使用自旋捕获剂通过电子顺磁共振波谱法检测细胞中的一氧化氮和超氧阴离子自由基 关键词：电子顺磁共振波谱法，自旋捕获，一氧化氮，超氧阴离子，自由基，细胞氧化应激

摘要

采用电子顺磁共振（EPR）波谱法，分别利用二价铁-Ｎ-甲基-Ｄ-葡糖胺二硫代氨基甲酸复合物 Fe(MGD)₂ 和 5,5-二甲基-1-吡咯啉-Ｎ-氧化物 DMPO，检测牛主动脉内皮细胞中的一氧化氮和人中性粒细胞中的超氧阴离子自由基。

摘要

低浓度的活性氮/氧物种（ROS/RNS）在调节细胞功能、信号传导和免疫反应中发挥重要作用，但浓度失控时则会对细胞活力造成损害^{1, 2}。尽管生物体在进化过程中已形成内源性和膳食来源的抗氧化防御机制以调控ROS的生成，ROS仍会作为氧气正常代谢的天然副产物持续产生，并可导致生物分子的氧化损伤，引起蛋白质功能丧失、DNA断裂或脂质过氧化³，最终引发氧化应激，导致细胞损伤或死亡⁴。

超氧阴离子自由基（O₂•-）是生物系统中一些最强氧化性物质（如过氧亚硝酸盐和羟基自由基）的主要前体。O₂•- 的产生标志着氧化爆发的最初信号，因此在生物系统中对其进行检测和/或捕获具有重要意义。在本实验中，O₂•- 由多形核中性粒细胞（PMNs）产生。通过佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐（PMA）的趋化性刺激，PMNs 激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，从而生成 O₂•-⁵。

一氧化氮（NO）合酶存在三种同工酶形式，分别为诱导型、神经元型和内皮型NOS，即iNOS、nNOS和eNOS，可利用NADPH催化L-精氨酸转化为L-瓜氨酸，同时生成NO⁶。本文中，我们由内皮细胞生成NO。在氧化应激条件下，eNOS可能从生成NO转变为生成超氧阴离子（O₂•-），该过程称为eNOS去偶联，被认为是由血红素⁷或辅因子四氢生物蝶呤（BH₄）⁸的氧化所导致。

在生物系统中检测自由基的可靠方法很少，且这些方法在特异性和灵敏度方面存在局限性。电子自旋捕获（spin trapping）常用于自由基的鉴定，其原理是自由基与自旋捕获剂发生加成反应，生成稳定的自旋加合物，该加合物可通过电子顺磁共振（EPR）波谱法进行检测。不同的自由基加合物表现出特征性的谱图，可用于识别所产生的自由基，并可提供关于自由基生成性质和动力学的丰富信息⁹。

环状亚硝基化合物，如5,5-二甲基吡咯啉-N-氧化物（DMPO¹⁰）、磷酸酰基取代的DEPMPO¹¹以及酯基取代的EMPO¹²和BMPO¹³，已被广泛用作自旋捕获剂——其中后者的O₂•-加合物具有更长的半衰期。铁(II)-N-甲基-D-葡糖胺二硫代氨基甲酸盐Fe(MGD)₂因加合物形成速率高且自旋加合物稳定性高，常用于捕获NO¹⁴。

方案

1. 牛主动脉内皮细胞（BAEC）的培养

1. 遵循正确的无菌操作技术。
2. 在水浴中将不含抗生素的培养基加热至 37 °C。

注意：培养基由不含酚红的 Dulbecco 改良必需培养基（DMEM）组成，其中含 4.5 g/L D-葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸，并添加 10% 胎牛血清（FBS）和 2.5 mg/L 内皮细胞生长因子。

3. 从培养箱中取出含有细胞的 T75 培养瓶，在放入生物安全柜前，用 70% 乙醇擦拭瓶体表面。
4. 使用移液器吸除旧培养基，并用 5 ml 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤两次。
5. 加入 2 ml 胰蛋白酶，孵育 4–5 分钟使细胞脱落，期间定期在显微镜下观察细胞状态。
6. 加入 3 ml 培养基，用移液器反复吹打混匀，使细胞充分分散，形成均匀的细胞悬液。
7. 将含胰蛋白酶的 5 ml 培养基转移至 15 ml 离心管中，在 121 g 条件下离心 5 分钟。
8. 用移液器吸除上清液，加入 5 ml DPBS 并充分混匀，随后在 121g 条件下离心 5 分钟。
9. 吸除上清液，加入 6 ml 培养基重悬细胞沉淀。
10. 在 6 孔板中，每孔加入 1....

讨论

电子顺磁共振（EPR）自旋捕获技术已广泛应用于多种生物医学领域，用于定量和鉴定自由基。自旋捕获方法具有高度灵敏性，可检测浓度范围为纳摩尔（nM）至微摩尔（μM）的自由基，因此适用于生物系统中的应用。顺磁性加合物NO-Fe的形成²⁺-MGD 是一氧化氮检测的基础 通过 电子顺磁共振。铁²⁺-MGD 与 NO 迅速反应¹⁸ 以约 10 的速率⁶ M^-1 s^-1. NO-Fe²⁺-MGD加合物具有较长的半衰期且高度稳定。事实上，在采集样品后，将含有NO-Fe的溶液于-80 °C冷冻，可在24小时内仍获得EPR谱图²⁺-MGD 在信号强度无明显损失的情况下（未发表结果）。Fe 的缺点²⁺-MGD 对空气敏感，通常需要加入5个或更多摩尔当量的配体至Fe(II)。Fe的氧化²⁺-毫克铁当量（MGD）至铁（Fe）³⁺- 空气中的微生物气溶胶污染（MGD）不可避免且难以控制，然而，在 体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无酚 DMEM 培养基 高糖 1X	GIBCO	31053
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	GIBCO	25200
L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	BP379-100
MEM 非必需氨基酸	GIBCO	11140
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11550
内皮生长因子	Millipore	02-102
CaI	Enzo Life Sciences	A-23187	溶于 DMSO
SIN-1	Enzo Life Sciences	BML-CN245-0020
DMPO	Dojindo Laboratories	D048-10
FeSO4·7H2O	Sigma Aldrich	215422-250G	溶于含 Ca 和 Mg 的 PBS
MGD	Enzo Life Sciences	ALX-400-014-M050	溶于含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS
BAEC 细胞	Cell Systems	2B2-C75
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
含 CaCl2 和 MgCl2 的 DPBS	Sigma Aldrich	D8662
佛波酯-豆蔻酸乙酸酯（PMA）	Sigma Aldrich	79346-1MG