慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

摘要

本文描述了一种从造血干细胞/祖细胞体外生成成熟人红细胞的 ex vivo 实验方案。此外，我们还介绍了一种高效的慢病毒递送方法，用于在原代红系细胞中敲低转录因子 TAL1。通过表达 GFP 的慢病毒展示了慢病毒介导基因递送的效率。

摘要

红细胞生成是研究细胞分化的常用模型系统。在红细胞生成过程中，多能性成人人类造血干细胞（HSCs）会分化为寡能性祖细胞、定向前体细胞以及成熟的红细胞¹。这一过程在很大程度上由基因表达水平进行调控，特定的转录因子在激活谱系特异性基因的同时，会抑制其他细胞类型特异性基因的表达²。针对调控红细胞生成的转录因子的研究通常使用人和小鼠的细胞系，这些细胞系在一定程度上代表了处于特定分化阶段的红系细胞^3-5。然而，转化的细胞系只能部分模拟红系细胞，更重要的是，它们无法全面研究细胞在向终末红系命运逐步发育过程中所经历的动态变化。因此，当前仍面临一项挑战，即开发一种能够获得足够数量、处于不同分化阶段的相对均一的原代HSCs和红系细胞群体的实验方案，以满足基因组学和蛋白质组学实验的需求。

在此我们描述一种 离体 从脐带血、骨髓或经G-CSF动员的成人外周血（白细胞分离术）中分离的人造血干细胞/祖细胞诱导红系分化的细胞培养方案。该培养体系最初由Douay实验室开发 ⁶，利用细胞因子和间充质细胞的共培养来模拟骨髓微环境。采用这种方法 离体 分化方案中，我们观察到红系祖细胞显著扩增，分化被特异性地诱导至红系谱系，并完全成熟为去核红细胞。因此，该系统为研究造血干细胞沿红系谱系发育过程中转录调控的分子机制提供了良好平台。

在转录水平研究红细胞生成过程，还需要能够在原代红系细胞中过表达或敲低特定因子的能力。为此，我们采用一种慢病毒介导的基因递送系统，该系统可高效感染分裂期和非分裂期细胞⁷。本文结果显示，我们能够高效敲低原代人红系细胞中的转录因子TAL1。此外，GFP表达表明慢病毒感染效率接近90%。因此，本实验方案为解析调控红细胞生成的转录因子调控网络提供了一个极为有效的研究体系。

方案

第一部分 离体 人造血干细胞/祖细胞的红细胞生成

1. 分离 CD34⁺ 人造血干细胞/祖细胞

人类CD34⁺细胞群体包含造血干细胞（HSCs）和早期祖细胞的混合物⁸，可从脐带血、经G-CSF动员的外周血（白细胞单采）或骨髓中获取（图1-步骤1）。若使用脐带血或外周血，请直接进入步骤1.2；若使用骨髓，请从步骤1.1开始。试剂与设备详见表1。

此步骤在无菌条件（即超净台）下进行，除非另有说明，均在室温（RT）下操作。

1. 制备骨髓单细胞悬液：
   1. 用含有 0.02% 胶原酶 B 和 100 U/ml DNase 1 的 RPMI 1640 培养基以 10 倍体积重悬骨髓
   2. 在平衡摇床上轻轻混合45分钟。
   3. 通过30μm尼龙滤网过滤细胞。
2. 通过Ficoll密度梯度离心法分离低密度单个核细胞（MNCs）：
   1. 用含2%胎牛血清（FBS）和2 mM EDTA的PBS稀释血液或骨髓悬液，稀释体积为2-4倍。 注：较大的体积可提高单个核细胞（MNCs）的纯度。<....

讨论

此前已有多种方法用于在培养中诱导红系细胞分化，但效果各异。例如，某些无需在MS-5细胞上共培养的方案虽可实现红系细胞的扩增，但在生成完全成熟且无核的红细胞方面效率较低^12-17。而另一些方法虽能有效促进细胞脱核，却以牺牲细胞增殖为代价^18,19。本研究采用的方法最初由Douay实验室建立⁶，该方法结合了两个步骤：第一步为液体培养，可在红系分化早期延长细胞扩增时间，从而获得大量早期祖细胞（这对于基因组学和蛋白质组学研究至关重要）；第二步为在MS-5间充质细胞上进行共培养，这对于最大化血红蛋白合成以及实现红细胞完全脱核具有重要意义。本方法存在两点局限性：1）在分化最早阶段的扩增程度仍不足，迄今尚无法在蛋白质水平上充分表征早期红系祖细胞；2）该实验方案成本较高，尤其在大规模应用时更为显著。

细胞培养试剂和细胞因子的质量对于 离体 红系分化。值得注意的是，使用BIT（表2）作为血清替代物至关重要。根据我们的经验，使用BIT可消除此前使用分别来源的牛血清白蛋白、胰岛素和转铁蛋白时所出现的批间差异（可能源于试剂.......