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方法文章

慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

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DOI：

10.3791/2813

⸱

2011年7月16日

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

本文内容

摘要

本文描述了一种从造血干细胞/祖细胞体外生成成熟人红细胞的 ex vivo 实验方案。此外，我们还介绍了一种高效的慢病毒递送方法，用于在原代红系细胞中敲低转录因子 TAL1。通过表达 GFP 的慢病毒展示了慢病毒介导基因递送的效率。

摘要

红细胞生成是研究细胞分化的常用模型系统。在红细胞生成过程中，多能性成人人类造血干细胞（HSCs）会分化为寡能性祖细胞、定向前体细胞以及成熟的红细胞1。这一过程在很大程度上由基因表达水平进行调控，特定的转录因子在激活谱系特异性基因的同时，会抑制其他细胞类型特异性基因的表达2。针对调控红细胞生成的转录因子的研究通常使用人和小鼠的细胞系，这些细胞系在一定程度上代表了处于特定分化阶段的红系细胞3-5。然而，转化的细胞系只能部分模拟红系细胞，更重要的是，它们无法全面研究细胞在向终末红系命运逐步发育过程中所经历的动态变化。因此，当前仍面临一项挑战，即开发一种能够获得足够数量、处于不同分化阶段的相对均一的原代HSCs和红系细胞群体的实验方案，以满足基因组学和蛋白质组学实验的需求。

在此我们描述一种 离体 从脐带血、骨髓或经G-CSF动员的成人外周血（白细胞分离术）中分离的人造血干细胞/祖细胞诱导红系分化的细胞培养方案。该培养体系最初由Douay实验室开发 6，利用细胞因子和间充质细胞的共培养来模拟骨髓微环境。采用这种方法 离体 分化方案中，我们观察到红系祖细胞显著扩增，分化被特异性地诱导至红系谱系，并完全成熟为去核红细胞。因此，该系统为研究造血干细胞沿红系谱系发育过程中转录调控的分子机制提供了良好平台。

在转录水平研究红细胞生成过程，还需要能够在原代红系细胞中过表达或敲低特定因子的能力。为此，我们采用一种慢病毒介导的基因递送系统，该系统可高效感染分裂期和非分裂期细胞7。本文结果显示，我们能够高效敲低原代人红系细胞中的转录因子TAL1。此外，GFP表达表明慢病毒感染效率接近90%。因此，本实验方案为解析调控红细胞生成的转录因子调控网络提供了一个极为有效的研究体系。

方案

第一部分 离体 人造血干细胞/祖细胞的红细胞生成

1. 分离 CD34+ 人造血干细胞/祖细胞

人类CD34+细胞群体包含造血干细胞（HSCs）和早期祖细胞的混合物8，可从脐带血、经G-CSF动员的外周血（白细胞单采）或骨髓中获取（图1-步骤1）。若使用脐带血或外周血，请直接进入步骤1.2；若使用骨髓，请从步骤1.1开始。试剂与设备详见表1。

此步骤在无菌条件（即超净台）下进行，除非另有说明，均在室温（RT）下操作。

  1. 制备骨髓单细胞悬液：
    1. 用含有 0.02% 胶原酶 B 和 100 U/ml DNase 1 的 RPMI 1640 培养基以 10 倍体积重悬骨髓
    2. 在平衡摇床上轻轻混合45分钟。
    3. 通过30μm尼龙滤网过滤细胞。
  2. 通过Ficoll密度梯度离心法分离低密度单个核细胞（MNCs）：
    1. 用含2%胎牛血清（FBS）和2 mM EDTA的PBS稀释血液或骨髓悬液，稀释体积为2-4倍。 注：较大的体积可提高单个核细胞（MNCs）的纯度。
    2. 在50 ml锥形管中，小心地将35 ml稀释后的细胞悬液叠加于15 ml Ficoll-paque上。使用水平转子，以400g离心30分钟，离心过程中不启用刹车。
    3. 吸去上层液体，保留中间的单个核细胞层不受干扰。
    4. 将间期层（含单个核细胞）转移至新的50 ml锥形管中。
    5. 加入含2% FBS和2 mM EDTA的PBS至满管，轻轻颠倒混匀，于室温下以300g离心10分钟。弃上清液。
    6. 将细胞沉淀再洗涤两次，以去除血小板。 注意：此步骤可提高CD34的纯度+ 细胞
    7. 取20 μl细胞悬液置于EP管中，加入200 μl红细胞裂解缓冲液（表1），室温孵育2分钟。取18 μl该悬液滴加至血细胞计数板，计数有核的单个核细胞（MNCs）。
    8. MNCs 可立即使用，或在 108 细胞/ml，置于含10% DMSO的细胞培养基中，于液氮中保存。
  3. 分离CD34+ 通过阳性免疫磁珠分选法分离细胞（图1-步骤1）
    我们使用 CD34 微珠试剂盒（包含与单克隆小鼠抗人 CD34 抗体偶联的微珠溶液，以及含有人 IgG 的 FcR 封闭试剂溶液），结合两根 LS Mini-MACS 柱、autoMACS 运行缓冲液和 MiniMACS 分离器（表 1）。以下是我们从 2.3×10⁸ 个单个核细胞开始的实验方案8 单个核细胞。如果使用的细胞数量不同，应相应地调整体积。此外，对于最多2×108 MNCs 可使用 MS MiniMacs 柱替代 LS MiniMacs 柱。
    保持细胞和试剂处于低温（4–8°C），以防止细胞表面抗体发生帽化及非特异性细胞标记。
    1. 重悬含有 2.3x10⁶ 细胞的细胞沉淀8 将MNCs加入690 μl洗脱缓冲液中（每108个MNCs需300 μl，最小悬浮体积为300 μl），转移至15 ml锥形管中。
    2. 加入230 μl FcR封闭试剂
    3. 加入230 μl CD34 MicroBeads溶液。
    4. 用手充分混匀，于 4°C 孵育 30 分钟。
    5. 加入10 ml Running Buffer重悬细胞，300g离心10 min。
    6. 完全吸除上清液。
    7. 将细胞重悬于1.2 ml洗脱缓冲液中（每10⁷个细胞使用0.5 ml缓冲液）8 单核细胞 (MNCs) 注意：在进行磁分离之前，必须获得单细胞悬液。必要时，可通过30μm尼龙滤网过滤细胞，以去除细胞团块。
    8. 将LS柱置于MiniMACS分离器的磁场中以进行准备。
    9. 用3 ml 运行缓冲液冲洗层析柱。
    10. 将1.2 ml细胞悬液加入柱中。
    11. 收集流穿液，并用其检测CD34的得率和纯度+ 细胞分离。或者，将此组分中的细胞冷冻并保存在液氮中。 注：该组分包含未标记的细胞，也可能含有部分标记的 CD34+ 未贴附于柱上的细胞。
    12. 用 3 ml 洗脱缓冲液洗涤柱子三次，合并洗涤液，并像上述穿流组分一样使用该组分。
    13. 将柱子从磁铁上取下，置于一个15 ml聚丙烯收集管上。
    14. 为洗脱细胞，向柱中加入 5 ml 流动缓冲液，并立即冲洗出标记的 CD34+ 通过将柱塞 firmly 推入层析柱，使细胞充分贴附。
    15. 使用新制备的LS柱重复柱层析纯化步骤（步骤h至n）。 注：这可以提高 CD34 的纯度+ 细胞。从 2.3×10⁶ 个细胞的悬液中8 通过白细胞分离术获得的单个核细胞（MNCs），我们通常可得到1.1×10⁹个6 CD34+ 细胞纯度 > 95±3%（图1-步骤1）。
    16. 在含有10% DMSO的培养基中冷冻细胞，并置于液氮中保存，或直接进入步骤2）。

2. 细胞培养中的红系分化

CD34+ 细胞在添加了补剂的IMDM培养基中培养，并根据改编自文献6的四步法方案（图1-步骤2）依次加入氢化可的松和特定组合的细胞因子。在整个培养过程中进行一系列检测，以验证细胞生长和红系分化情况。

启动培养所需的CD34+细胞数量因实验规模而异。通常情况下，进行基因表达研究时，我们采用小规模培养，起始细胞量为0.1×106个CD34+细胞，接种于10 ml培养基中，并在操作过程中通过冻存多余细胞来维持较小的培养体积。对于需要提取蛋白质的研究，则需进行更大规模的培养。本文描述了一项大规模实验，起始使用约7×106个来自白细胞分离术的CD34+细胞。
整个操作过程均需保持无菌条件。试剂信息见表1、表2和表3。

  1. 准备试剂
    1. 按照表2所述配制添加补充物的IMDM培养基，并分装成每份40 ml，于-20°C冻存（可预先制备）。
    2. 按照表3所述配制氢化可的松和细胞因子的储备液。
  2. 步骤1：第0-11天
    造血细胞在添加了氢化可的松（HC）、干细胞因子（SCF）、白细胞介素3（IL-3）和促红细胞生成素（EPO）的IMDM培养基中培养（表3）。MS-5小鼠骨髓基质细胞（表1）在此期间扩增，以准备进行第2步。
    • 第0天：
      1. 预热120 ml添加物补充的IMDM培养基，并加入HC、SCF、IL-3和EPO（表3）。
      2. 解冻 7x106 CD34+ 将冻存管置于37°C水浴中，解冻细胞。细胞仍处于冷冻状态时，加入1 ml预热的培养基，将细胞转移至15 ml锥形管中。用2 ml培养基洗涤冻存管，一并转移至15 ml锥形管。
      3. 向细胞悬液中加入6 ml培养基，通过倒置试管混匀，然后在200 g下离心5分钟。
      4. 吸弃上清液，并将细胞沉淀重悬于10 ml新鲜培养基中。
      5. 使用血细胞计数板对细胞悬液与 10 μl 台盼蓝溶液（表 1）混合后的 10 μl 混合液进行活细胞计数。 注意：解冻过程中细胞死亡率约为 25%，因此活细胞浓度应约为 0.5×106 细胞/毫升
      6. 保留约 3 ml 细胞悬液用于检测（参见第 6 段）。
      7. 将剩余的7 ml转移至T-175培养瓶中，并加入63 ml培养基，使总体积为0.05×106 细胞/ml 加至 70 ml 中，将培养瓶置于 37°C 培养箱内。
    • 第1天：
      1. 预热85 ml MS-5细胞培养基：含Glutamax的αMEM（表1），10% FBS，以及100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。
      2. 准备三个150 mm × 25 mm的圆形培养皿，每个培养皿中接种2×10⁶个细胞。6 MS-5 细胞加入 25 ml 培养基中，以获得 0.08x106 细胞/毫升，并置于37°C培养箱中。 注意：使用低代次（low passage）细胞可获得最佳结果。<20) MS-5 细胞。使用含 0.05% EDTA 的胰蛋白酶每三天按 1:5 比例传代一次，以扩增汇合培养的细胞。
    • 第2天：
      1. 用台盼蓝计数造血细胞以排除死细胞，并收集检测所需的细胞（例如约20 ml培养物）（见第6段）。 注意：根据我们的经验，在前两天内，细胞死亡率可能超过30–50%，因此最终的细胞浓度通常接近第0天的浓度（图2）。
      2. 更换MS-5培养基，加入25 ml新鲜培养基，确保去除未贴壁的MS-5细胞。
    • 第4天：
      1. 用台盼蓝计数造血细胞以排除死细胞，并收集检测所需的细胞（例如约10 ml培养物）（见第6段）。 注意：此时细胞应已开始增殖 >约0.2×10⁶个/mL浓度下75%的活细胞6 细胞/毫升。细胞可在 1-2×10⁶ 细胞/毫升的浓度下冻存。6 在含有10% DMSO的补充IMDM培养基中，以cell/ml浓度保存于液氮中。
      2. 将剩余的约 40 ml 培养物转移至 T-175 培养瓶中，并加入足量含有 HC、SCF、IL-3 和 EPO 的补充 IMDM 培养基（表 3），使最终体积达到 150 ml。 注：细胞浓度应约为 0.05x106 细胞/毫升
      3. 使用0.05% EDTA胰蛋白酶将处于60-70%融合状态的MS-5细胞按1:5比例传代至新的150 mm × 25 mm圆形培养皿中。最终细胞浓度应约为0.08×10⁶/mL。6 细胞/毫升 注：通常情况下，一个培养皿可扩增5倍，因此应获得约15个MS-5细胞培养皿，细胞密度约为0.08×10⁶个/皿。6 细胞/毫升
    • 第6天：
      1. 用台盼蓝计数造血细胞以排除死细胞，并收集检测所需的细胞数量（例如约5 ml培养物）（参见第6段）。 注：细胞处于高度增殖阶段，细胞浓度应维持在 ≤1.5×10⁶ 个/mL。6 细胞/毫升。如果细胞浓度过高，则加入含有HC、SCF、IL-3和EPO的新鲜添加培养基IMDM。
    • 第7天：
      1. 用台盼蓝计数造血细胞以排除死细胞。 注：根据我们的经验，细胞通常在第 3 天达到 1.5×10⁶ 个/mL 的密度。6 细胞/毫升，第7天
      2. 加入足够的培养基以维持细胞浓度约为 ~0.8x106 细胞/毫升 注意：我们通常加入100 ml含有HC、SCF、IL-3和EPO的新鲜添加IMDM培养基，以获得约245 ml细胞悬液，细胞密度约为0.8×10⁶/mL。6 细胞/毫升
      3. 将处于60-70%融合度的MS-5细胞用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化后，按1:5比例传代至T-175培养瓶（而非培养皿）中进行扩增。最终细胞浓度应约为0.08×10⁶ cells/mL。6 细胞/毫升 注：61个MS-5细胞培养瓶，每瓶细胞密度约为0.08×10⁶6 应制备细胞浓度为 cell/ml 的悬液。将剩余的 MS-5 细胞冻存，并置于液氮中保存。
    • 第8天：
      1. 用台盼蓝计数造血细胞以排除死细胞，并收集测试所需的细胞数量（例如，约5 ml培养物）（参见第6段）。 注：细胞密度应约为 ~1x106 细胞/毫升
      2. 预热2升仅含SCF和EPO的IMDM完全培养基（见表2和表3）。
      3. 收获200 ml造血培养物（含有约200×10⁶个细胞）6 细胞），在200 g下离心10分钟，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于40 ml含有SCF和EPO的补充IMDM培养基中。
      4. 将细胞悬液分装至8个T-175培养瓶中（每瓶5 ml），并向每瓶中加入245 ml含SCF和EPO的IMDM完全培养基。 注：我们现在有8个烧瓶，每个烧瓶中含有250 ml细胞，细胞密度为0.1×10⁶/mL。6 细胞/毫升
      5. 第8天剩余的细胞（约40 ml）可冷冻保存于1-2×10⁶ cells/ml6 在含有10% DMSO的补充IMDM培养基中，以cell/ml浓度保存于液氮中。
    • 第10天：
      1. 用台盼蓝计数造血细胞以排除死细胞，并收集检测所需的细胞数量（例如约5 ml培养物）（参见第6段）。 注：细胞密度应约为 ~1x106 细胞/毫升
  3. 步骤2：第11-15天
    约一半的细胞被收获以备后续使用（如核提取）。剩余的红系细胞在添加了促红细胞生成素（EPO）的改良IMDM培养基中与MS-5细胞共培养（表2和表3）。红系细胞必须每3至4天转移至新的MS-5细胞层。
    • 第11天：
      1. 用台盼蓝计数红细胞以排除死细胞。 注：细胞密度应约为 ~1.5x106 细胞/毫升
      2. 预热1升1×PBS、400毫升添加补充物的IMDM培养基以及5升含促红细胞生成素（EPO）的补充IMDM培养基（见表2和表3），温度为37°C。
      3. 保留相当于 15x10 的培养物体积8 细胞（例如，约4个250 ml的培养瓶）并继续进行步骤e。
      4. 剩余细胞（例如 15x108) 收集到锥形管中，于450 g离心10分钟，弃上清，用含0.1 mM DTT的预冷MS30缓冲液（表5）重悬，每108 细胞/毫升，经液氮速冻后于 -80°C 保存，以备后续使用（如核提取物制备）。
      5. 用 20 ml 1×PBS 洗涤 50 个汇合的 MS-5 细胞培养瓶，每个培养瓶立即加入 80 ml 含 EPO 的新鲜添加物补充的 IMDM 培养基。 注意：由于培养瓶数量较多，我们每次处理4个培养瓶。具体而言，从培养箱中取出4个汇合度达到的MS-5细胞培养瓶，用1×PBS洗涤，加入80 ml培养基，然后将培养瓶放回培养箱。待所有培养瓶均完成处理并放回培养箱后，继续进行步骤f。由于大规模操作涉及大量培养瓶，建议由两人同时协作完成这些步骤。
      6. 离心相当于15×10⁶个细胞8 在4个锥形管中，以450 × g离心10分钟，收集红系细胞，并弃去上清液。
      7. 用100 ml含补充物的IMDM培养基分别洗涤4个细胞沉淀。
      8. 将每个细胞沉淀重悬于250 ml含EPO的补充IMDM培养基中，取20 ml该细胞悬液加入含有MS-5细胞和80 ml培养基的50个培养瓶中。 注意：此步骤时，应有50个装有100 ml红系细胞的培养瓶，其中MS-5细胞已长满，红系细胞密度为0.3×10⁶/mL。6 细胞/毫升
      9. 使用0.05% EDTA胰蛋白酶将剩余的11个MS-5细胞培养瓶按1:5比例传代至T-175培养瓶中。最终细胞浓度应约为0.08×10⁶ cells/mL6 细胞/毫升 注：约 0.08×10⁶ 个 MS-5 细胞，共 55 个培养瓶6 应准备细胞浓度为 cell/ml 的细胞悬液。
    • 第12天：
      1. 用台盼蓝计数红系细胞以排除死细胞，并收集检测所需的细胞数量（即约4 ml培养物）（见第6段）。 注意：细胞密度应约为 0.6x106 细胞/毫升
    • 第14天：
      1. 用台盼蓝计数红细胞以排除死细胞，并收集测试所需的细胞数量（例如，约 3 ml 培养物）（参见第 6 段）。 注意：细胞密度应约为 0.9x106 细胞/毫升
  4. 第3步：第15-18天
    部分细胞被收获以供后续使用（例如核提取）。剩余的红系细胞在添加了补剂的IMDM培养基中与MS-5细胞共培养，不添加细胞因子。
    • 第15天：
      1. 用台盼蓝计数红细胞以排除死细胞。 注：细胞密度应为 ~1x106 细胞/毫升
      2. 将1升1×PBS和5升添加物补充的IMDM培养基（表2）在37°C预热。
      3. 预留相当于 10x10 的培养物体积8 细胞（例如，约10个100 ml的培养瓶）并继续进行步骤e。
      4. 剩余细胞（例如 40x108) 收集后重悬于含 0.1 mM DTT 的冷 MS30 缓冲液（表 5）中，以供后续使用（见第 2 步：第 11 天步骤 d）。
      5. 用 20 ml 1×PBS 洗涤 50 个汇合的 MS-5 细胞培养瓶，每个培养瓶立即加入 80 ml 新鲜的含补充物的 IMDM 培养基。
      6. 离心相当于10×10的样本8 在4个锥形管中，以450 × g离心10分钟，收集红系细胞，并弃去上清液。
      7. 用100 ml含补充物的IMDM培养基洗涤4份细胞沉淀。
      8. 将每个细胞沉淀重悬于250 ml含补充物的IMDM培养基中，并将20 ml该细胞悬液分别加入含有MS-5细胞和80 ml培养基的50个培养瓶中。 注意：在此步骤中，应获得50个装有汇合MS-5细胞的培养瓶，每个培养瓶中含有100 ml红系细胞，细胞密度为0.2×10⁶ cells/ml。6 细胞/毫升
      9. 使用0.05% EDTA胰蛋白酶将剩余的5个MS-5细胞培养瓶按1:5比例接种至T-175培养瓶中进行扩增。最终细胞浓度应约为0.08×10⁶ cells/mL。6 细胞/毫升 注：20 个 MS-5 细胞培养瓶，每瓶细胞密度约为 0.08×10⁶/mL6 应制备细胞浓度为 cell/ml 的悬液。将剩余的 MS-5 细胞冻存，并置于液氮中保存。
    • 第16天：
      1. 用台盼蓝计数红系细胞以排除死细胞，并收集检测所需的细胞数量（例如，约 4 ml 培养物）（见第 6 段）。 注意：细胞密度应约为 0.6x106 细胞/毫升
  5. 第4步：第18-26天
    红细胞被浓缩3-4倍，以获得5-7×106 细胞/ml 终浓度，并在 MS-5 细胞层上维持培养以促进成熟。在补充的 IMDM 培养基中添加 10% FBS，以更好地保存体外培养的红细胞（cRBCs）。
    • 第18天：
      1. 用台盼蓝计数红细胞以排除死细胞，并收集测试所需的细胞数量（即约 2 ml 培养物）（参见第 6 段）。 注：细胞密度应约为 1.7x106 细胞/毫升
      2. 将 300 ml 1×PBS 和含 10% FBS 的 1.5 L 添加剂 IMDM 培养基（表 2）在 37°C 预热。
      3. 用 20 ml 的 1×PBS 冲洗 15 个长满 MS-5 细胞的培养瓶，每个培养瓶立即加入 80 ml 新鲜的含补充物的 IMDM 培养基。
      4. 离心红系细胞（即相当于85×10⁶个细胞）8 在450 g下离心10分钟，收集细胞，合并沉淀物并分装至4个锥形管中。
      5. 将每个细胞沉淀用含有10% FBS的75 ml补充IMDM培养基重悬，并将20 ml该细胞悬液分别加入含有MS-5细胞和80 ml培养基的15个培养瓶中。 注意：此步骤中，应有15个含有红系细胞的MS-5细胞培养瓶，每瓶含100 ml红系细胞，细胞密度为6×10⁶个/ml6 细胞/毫升
      6. 使用0.05% EDTA胰蛋白酶将剩余的5瓶MS-5细胞按1:5比例传代至T-175培养瓶中。最终细胞浓度应约为0.08×10⁶ cells/mL。6 细胞/毫升 注：约20瓶MS-5细胞，密度约为0.08×10⁶6 应制备细胞浓度为 cell/ml 的悬液。将剩余的 MS-5 细胞冻存，并置于液氮中保存。
    • 第20天：
      1. 用台盼蓝计数红细胞以排除死细胞，并收集检测所需的细胞数量（即约1.5 ml培养物）（见第6段）。 注意：细胞密度维持在约 1.5×10⁶ 个/mL6 细胞/毫升
    • 第22天：
      1. 用台盼蓝计数红细胞以排除死细胞，并收集检测所需的细胞数量（即约 1.5 ml 培养物）（见第 6 段）。 注意：细胞密度维持在约 1.5x106 细胞/毫升
      2. 更换培养基，并将红系细胞转移至新的MS-5细胞层，操作同第18天所述。
    • 第24天：
      1. 用台盼蓝计数红细胞以排除死细胞，并收集检测所需的细胞数量（例如约1.5 ml培养物）（见第6段）。 注意：细胞密度维持在约 1.5x106 细胞/毫升
    • 第26天：
      1. 用台盼蓝计数红细胞以排除死细胞，并收集检测所需的细胞数量（即约 1.5 ml 培养物）（参见第 6 段）。 注：细胞密度维持在约 1.5x106 cell/ml
      2. 收获非黏附性去核且完全血红蛋白化的cRBCs。 注：成熟的cRBC可在SAGM培养基（MacoPharma）中于4°C保存长达一个月。
  6. 测试与代表性结果
    以下检测在指定时间点进行，以验证细胞增殖和红系分化是否正常。图中所示代表性结果使用 CD34+ 从白细胞分离术中分离的细胞
    1. 每两天对细胞进行一次计数。细胞增殖的代表性结果见图2。
    2. 每隔一天使用0.05 x10进行May-Grünwald Giemsa形态学染色6 细胞培养第0至8天及0.2×106 按照吉姆萨染色剂制造商的说明（表1），对其他时间点的细胞进行处理。代表性结果见图3。
    3. 半固体实验从第0天到第12天每两天进行一次，用于检测造血祖细胞，每个样本设两个重复，使用0.01×106 每个实验的细胞数量，按照甲基纤维素半固体培养基（Methocult）生产商的说明书进行操作（表1）。代表性结果见图4。
    4. 每两天通过流式细胞术（FACS）分析以下细胞标志物：CD34、CD36、CD71、GPA、LDS，使用 0.2 × 106 每次检测使用细胞数见图5中的代表性结果。
    5. 每两天通过联苯胺染色法测定血红蛋白。结果示例见图5。
    6. 通过从1x10⁶个细胞中提取RNA后，采用RT-qPCR或微阵列技术研究基因表达。6 细胞。参见图6B的代表性结果。

结果评论：

图1概述了人CD34+细胞体外分化为成熟、含血红蛋白红细胞的实验方案。在红系分化过程中，细胞具有高度增殖能力，如图2所示，使用白细胞分离术获得的CD34+细胞可实现约8,000倍的扩增。从骨髓中分离的CD34+细胞增殖能力略低，扩增倍数约为6,000倍，而从脐带血中分离的CD34+细胞则可达到50,000倍的扩增。处于特定分化阶段的细胞表现出可识别的大小和形态，如图3所示。注意分化末期自第20天开始出现的去核过程。至第26天，所有细胞均已失去细胞核（图3）。

图4所示的集落形成实验用于检测分化最初几天（第0天至第8天）的早期和晚期造血祖细胞。除了红系祖细胞（CFU-E和BFU-E）外，我们注意到在第0天的早期CD34+细胞中，粒细胞-巨噬细胞祖细胞（CFU-GM）也占有显著比例。随着分化进行，CFU-GM显著减少，在第6天时已完全被红系祖细胞BFU-E和CFU-E所取代。此外，从第4天到第6天，早期红系祖细胞BFU-E逐步被其更分化的子代细胞CFU-E所替代。到第10天时，红系细胞基本丧失了集落形成能力。

最后，通过细胞表面标志物的表达来监测红细胞生成，如图5所示。注意：1）造血干细胞/祖细胞标志物CD34逐步减少；2）祖细胞标志物CD36逐步出现并随后减少；3）红系祖细胞和网织红细胞标志物CD71逐步出现并随后减少；4）红系前体细胞和红细胞标志物GPA表达逐渐增加。其他红系分化标志物包括从第8天开始的血红蛋白合成（通过联苯胺染色检测，见图5）以及从第20天开始的细胞去核现象，后者通过DNA染料LDS染色的丢失来测定（图5）。最后，红系分化还可通过分子标志物的RT-qPCR检测进行评估，例如转录因子TAL1（图6B）或β-珠蛋白基因（数据未显示）。

通常，1 ml 脐带血 / 白细胞单采液 / 骨髓可提供 0.35×105 / 0.5×105 / 1.1×105 个 CD34+ 细胞，理论上可分别以 50,000 / 8,000 / 6,000 的增殖倍数产生 1.7×109 / 0.4×109 / 0.7×109 个红细胞。若要在分化过程结束时获得 50×106 个红细胞，大约需要 50 ml 培养基。

第二部分：慢病毒介导的离体红系分化过程中的基因敲低

慢病毒是将基因导入人原代细胞的首选工具（例如参见 Amsellem 等人9）。 慢病毒常通过递送靶向的短发夹 RNA（shRNA）来实现原代细胞中目的基因的敲低（例如参见 Laurenti 等人10）。在本方案中，我们以人原代红系细胞中的转录因子 TAL1 为靶点。使用一段序列随机、不对应任何已知基因的 shRNA 作为阴性对照。通过检测 GFP 表达来评估转导效率。

1. 慢病毒载体颗粒的制备

为了获得慢病毒颗粒，将人胚胎肾293T细胞与三种质粒共转染：其中一种包含第二代病毒包装系统，编码除env、vpr、vif、vpu和nef以外的HIV-1基因（即psPAX2）；另一种编码水疱性口炎病毒G蛋白假型包膜（即pMD2G）；第三种为慢病毒载体，编码目的基因（即编码TAL1 shRNA的pBLOCK-it6-DEST(shTal1)、编码随机shRNA的pBLOCK-it6-DEST(shScr)，或编码GFP的pWPIP）（表4）。慢病毒颗粒从转染后的293T细胞培养上清中收集。

为避免细胞发生非预期感染，我们所有慢病毒实验（包括病毒制备和感染）均在独立的生物安全柜中进行，与其他细胞培养操作分开。此外，慢病毒产生的废弃物也需单独处理。本方案中所述的第二代慢病毒不具备复制能力，应作为生物安全二级（Biosafety Level 2）生物体处理。部分机构可能对慢病毒有特定的安全操作规程，建议您遵循所在机构已建立的相关指南。

本文所述方案可提供足量的慢病毒颗粒，用于感染100万至200万个处于任何分化阶段的原代红系细胞。若需扩大或缩小实验规模，应相应调整体积。有关试剂信息，请参见表4和表5。

  1. 使用磷酸钙法转染293T细胞
    1. 转染前一天，接种 13.2 x 106 在15 cm细胞培养皿中，将293T细胞培养于20 ml含10% FBS和青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基中。 注意：这应使细胞在转染当天达到70%融合度。使用低代次（<20) 293T 细胞
      可选： 培养皿可用I型胶原或聚-L-赖氨酸包被，以增强293T细胞的贴附。
    2. 转染前2小时，吸去293T细胞的培养基，轻轻加入20 ml预热至37°C的新鲜培养基。 注：我们通常在当天快结束时开始转染。
    3. 在5 ml离心管中混合以下试剂：
      • 44.8 μg 目的基因表达载体（例如 shRNA 或 GFP，参见表4）
      • 13.35 μg pMD2.G 包膜载体
      • 33.48 μg psPAX2 包装载体
      • 加入足够的无菌 H2O 以定容至 1.116 ml。
    4. 加入足够的无菌 H2O，使终体积达到 1.116 ml。
    5. 加入 109.8 μl CaCl2 2.5 M，涡旋混匀。
    6. 在50 ml锥形管中，加入1.116 ml的2xHBS缓冲液（表5）。
    7. 在持续涡旋振荡条件下，将DNA混合物逐滴加入2xHBS缓冲液中。
    8. 室温下静置20分钟（不超过30分钟），使沉淀形成。
    9. 将2.3 ml溶液逐滴加入含有293T细胞的培养皿中，轻轻混匀，然后将细胞转移至37°C培养箱中孵育12-14小时。
    10. 第二天清晨，吸除培养基，更换为 20 ml 新鲜的 37°C 预热培养基。
  2. 慢病毒收获与浓缩
    1. 转染48小时后，收集含有慢病毒的20 ml培养基，置于50 ml锥形管中。
    2. 向293T细胞中加入20 ml预热至37°C的培养基，然后放回培养箱。
    3. 以 450 × g 离心病毒上清液 10 分钟，去除细胞碎片，转移至新的 50 ml 离心管中。或者，也可将上清液通过 0.45 μm 滤器过滤。将澄清后的上清液于 4°C 保存。
    4. 24小时后，收集剩余的20 ml培养基。 注：我们发现两次收获物中的病毒滴度大致相当，即 1x 106 TU/ml
    5. 为浓缩病毒，将病毒上清液分装至Beckman OptiSeal管中（每管32.4 ml上清液），使用摆动转子在4°C条件下于100,000g离心1.5小时。 注意：浓缩病毒上清液的替代方法包括在47,000 g下离心2小时，或在3,000 g下离心8小时。浓缩前切勿冷冻病毒，冷冻会导致蛋白质沉淀，使病毒难以重悬。
    6. 超速离心后，立即使用10 ml塑料移液管缓慢吸出上清液并弃去。注意：操作时需小心，避免扰动可能容易从管壁脱落的沉淀物。弃去前5 ml上清液后，通常可剪去超速离心管顶部，以帮助尽可能彻底地移除上清液，即仅在管底保留约100–200 μl的液体。
    7. 加入100 μl 1×PBS，室温静置30分钟使沉淀溶解，然后通过上下吹打15–20次重悬。 注：通常情况下，我们可获得约 200–300 μl 的浓缩病毒液。
    8. 浓缩的慢病毒制剂使用Invitrogen公司的Block-it慢病毒RNAi表达系统方案，在NIH3T3细胞上进行滴定。 注：我们通常获得的病毒滴度为 2 至 10×108 转导单位（TU）/毫升
    9. 病毒现在可用于感染实验（参见第2段），或分装后于-80°C保存，最长可保存6个月。 注意：病毒悬液避免经历超过一次的冻融循环。病毒在37°C下可稳定保持4-5小时，在室温下可稳定2-3天，在4°C下可稳定一周。

2. 用于基因递送的慢病毒感染原代红系细胞

  1. 感染
    只要使用较高的感染复数（MOI，50–100），有核红系细胞在分化的任何阶段均可被高效感染。 本文描述了一个典型实验：在红系细胞分化第8天和第9天时，使用表达TAL1 shRNA或乱序对照shRNA的慢病毒进行感染，MOI为50 TU/细胞。每24小时提取RNA，通过RT-qPCR检测TAL1基因敲低（KD）水平。同时通过FACS平行检测GFP表达，以评估感染效率（见图6的代表性结果）。
    • 第0天：
      1. 准备三个15 ml锥形管，每管含1×106个红系细胞（即一管用于TAL1基因敲低，一管用于乱序阴性对照，一管用于GFP表达对照）。
      2. 用5 ml含SCF和EPO的补充IMDM培养基（见第一部分）洗涤细胞，200 g离心5分钟，尽可能去除上清液。
      3. 向浓缩的病毒溶液中加入polybrene（表4），终浓度为40 μg/ml。
      4. 向每管红系细胞中加入100 μl含polybrene的浓缩病毒液（即5×107 TU）。
      5. 在37°C培养箱中孵育1小时，每10分钟轻弹管壁混匀。注：感染应在最小体积的培养基中进行，以促进慢病毒最大程度吸附至细胞表面。此外，每10分钟混匀一次可确保病毒在细胞间均匀分布。
      6. 向每管中加入900 μl含SCF和EPO的补充IMDM培养基（表2和表3）。
      7. 将各样本转移至6孔板中，置于37°C培养箱中继续培养24小时。
    • 第1天：将细胞分别收集至15 ml离心管中，200 g离心5分钟，弃上清，重复感染步骤（同上述b至g步骤）。
    • 第2天：洗涤细胞，以0.2×106个细胞/ml的密度重悬于含SCF和EPO的补充IMDM培养基中，后续操作同第一部分。
  2. 代表性结果
    图6A展示了对原代红系细胞进行慢病毒感染后提取RNA的实验流程。在一个实验中，我们使用表达靶向转录因子TAL1的shRNA或乱序对照shRNA的慢病毒感染原代红系细胞11。图6B显示，我们在原代红系细胞中成功将TAL1转录本水平降低了75%。同时请注意，在乱序对照组中，TAL1转录本水平从第9天到第12天逐渐升高，这凸显了该转录因子在红系分化过程中的重要作用。在另一项实验中，我们使用表达GFP蛋白的慢病毒感染红系细胞。图6C显示，感染后三天，大多数红系细胞（87%）在显微镜下通过荧光观察及FACS检测均显示GFP表达，表明在原代红系细胞中实现了高效感染。我们此前在第0天对CD34+细胞进行类似感染也获得了相近的感染效率（数据未显示）。影响原代细胞高效转导的最重要参数是使用高MOI（即浓缩的慢病毒）。若使用低MOI（即未浓缩病毒），转导效率将显著下降。

3. 代表性结果

CD34+造血干细胞阳性分离示意图；免疫磁珠分离，无血清红系分化。
图1. 人原代造血干/祖细胞的分离及体外红系分化实验流程。（步骤1） 采用阳性免疫磁珠分离法从脐带血、骨髓或经G-CSF动员的人外周血（白细胞单采术获取）中分离CD34+细胞（纯度为95 ± 3%）。（步骤2） 将CD34+细胞按照所示的四步液体培养方案进行体外培养。

Cell amplification graph; log scale; days of culture vs. cell growth trend analysis.
图2. 细胞扩增过程中的 离体 红系分化方案 结果以对数尺度表示。使用 CD34 获得的代表性结果+ 从白细胞分离术中分离的细胞

红细胞生成阶段示意图，显微镜图像追踪红细胞在26天内的发育过程。
图3. 体外红系分化过程中的细胞形态学分析。 在分化过程中指定时间点，使用May-Grünwald-Giemsa染色剂对细胞进行染色（放大倍数×40）。HSC：造血干细胞/祖细胞；BFU-E：红系爆式集落形成单位；CFU-E：红系集落形成单位；Pro EB：原红细胞；Baso EB：嗜碱性成红细胞；Poly EB：多染性成红细胞；Ortho EB：正染色性成红细胞；RET：网织红细胞；RBC：红细胞。

半固体培养法图表；祖细胞生长 CFU-GM、BFU-E、CFU-E；细胞培养天数；图像对比。
图 4. 集落形成细胞（CFC）检测法用于检测和定量造血祖细胞。 在指定时间点，将 104 个细胞接种于含有重组人细胞因子的半固体甲基纤维素培养基中：rh SCF、rh GM-CSF、rh G-CSF、rh Il-3、rh EPO，以支持红系祖细胞（BFU-E 和 CFU-E）及粒细胞-巨噬细胞祖细胞（CFU-GM）的最佳生长。BFU：爆式集落形成单位；CFU：集落形成单位。图中还展示了典型的 BFU-E 和 CFU-E 图像。注意 BFU-E 和 CFU-E 因血红蛋白化而呈现红褐色。

Hematopoietic differentiation graphs showing cell markers CD34, CD36, CD71, GPA, Benzidine, LDS over time.
图5. 造血/红系标志物在分化过程中的动力学变化 离体 红系分化 在指定时间点，加入2x105 细胞经收集后，通过流式细胞术（CD34、CD36、CD71、GPA 和 LDS）或显微镜检查（联苯胺染色）分析所示标志物的表达。柱状图表示阳性细胞的百分比。 CD34 跨膜糖蛋白，存在于人类造血干细胞/祖细胞上； CD36血小板反应蛋白受体，存在于祖细胞上； CD71转铁蛋白受体，存在于红系祖细胞和网织红细胞上； GPA：存在于红系前体细胞和红细胞上的血型糖蛋白A； 联苯胺 血红蛋白染色； LDS： 激光染料苯乙烯基，DNA染色剂。

慢病毒shRNA感染时间线、TAL1 mRNA表达柱状图、GFP显微镜图像、流式细胞术结果
图6. 慢病毒介导的人原代嗜碱性成红细胞基因转移。(A) 利用慢病毒基因递送系统在原代嗜碱性成红细胞中诱导TAL1基因敲低（KD）的时间线。(B) TAL1基因敲低由慢病毒递送的抗Tal1 shRNA（TAL1 KD）或乱序对照shRNA（Scr）介导。通过RT-qPCR检测TAL1 mRNA转录水平的动力学变化。TAL1转录水平相对于18S RNA进行归一化表达。(C) 慢病毒递送的GFP通过显微镜（左图）或流式细胞术（FACS，右图）检测。87%的细胞呈GFP阳性。

4. 材料

试剂来源目录编号
RPMI 1640 SigmaR8758
胶原酶 BRoche Applied Science11088807001
DNase ISigmaD5025-15KU
预分离滤器（30μm 尼龙筛网）Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
EasySep 10x 红细胞裂解缓冲液StemCell Technologies20120
CD34 微珠试剂盒Miltenyi Biotec Inc130-046-703
LS Mini-Macs 柱Miltenyi Biotec Inc130-042-401
autoMACS 运行缓冲液 - MACS 分离缓冲液Miltenyi Biotec Inc130-091-221
MiniMACS 分离器Miltenyi Biotec Inc130-042-102
小鼠骨髓基质细胞 MS-5（定期检测支原体污染）DSMZACC 441
台盼蓝溶液（0.4%）SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
胰蛋白酶 0.05%/EDTAThermoScientific J101521
瑞氏-吉姆萨染色液（May Grunwald Giemsa）Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
人细胞集落形成细胞（CFC）甲基纤维素培养基（Methocult）检测StemCell Technologies 04044

表1.

组分储存液体积 600 ml
IMDMSigma I3390443.4 ml
青霉素-链霉素 1% (vol/vol)Gibco 103786ml
L-谷氨酰胺 4×10-3M200mM (Gibco 25030)12 ml
肌醇 40μg/ml4mg/ml (Sigma I5125)
配制方法：将 28 mg 粉末溶解于 7 ml IMDM 中，过滤除菌，4°C 下可稳定保存 1 周。		6ml
叶酸 10μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
配制方法：将 7 mg 粉末溶解于预热的 7 ml IMDM 中，过滤除菌，4°C 下可稳定保存 1 周。使用前需预热。		6ml
单硫代甘油 1.6×10-4M0.16M (Sigma M6145)
配制方法：取 11.56M 储存液 10 μl，加入 712 μl IMDM 中，过滤除菌，4°C 下可稳定保存 1 周。		0.6ml
硝酸亚铁 90 ng/ml18μg/ml (Sigma 8508)
配制方法：将 1.8 mg 溶解于 1 ml 蒸馏水中。取 0.1 ml，加入 9.9 ml IMDM，过滤除菌，4°C 下可稳定保存 1 周。		3ml
硫酸亚铁 900 ng/ml180 μg/ml (Sigma F8633)
配制方法：将 18 mg 溶解于 1 ml 蒸馏水中。取 0.1 ml，加入 9.9 ml IMDM，过滤除菌，4°C 下可稳定保存 1 周。		3ml
牛血清白蛋白-胰岛素-转铁蛋白 (BIT)
20% (vol/vol)		StemCell Technologies 9500120 ml

表2.

组分储存液添加至 100 ml 含补充剂的 IMDM 中的体积（见表 2）
氢化可的松 (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
配制方法：将 5 mg 粉末溶于 1.03 ml IMDM 中。取 0.1 ml，加入 9.9 ml IMDM，过滤除菌。4°C 下可稳定保存 1 周。		1 ml
干细胞因子 (SCF) 100 ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
配制方法：将 50 μg 粉末溶于 500 μl PBS + 0.1% BSA 中，过滤除菌。分装为每管 100 μl，-20°C 保存。		100 μl
促红细胞生成素 (EPO) 3 IU/ml相当于 12,000 IU/ml 的 100 μg/ml 溶液 (Feldan FB03-10-290)
配制方法：将 50 μg 粉末溶于 500 ml PBS + 0.1% BSA 中，过滤除菌。分装为每管 25 ml，-20°C 保存。		25 μl
白细胞介素 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
配制方法：将 10 μg 粉末溶于 100 μl PBS + 0.1% BSA 中，过滤除菌。分装为每管 5 ml，-20°C 保存。		5 μl

表3.

试剂来源货号
293T 细胞
（定期检测支原体污染）		ATCCCRL-11268
DMEM/高糖培养基ThermoScientificSH30243.01
六亚甲基溴化铵（Polybrene）SigmaH9268-5G
OptiSeal 超速离心管Beckman Coulter361625
psPAX2 质粒Addgene（D. Trono 实验室）12260
pMD2.G 质粒Addgene（D. Trono 实验室）12259
pBLOCK-it6-DEST（shTal1）质粒将 Tal1 shRNA 序列克隆至 Invitrogen 的 pBLOCK-it6-DEST 质粒中Palii 等，EMBO J.
pBLOCK-it6-DEST（shScr）质粒将随机 shRNA 序列克隆至 Invitrogen 的 pBLOCK-it6-DEST 质粒中Palii 等，EMBO J.
pWPI 质粒Addgene（D. Trono 实验室）12254

表4.

缓冲液准备终浓度
2xHBS
  • 1.6 g NaCl
  • 1.3 g HEPES
  • 0.04 g Na2HPO4(7H2O
  • 加入 Milli-Q 水。
  • 用 NaOH 溶液将 pH 值精确调节至 7.11–7.13，并用 milli-Q 水定容至 100 ml。
  • 将pH值调节至7.11–7.13。
  • 过滤除菌，分装为10 ml等份，于-20°C保存
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1.5 mM
CaCl2
  • 2.77 g 无水 CaCl₂2
  • 溶于10 ml Milli-Q 水中。
  • 过滤除菌，分装为1 ml等份，于-20°C保存
  • 2.5 M
MS30
  • 25 ml [2 M] Tris，pH 8.0
  • 5 ml [0.5 M] EDTA
  • 300ml 甘油
  • 50 mM
  • 2.5 mM
  • 30% (v/v)

表5.

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讨论

此前已有多种方法用于在培养中诱导红系细胞分化，但效果各异。例如，某些无需在MS-5细胞上共培养的方案虽可实现红系细胞的扩增，但在生成完全成熟且无核的红细胞方面效率较低12-17。而另一些方法虽能有效促进细胞脱核，却以牺牲细胞增殖为代价18,19。本研究采用的方法最初由Douay实验室建立6，该方法结合了两个步骤：第一步为液体培养，可在红系分化早期延长细胞扩增时间，从而获得大量早期祖细胞（这对于基因组学和蛋白质组学研究至关重要）；第二步为在MS-5间充质细胞上进行共培养，这对于最大化血红蛋白合成以及实现红细胞完全脱核具有重要意义。本方法存在两点局限性：1）在分化最早阶段的扩增程度仍不足，迄今尚无法在蛋白质水平上充分表征早期红系祖细胞；2）该实验方案成本较高，尤其在大规模应用时更为显著。

细胞培养试剂和细胞因子的质量对于 离体 红系分化。值得注意的是，使用BIT（表2）作为血清替代物至关重要。根据我们的经验，使用BIT可消除此前使用分别来源的牛血清白蛋白、胰岛素和转铁蛋白时所出现的批间差异（可能源于试剂...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们感谢法国巴黎第六大学的 L. Douay 和 M.C. Giarratana 提供的建议 离体 红系分化，D. Allan 和 H. Atkins（加拿大渥太华医院研究学会，样本获取经渥太华医院研究伦理委员会批准，编号#2007804-01H）提供血液样本，D. Trono（洛桑联邦理工学院）提供慢病毒载体，F.J. Dilworth（加拿大渥太华医院研究学会）对稿件进行了关键性审阅。本项目由加拿大卫生研究院（CIHR）基金（MOP-82813）资助，M.B. 获得资助。C.G. P. 获安大略省研究基金计算调控组学培训博士后奖学金。M.B. 担任加拿大基因表达调控研究主席。

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