使用自旋捕获剂通过电子顺磁共振波谱法检测细胞中的一氧化氮和超氧阴离子自由基 关键词：电子顺磁共振波谱法，自旋捕获，一氧化氮，超氧阴离子，自由基，细胞氧化应激

摘要

采用电子顺磁共振（EPR）波谱法，分别利用二价铁-Ｎ-甲基-Ｄ-葡糖胺二硫代氨基甲酸复合物 Fe(MGD)₂ 和 5,5-二甲基-1-吡咯啉-Ｎ-氧化物 DMPO，检测牛主动脉内皮细胞中的一氧化氮和人中性粒细胞中的超氧阴离子自由基。

摘要

低浓度的活性氮/氧物种（ROS/RNS）在调节细胞功能、信号传导和免疫反应中发挥重要作用，但浓度失控时则会对细胞活力造成损害^{1, 2}。尽管生物体在进化过程中已形成内源性和膳食来源的抗氧化防御机制以调控ROS的生成，ROS仍会作为氧气正常代谢的天然副产物持续产生，并可导致生物分子的氧化损伤，引起蛋白质功能丧失、DNA断裂或脂质过氧化³，最终引发氧化应激，导致细胞损伤或死亡⁴。

超氧阴离子自由基（O₂•-）是生物系统中一些最强氧化性物质（如过氧亚硝酸盐和羟基自由基）的主要前体。O₂•- 的产生标志着氧化爆发的最初信号，因此在生物系统中对其进行检测和/或捕获具有重要意义。在本实验中，O₂•- 由多形核中性粒细胞（PMNs）产生。通过佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐（PMA）的趋化性刺激，PMNs 激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，从而生成 O₂•-⁵。

一氧化氮（NO）合酶存在三种同工酶形式，分别为诱导型、神经元型和内皮型NOS，即iNOS、nNOS和eNOS，可利用NADPH催化L-精氨酸转化为L-瓜氨酸，同时生成NO⁶。本文中，我们由内皮细胞生成NO。在氧化应激条件下，eNOS可能从生成NO转变为生成超氧阴离子（O₂•-），该过程称为eNOS去偶联，被认为是由血红素⁷或辅因子四氢生物蝶呤（BH₄）⁸的氧化所导致。

在生物系统中检测自由基的可靠方法很少，且这些方法在特异性和灵敏度方面存在局限性。电子自旋捕获（spin trapping）常用于自由基的鉴定，其原理是自由基与自旋捕获剂发生加成反应，生成稳定的自旋加合物，该加合物可通过电子顺磁共振（EPR）波谱法进行检测。不同的自由基加合物表现出特征性的谱图，可用于识别所产生的自由基，并可提供关于自由基生成性质和动力学的丰富信息⁹。

环状亚硝基化合物，如5,5-二甲基吡咯啉-N-氧化物（DMPO¹⁰）、磷酸酰基取代的DEPMPO¹¹以及酯基取代的EMPO¹²和BMPO¹³，已被广泛用作自旋捕获剂——其中后者的O₂•-加合物具有更长的半衰期。铁(II)-N-甲基-D-葡糖胺二硫代氨基甲酸盐Fe(MGD)₂因加合物形成速率高且自旋加合物稳定性高，常用于捕获NO¹⁴。

方案

1. 牛主动脉内皮细胞（BAEC）的培养

1. 遵循正确的无菌操作技术。
2. 在水浴中将不含抗生素的培养基加热至 37 °C。

注意： 培养基由不含酚红的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）组成，其中包含 4.5 g/L D-葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸，并添加 10% 胎牛血清（FBS）和 2.5 mg/L 内皮细胞生长因子。

3. 从培养箱中取出含有细胞的 T75 培养瓶，在放入生物安全柜前用 70% 乙醇擦拭瓶体表面。
4. 使用移液器吸除旧培养基，并用 5 ml 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗两次。
5. 加入 2 ml 胰蛋白酶，孵育 4–5 分钟使细胞脱落，期间定期在显微镜下观察。
6. 加入 3 ml 培养基，用移液器反复吹打混匀，使细胞充分解离并形成均匀的悬浮液。
7. 将含胰蛋白酶的 5 ml 培养基转移至 15 ml 离心管中，在 121 g 条件下离心 5 分钟。
8. 用移液器吸除上清液，加入 5 ml DPBS 并充分混匀，随后在 121 g 条件下离心 5 分钟。
9. 吸除上清液，加入 6 ml 培养基重悬细胞沉淀。
10. 在 6 孔板中，每孔加入 1 ml 细胞悬液，再加入 1 ml 培养基，用移液器轻轻吹打混匀。
11. 标记培养板，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养。

2A. 使用BAEC细胞检测NO

1. 遵循正确的无菌操作技术。
2. 从培养箱中取出6孔板，吸除第一孔中的培养基，用1 ml DPBS洗涤细胞两次。
3. 加入210 μl新配制的1.9 mM硫酸亚铁七水合物（FeSO₄·7H₂O，将0.8 mg溶于含CaCl₂和MgCl₂的1 ml DPBS中）和210 μl新配制的N-甲基-D-葡糖胺二硫代氨基甲酸盐（MGD，将2.7 mg溶于含CaCl₂和MgCl₂的500 μl DPBS中），两者的体积比为1:7。（注意：由于过量MGD存在时Fe³⁺-MGD的产率最高，因此传统上采用过量MGD的比例来制备Fe²⁺-MGD复合物。溶液中无需额外添加抗坏血酸以稳定Fe²⁺-MGD，因为生成的NO-Fe³⁺-MGD可在内源性抗坏血酸、氢醌或半胱氨酸的作用下高效（转化率可达99.9%）还原为EPR可检测的NO-Fe²⁺-MGD。Fe²⁺的低自旋抗磁态使得可在室温下使用扁平池或毛细管进行NO检测，无需低温设备）¹⁵。
4. 轻轻振荡混匀后，加入4.6 μl钙离子载体（CaI）（用DMSO将1 mg溶解于1 ml中配制成1.9 mM储备液后使用）。
5. 再次轻轻振荡混匀，并于37 °C孵育36分钟，以进一步促进NO-Fe³⁺-MGD还原为EPR可检测的NO-Fe²⁺-MGD。
6. 收集上清液（425 μl）至EP管中，转移至EPR扁平池（或50 μl毛细管）中。
7. EPR检测参数如下：微波频率：9.8 GHz；中心磁场：3427 G；调制幅度：6.0 G；扫描宽度：100 G；接收增益：1 × 10⁵；微波功率：10 mW；总扫描次数：121；扫描时间：10 s；时间常数：20 ms。（注意：由于不同仪器和实验条件下的参数可能存在差异，因此仅中心磁场、频率和调制幅度为最关键的参数）
8. 在室温下记录谱图，使用Bruker WinEPR数据处理软件或其他数据处理软件对二维谱图进行积分以降低背景噪声并校正基线。为定量分析加合物的形成，可使用NO供体SNAP建立浓度与信号强度（或峰面积）之间的标准曲线。

2B. eNOS 去偶联实验

1. 从培养箱中取出6孔板，吸去第二孔中的培养基，并用1 ml DPBS洗涤两次。
2. 使用过氧亚硝酸盐供体5-氨基-3-(4-吗啉基)-1,2,3-恶二唑鎓氯化物（SIN-1）以解偶联eNOS¹⁶。加入100 μl 0.5 mM SIN-1（M_r 206.6 g/mol，由10 mM储备液新鲜配制，方法是将1 mg SIN-1溶解于500 μl无钙/镁离子的PBS中），再用DPBS和10% FBS稀释至2 ml。
3. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。
4. 从培养箱中取出培养板，用DPBS洗涤两次。
5. 加入210 μl 2.8 mM FeSO₄·7H₂O和210 μl根据上述方法新鲜配制的19.6 mM MGD。
6. 轻轻摇动溶液，然后加入4.6 μl 1.9 mM CaI。
7. 再次轻轻摇动溶液，并在37 °C下孵育36分钟。
8. 收集上清液（425 μl）至一个Eppendorf管中，转移至EPR平面样品池。
9. EPR采集参数如下：微波频率：9.8 GHz；中心磁场：3427 G；调制幅度：6 G；扫描宽度：100 G；接收增益：1 × 10⁵；微波功率：10 mW；总扫描次数：121；扫描时间：10 s；时间常数：20 ms。
10. 记录谱图，并对二维谱图进行积分以降低背景噪声，同时按上述方法进行基线校正。

3. 多形核中性粒细胞（PMNs）中O₂•-的检测

1. 中性粒细胞按照先前所述方法从人血液样本中分离¹⁷。
2. 在含有0.1 mM二乙烯三胺五乙酸（DTPA）的PBS中配制1 M DMPO*储备液。DMPO的熔点为25–29 °C，因此将液态DMPO（25 °C时密度约为1.02 g/ml）移入玻璃小瓶中更为方便（注意：不要使用塑料小瓶称量，因为纯DMPO会与塑料发生反应）。冷冻的DMPO可通过在小瓶上冲淋温水使其融化（注意：不要使用热水，以免DMPO分解）。
3. 必须使用高纯度DMPO（> 99%），因为某些市售的自旋捕获剂含有顺磁性杂质，因此必须单独检测DMPO溶液的EPR谱图（本实验中为10 mM）。关键在于不应出现任何背景信号（见图3A）。
4. 将佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）溶于DMSO中，配制成1 mg/ml的储备液。用PBS将该溶液稀释至10 μg/ml，分装保存。
5. 在1.5 ml离心管中，按以下添加顺序配制总体积为0.6 ml的溶液：每ml含约10⁶个PMN细胞、D-葡萄糖（1 mg/ml）和白蛋白（1 mg/ml）、10 mM DMPO以及0.2 μg/ml PMA。（注意：PMA为自由基激活剂，应最后加入）。
6. 将溶液转移至EPR平头样品管中。
7. EPR采集参数条件如下：微波频率：9.8 GHz；中心磁场：3486 G；调制幅度：0.5 G；扫描宽度：100 G；接收增益：5 × 10⁵；总扫描次数：10；扫描时间：30 s；微波功率：20 mW；时间常数：81 ms。为定量加合物的形成，可使用稳定的氮氧自由基（如TEMPO或3-羧基-PROXYL）建立浓度与信号强度（或面积）之间的标准曲线。

* 关于DMPO使用的注意事项：通过使用扁平细胞，可增加细胞密度，从而增强自旋加合物的信号强度，但O₂⁻的半衰期会缩短₂•-DMPO加合物的寿命较短（t_1/2 ~1 分钟）分解为 DMPO-OH。可使用相同浓度的 EMPO、BMPO 或 DEPMPO 替代 DMPO，这些试剂可商业获得，与 t 形成的加合物稳定性更高_1/2 约8分钟和14分钟。

4. 代表性结果

采用 Fe²⁺-MGD 进行 NO 自由基的自旋捕获。 图 2A 和 2B 显示，Fe²⁺-MGD 或 Fe²⁺-MGD 与 CaI 混合物均未产生 EPR 信号，表明这些试剂不产生 NO 背景信号。经 CaI 刺激后，BAEC 释放 NO，NO 与 Fe²⁺-MGD 反应形成自旋加合物 NO-Fe²⁺-MGD，并呈现特征性的三重峰信号，其超精细分裂常数（hfsc）为 a_N = 12.66 G，g 因子为 g = 2.040（图 2C）。hfsc 值是使用可从 NIEHS EPR 软件数据库网站下载的 WINSIM 模拟程序测定的。实验测得的 hfsc 值与文献报道的 NO-Fe²⁺-MGD 加合物的 a_N = 12.70 G 和 g = 2.041¹⁸ 一致。类似地，SIN-1 对 BAEC 的作用降低了 NO 的生成，这是由于 eNOS 解偶联所致，如 图 2D 所示。

采用DMPO自旋捕获法检测O₂•-。如图3A所示，单独使用DMPO未产生信号，证实该自旋捕获剂不含顺磁性杂质。图3B为仅含DMPO和PMN的谱图，同样未见可检测信号，表明DMPO不会引起NADPH氧化酶的激活。图3C显示了PMA刺激PMN后观察到的EPR信号。该信号的超精细耦合常数测定值为a_N =14.71 G，a_β-H =11.40 G和a_γ-H =1.25 G，与文献报道的DMPO-O₂H加合物的a_N =14.3 G，a_β-H =11.7 G和a_γ-H =1.3 G¹⁹相符。

图 1. 利用 EPR 自旋捕获技术检测中性粒细胞和 BAEC 中自由基的流程图。（A）将 PMN 与 DMPO 和 PMA 混合，随后将混合液转移至 EPR 平板样品池中进行数据采集。（B）在培养板上培养 BAEC，用 DPBS 洗涤。加入自旋捕获剂 Fe(MGD)₂ 和 CaI，充分混匀后孵育。将混合液转移至 EPR 平板样品池中进行 EPR 数据采集。

图2. 从BAEC中检测NO的电子顺磁共振（EPR）结果。（A）仅Fe²⁺-MGD的光谱；（B）Fe²⁺-MGD + CaI的光谱；（C）使用CaI刺激细胞后，Fe²⁺-MGD捕获NO产生的三重峰光谱；（D）细胞经0.5 mM SIN-1处理后NO生成减少的光谱。

图3. 活化中性粒细胞中DMPO-O₂H的电子顺磁共振（EPR）检测。（A）仅10 mM DMPO的谱图。（B）单独PMN在含10 mM DMPO条件下的谱图。（C）PMA活化的PMN在含10 mM DMPO条件下的谱图。

讨论

电子顺磁共振（EPR）自旋捕获技术已广泛应用于多种生物医学领域，用于定量和鉴定自由基。自旋捕获方法具有高度灵敏性，可检测浓度范围为纳摩尔（nM）至微摩尔（μM）的自由基，因此适用于生物系统中的应用。顺磁性加合物NO-Fe的形成²⁺-MGD 是一氧化氮检测的基础 通过 电子顺磁共振。铁²⁺-MGD 与 NO 迅速反应¹⁸ 以约 10 的速率⁶ M^-1 s^-1. NO-Fe²⁺-MGD加合物具有较长的半衰期且高度稳定。事实上，在采集样品后，将含有NO-Fe的溶液于-80 °C冷冻，可在24小时内仍获得EPR谱图²⁺-MGD 在信号强度无明显损失的情况下（未发表结果）。Fe 的缺点²⁺-MGD 对空气敏感，通常需要加入5个或更多摩尔当量的配体至Fe(II)。Fe的氧化²⁺-毫克铁当量（MGD）至铁（Fe）³⁺- 空气中的微生物气溶胶污染（MGD）不可避免且难以控制，然而，在 体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无酚 DMEM 培养基 高糖 1X	GIBCO	31053
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	GIBCO	25200
L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	BP379-100
MEM 非必需氨基酸	GIBCO	11140
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550
内皮生长因子	Millipore	02-102
CaI	Enzo Life Sciences	A-23187	溶于 DMSO
SIN-1	Enzo Life Sciences	BML-CN245-0020
DMPO	Dojindo Laboratories	D048-10
FeSO4·7H2O	Sigma Aldrich	215422-250G	溶于含 Ca 和 Mg 的 PBS
MGD	Enzo Life Sciences	ALX-400-014-M050	溶于含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS
BAEC 细胞	Cell Systems	2B2-C75
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
含 CaCl2 和 MgCl2 的 DPBS	Sigma Aldrich	D8662
佛波酯-豆蔻酸乙酸酯（PMA）	Sigma Aldrich	79346-1MG