryB”型成红细胞（CD71highTer119highFSClow）。最成熟的成红细胞亚群为EryC（CD71lowTer119highFSClow）。图VI显示在基础状态（注射生理盐水）的小鼠和单次注射Epo的小鼠中，EryA亚群表面Fas的表达情况。Fas抗体染色与CD71/Ter119染色同时进行。B. 从各指定亚群分选细胞后制备的细胞涂片。细胞经吉姆萨染色和二氨基联苯胺染色，后者可与血红蛋白反应产生棕色沉淀。细胞涂片数据最初发表于Liu et al., Blood. 2006 Jul 1;108(1):123-33. Epub 2006 Mar 9。
图 2. 小鼠骨髓中 CD71highTer119high 红系前体细胞的细胞周期分析。 小鼠经腹腔注射 BrdU，30 至 60 分钟后取脾脏或骨髓组织。细胞经固定和透化处理后，除使用 CD71 和 Ter119 抗体染色外，还使用抗 BrdU 单克隆抗体检测 BrdU 在复制 DNA 中的掺入情况（固定、透化及 BrdU 染色操作按试剂盒说明书进行）。BrdU 阳性细胞处于细胞周期的 S 期。间期细胞为 BrdU 阴性，可通过 DNA 染料 7AAD 进一步区分成 G1 期或 G2/M 期。
图 3. 小鼠胎肝中的 CD71/Ter119 红系亚群。 A. 设门策略：胎肝细胞用 CD71、Ter119 及针对非红系谱系标志物（“Lin”）的 FITC 标记抗体混合物进行标记。对活细胞（7AAD 阴性）分析其 Lin 表达情况，Lin 阴性细胞进一步划分为 S0 至 S5 红系亚群。较早期的 E13 胎肝主要由较不成熟的红细胞前体组成，表现为成熟 S4/S5 亚群中无细胞存在。B. 从所示各亚群分选细胞制备的细胞涂片。细胞经吉姆萨染色和二氨基联苯胺染色，后者可与血红蛋白反应产生棕色着色。细胞涂片数据最初发表于 Pop et al., PLoS Biol 8(9): e1000484. doi:10.1371/journal.pbio.1000484 。
图4. 胎肝红系细胞亚群的细胞周期分析。 对怀孕小鼠注射BrdU，30至60分钟后获取胎肝组织，经固定、透化处理后，用抗CD71、Ter119和BrdU的抗体进行染色。图中显示S3细胞的细胞周期状态。
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讨论
流式细胞术方法能够同时检测任何可通过荧光标记的特异性抗体或配体识别的细胞功能，包括细胞表面标志物、蛋白质表达、细胞存活以及利用磷酸化特异性抗体检测的细胞信号转导 3 以及细胞周期状态。这些测量可在新鲜分离的红细胞生成组织中，针对多个特定分化阶段的亚群分别进行。因此，该方法可用于评估红细胞生成系统在不同水平上对多种红细胞生成刺激或遗传突变所产生的一系列功能和分子变化。
任何抗体都存在交叉反应性，且交叉反应性可能具有组织特异性。因此，即使对于已测试过的抗体，也必须在红系造血组织的背景下，利用基因敲除或基因敲低的细胞模型，验证其特异性。
可对特定红系亚群的细胞进行分选，用于RNA或转录组分析。分选实验应采用较低的分选压力和较宽的喷嘴，以最大限度地减少细胞所受的剪切应力。我们建议在每次分选实验后检查细胞纯度和活力。值得注意的是，在多参数流式细胞术中，每种荧光通道的真实背景为其“FMO”对照（见5.3节），该对照除自发荧光外，还包括来自所有其他荧光通道的光谱重叠所导致的背景信号。在数据分析阶段，需使用特定细胞亚群...
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披露
动物实验严格按照马萨诸塞大学医学院IACUC委员会制定的指南和规定进行。
致谢
感谢马萨诸塞大学流式细胞术核心实验室：Richard Konz、Ted Giehl、Barbara Gosselin、Yuehua Gu 和 Tammy Krupoch。本工作由美国国立卫生研究院/国立心肺血液研究所（NIH/NHLBI）RO1 HL084168（M.S.）和 NIH CA T32-130807（J.R.S.）资助。研究还使用了糖尿病与内分泌研究中心资助项目 DK32520 支持的核心资源。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Fas-biotin | BD 生物科学 | 554256 | |
| 链霉亲和素-APC | Molecular Probes, Life Technologies | S868 | |
| 40 μm 无菌细胞筛 | 费舍尔科技 | 22363547 | |
| FACS 染色用聚苯乙烯圆底管 | BD 生物科学 | 352008 | |
| 96 孔 U 型底板 | BD 生物科学 | 353910 | |
| ChromePure 兔 IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| CD71-FITC（储存液 0.5 mg/mL） | BD 生物科学 | 553266 | |
| Ter119-PE（储存液 0.2 mg/mL） | BD 生物科学 | 553673 | |
| 7AAD | BD 生物科学 | 559925 | |
| DAPI 粉末 | 罗氏集团 | 236276 | |
| FITC 大鼠抗小鼠 CD41 MWReg30 | BD 生物科学 | 553848 | |
| FITC 大鼠抗小鼠 CD45R/B220 RA3-6B2 | BD 生物科学 | 553087 | |
| FITC 大鼠抗小鼠 CD11b/Mac-1 M1/70 | BD 生物科学 | 557396 | |
| FITC 大鼠抗小鼠 Ly-6G 和 Ly-6C（Gr-1）RB6-8C5 | BD 生物科学 | 553126 | |
| FITC 仓鼠抗小鼠 CD3e 145-2C11 | BD 生物科学 | 553061 | |
| APC BrdU 流式检测试剂盒 | BD 生物科学 | 557892 | |
| Annexin V-biotin | BD 生物科学 | 556418 |
参考文献
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- Socolovsky, M. Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis. PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).
- Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry. J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).
- Socolovsky, M. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98, 3261-3273 (2001).
- Guihard, S. The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis. Blood. 115, 3686-3694 (2010).
- Yu, X. An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis. J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).
- Chen, M. L. Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction. Blood. 114, 4045-4053 (2009).
- Chen, K. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Pop, R. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biol. 8, (2010).
- Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells. Nature. 196, 347-350 (1962).
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