利用定量PCR，我们展示了如何使用成熟的鸡胚尿囊膜模型对人肿瘤细胞向远端器官的转移进行定量分析。
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摘要
摘要
在转移过程中，癌细胞从原发性肿瘤扩散，侵入周围组织，并传播到远端器官。转移是一个复杂的过程，可能涉及多种组织类型，持续时间各异，且常发生在器官内部深处，因此难以研究和定量分析。此外，转移级联反应中的多个步骤都会影响转移过程的效率，使得评估肿瘤细胞行为的某一个特定方面的贡献变得困难。因此，通常需要在实验动物中进行转移实验，以提供一个必要的、真实的研究背景来观察转移过程。然而，这些模型因其复杂的生理环境而进一步增加了研究难度。鸡胚是一种独特的 in vivo 模型，由于其绒毛尿囊膜（CAM）易于操作，克服了诸多研究转移的限制。绒毛尿囊膜是位于蛋壳下方的一种富含血管的胚外组织，能够接受肿瘤细胞的异种移植（图1）。此外，由于鸡胚天然免疫缺陷，CAM能够 readily支持正常组织和肿瘤组织的移植。最重要的是，禽类CAM能够有效支持大多数癌细胞的特性，包括生长、侵袭、血管生成以及微环境的重塑。这使得该模型在研究导致癌症转移的分子通路以及预测转移性癌症对新型潜在治疗药物的反应方面具有极高的应用价值。通过物种特异性的Alu PCR检测播散的细胞，可以对仅含有低至25个细胞的定植器官进行定量评估转移情况。利用人表皮样癌细胞系（HEp3），我们使用该模型分析癌细胞向远端器官（包括鸡胚肝脏和肺）的自发性转移。此外，通过Alu-PCR方案，我们展示了该检测方法在分析和定量评估转移过程各个独立环节（如内渗、滞留、外渗和定植）方面的高灵敏度和可重复性。
方案
1. 准备受体卵用于异种移植（自发性转移）
- 将新鲜受精的鸡卵置于旋转孵卵器中，在100°F和60%湿度条件下孵育10天。每小时翻转卵4次。
- 发育第10天，将卵横向放置于卵架上。使用鹅颈灯或其他合适的光源，通过将光线照射到卵的钝端（气室所在位置）进行照卵。
- 定位并标记绒毛尿囊膜静脉。该静脉位于卵壳顶部，是多条大血管的交汇处。在此分支点，血管向下延伸，离开绒毛尿囊膜并连接至胚胎。用铅笔在卵壳上距离该分支点约1 cm处绘制一个1 cm的正方形。随后使用浸有碘液的棉签清洁该正方形及其周围区域。
- 使用配备碳化硅磨石（Dremel 零件号 #84922）的旋转切割工具，在卵的钝端钻孔穿透至气室。使用同一工具在卵顶部先前绘制的正方形区域内钻孔，但停止在卵壳膜之前。使用末端带有细小钻头的25号针头在卵壳膜上穿刺一个小孔，注意避免撕裂下方的绒毛尿囊膜。随后，通过将一段¼” Tygon管连接至自动移液器辅助装置，并将其紧贴气室上的孔，利用轻柔的负压将正方形区域内的绒毛尿囊膜从卵壳膜上分离。施加负压后，正方形孔下方应出现一个气腔，表明绒毛尿囊膜已成功脱离卵壳。绒毛尿囊膜脱落后，使用实验室胶带封闭气室上的孔以及靠近绒毛尿囊膜静脉的正方形区域上的孔。随后将卵转移至静止孵卵器中，在100°F和60%湿度条件下继续孵育，以准备后续肿瘤细胞移植。顺序操作示意图见图1。
2. 准备用于静脉注射的卵（实验性转移）
- 将新鲜受精的鸡卵置于旋转孵化箱中，在100°F和60%湿度条件下孵化12天。每小时翻转卵4次。
- 在发育第12天，将卵横向放置于卵架上。使用鹅颈灯或其他合适的光源，从卵的钝端（气室所在位置）照射卵壳进行照卵。
- 定位尿囊绒毛膜静脉并做标记。用铅笔在卵壳上静脉正上方画一个1 cm × 0.5 cm的矩形。然后使用浸有碘液的棉签清洁该矩形区域及其周围区域。
- 使用Dremel钻头（#118）在所标记位置的卵壳上钻出一个小窗，移除该窗口以暴露下方的卵壳膜，随后滴加矿物油使膜变得透明。图5A为示意图。
- 此时，用一片实验室胶带封闭气室处的孔洞以及靠近尿囊绒毛膜静脉矩形区域内的孔洞。随后将卵转移至静止式孵化箱中，在100°F和60%湿度条件下孵育，以备后续注射肿瘤细胞。
3. 准备受体或注射用肿瘤细胞。
- 进行异种移植时，使用胰蛋白酶/EDTA将肿瘤细胞从培养皿上消化下来，并用10倍体积的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，以去除残留的培养基、胰蛋白酶或EDTA。
- 对于静脉注射，使用非酶细胞解离液将培养的细胞从培养皿上脱离，并用无血清DMEM洗涤。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将其重悬于PBS中，浓度为每毫升1000万至4000万个细胞，用于移植；或者 alternatively 重悬于无血清DMEM中，浓度为每毫升100万个细胞，用于静脉注射。
4. 将肿瘤细胞接种至新暴露的绒毛尿囊膜上（自发性转移）
- 将鸡蛋从孵育箱中取出，在先前画出的方格位置处切割一个小窗口，该位置已形成新的气室。使用配备切割轮的旋转工具（如Dremel工具搭配#409圆形切割轮）操作最为方便。用尖头镊子移除一小块蛋壳，暴露其下的绒毛尿囊膜（CAM）。
- 使用棉签（Fisher Brand #23-400-001）在绒毛尿囊膜上轻轻摩擦5次，棉签上应可见少量血液。在损伤绒毛尿囊膜后，立即在其表面接种25μl细胞悬液。细胞的最佳数量需通过实验确定，通常介于0.5×105至1×106之间。用胶带将蛋壳上的窗口密封，将鸡蛋直立静置10–15分钟，以使细胞充分沉降。15分钟后，将鸡蛋放回固定式孵育箱中继续培养。
- 根据具体实验需求及所用肿瘤细胞系的特性，让肿瘤生长5–8天。肿瘤发育的连续过程见图1。
5. 肿瘤细胞静脉注射（实验性转移）
- 使用30号胰岛素注射器，将100μl细胞悬液注射到每个胚胎的尿囊静脉中，随后将鸡蛋放回静止培养箱中，并继续孵育额外的1–7天。
- 在不同时间点，从每个胚胎中采集肺组织或下层尿囊绒毛膜（CAM），并按照下述方法处理以检测肿瘤细胞。
6. 收集肿瘤和鸡胚组织
- 准备一个解剖区域。该检测方法通过高灵敏度的PCR技术定量人源DNA来检测转移性细胞，因此防止外源性DNA污染至关重要。解剖操作应在专用区域内进行，并且在每只动物之间彻底清洁器械。为防止解剖过程中样本间的交叉污染，需使用三套独立的器械：一套用于切割蛋壳，一套用于切除原发肿瘤，另一套用于摘除内脏器官。此外，在每只动物操作之间，器械需依次在四个清洗容器中进行冲洗，顺序如下：1）双蒸水，2）双蒸水，3）含氯漂白剂，4）70%乙醇。
- 将鸡蛋从静止培养箱中取出，并置于冰上15分钟，以麻醉并安乐死胚胎。打开蛋壳窗口使肿瘤可见；必要时可进一步去除部分蛋壳以扩大观察窗口。从绒毛尿囊膜（CAM）上切除原发肿瘤，称重后送组织学处理。
- 通过沿径向将蛋壳切成相等的两半，取出鸡胚。将胚胎从切开的蛋壳中倾出，转移至洁净的称重皿中，胸部朝上。使用一套全新且洁净的器械进行解剖，沿胸骨剪开以暴露体腔。打开胚胎后，采集右侧或左侧肝叶的一小块组织。随后通过轻拉与肌胃相连的食管并剪断连接内脏的组织，将内脏器官整体取出。若需采集肺组织，应剪开肋骨 cage，分离胸骨板并移除心脏。此时可沿肺的四周进行切割（上方靠近头部、左侧沿肋骨 cage、下方靠近横膈膜、右侧沿气管）。为保持一致性，每只动物均采集同一侧肺组织。采集的组织样本可储存于-20°C以备后续使用，或立即进行DNA提取处理。
7. 基因组DNA提取与定量PCR分析
- 使用 Sybr Green Extract–N-Amp Tissue PCR 试剂盒（Sigma-Aldrich 目录号 #XNATRG）从组织中提取基因组 DNA。提取的 DNA 可转移至洁净的微量离心管中，于 -20°C 保存或立即使用。在后续 PCR 反应中使用前，必须将 DNA 用无核酸酶水按 1:50 比例稀释。此外，也可采用多种标准 DNA 提取方案进行 DNA 提取（Zijlstra et al., 2002）。
- 通过针对人源 Alu 序列的定量 PCR 检测鸡组织中的人类 DNA。使用 Exract-N-Amp 试剂盒中的 SYBR Green 扩增体系，采用 Alu 特异性引物进行定量 PCR。该 PCR 试剂盒包含 2× 反应混合液，内含 SYBR Green、缓冲液、盐类、dNTPs、Taq 聚合酶及 Jumpstart Taq 抗体。反应体系终体积为 15 μL，每种引物终浓度为 0.4 μM。大多数情况下，使用按 1:50 稀释的提取 DNA 即可获得定量结果，但模板 DNA 的最佳用量可能需通过实验优化确定。以鸡 GAPDH 引物作为内参对照。Alu 序列的 PCR 扩增条件如下：95°C 激活聚合酶 2 分钟，随后进行 30 个循环，每个循环包括 95°C 变性 30 秒、63°C 退火 30 秒、72°C 延伸 30 秒。鸡 GAPDH 的反应条件与 Alu 序列相同，但可能需要将循环数延长至 40 个。
- 通过 ΔΔCt 法对转移情况进行定量分析，将实验组与对照组进行比较（Schmittgen 和 Livak，2008；Zijlstra et al., 2002）。此外，也可利用 Extract-N-Amp 试剂盒提取的人肿瘤细胞系列稀释液建立标准曲线（Zijlstra et al., 2002）。采用 Student t 检验或单因素方差分析（ANOVA）对对照组与实验组之间的统计学显著性进行评估。
8. 代表性结果：
图1. 鸡胚转移模型。A) 四幅图示展示了该模型在关键步骤中的横截面外观：1. 孵育10天后，绒毛尿囊膜（CAM）已接近最大尺寸，动脉和静脉清晰可见，尿囊静脉位于蛋壳顶部。2. 在蛋壳上钻出两个孔后的鸡蛋：一个通入气室，另一个位于尿囊静脉附着点附近。3. 使用轻微负压排空气室并下拉CAM后的外观，将肿瘤细胞（蓝色）接种至下拉的CAM上。4. 在移植的肿瘤细胞生长一段时间后，收获肿瘤及鸡胚组织用于分析。B) 该模型操作过程的连续图示：1. 孵育鸡蛋；2. 标记尿囊静脉位置；3. 在蛋壳上钻孔；4. 下拉CAM；5. 切开开口以进行肿瘤细胞移植；6. 接种肿瘤细胞；7. 在收集组织前将鸡蛋置于冰上冷却；8. 在肿瘤生长7天后进行收获。
图2. CAM肿瘤的组织学分析。从携带肿瘤的绒毛尿囊膜上取下的组织经福尔马林固定后切片，并进行三色染色处理。A) HEp3细胞在CAM上生长七天后的肿瘤组织。B和C为A中区域的放大图像，显示肿瘤组织及间质结构。D) 正常的CAM组织。
图3. 转移的定量纵向分析。分别对具有高或低转移能力的头颈癌HEp3细胞株变体（HEp3 M(High) 和 HEp3 M(Low)）通过Alu PCR检测其播散能力。在为期7天的实验过程中，每个时间点分析10只动物。这些样本通过标准曲线进行定量，并以每50 mg组织中的细胞数（#cells/50mg组织）表示。
图4. 使用转移抑制抗体1A5处理的动物中自发性转移细胞的抑制情况。通过将5×105个HEp3细胞接种于第10天胚胎的绒毛尿囊膜（CAM）上形成肿瘤。接种肿瘤细胞三天后，对一半动物给予抗CD151抗体1A5处理。两天后采集荷瘤动物的肺组织，并进行定量实时alu PCR检测。同时，采用定量实时PCR检测鸡源GAPDH（chGAPDH）以确认各样本中宿主基因组DNA的含量相当（采用ΔΔCt法对两组进行定量比较（B））。
图5. 转移级联过程中滞留、生长和内渗的评估。从根本上讲，肿瘤向继发器官的转移由三个因素决定：滞留、生长速率和内渗速率。这些参数可通过实验性转移（A）和自发性转移（B）相结合的方法进行量化。在实验性转移（A）中，滞留定义为注射后2小时检测到的细胞数量；滞留细胞的存活与生长通过注射后24小时细胞数量的变化来确定；生长则定义为第3至第7天期间细胞增殖的速率。内渗通过自发性转移（B）进行测定，其中内渗细胞的数量定义为第7天存在的转移负荷超出根据第6天转移负荷预测值的部分。
图6. CAM中转移性肿瘤扩展的可视化。在发育第12天，将表达GFP的HEp3细胞通过静脉注射注入。在第1、3和5天分别处死一枚鸡蛋，并使用荧光体视显微镜对CAM片段进行成像。深绿色背景由蛋壳形成，血管系统以黑色线条可见，肿瘤细胞则表现为明亮的绿色斑点。
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讨论
数十年来，鸡胚尿囊膜（CAM）一直被用作研究癌症生物学和转移进展多个方面的模型系统。多个研究团队已利用该模型对转移能力进行了基本评估，包括对休眠状态（Aguirre Ghiso et al., 1999; Ossowski 和 Reich, 1983）、组织重塑（Deryugina et al., 2005; Hahn-Dantona et al., 1999）以及转移过程（Zijlstra et al., 2008; Zijlstra et al., 2002）的分析。由于其操作简便、可接受异种移植以及成本低廉，该模型在癌症生物学研究中持续具有很强的吸引力（Chambers et al., 1982; Chambers et al., 1990）。通过使用针对人类特异性Alu序列的定量PCR技术（Kim et al., 1998; Zijlstra et al., 2002），我们展示了分析人鳞状细胞癌HEp3细胞系转移播散能力的方法（图3）。此外，我们还展示了该技术在评估治...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢泰森食品公司（Tyson Foods Inc.）慷慨提供受精卵。Shanna Arnold 在本实验方案的拍摄过程中发挥了重要作用。 Trenis Palmer 获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）鲁思·L·柯什斯坦国家研究服务奖（Ruth L. Kirschstein National Research Service Award）下的F31国家癌症研究所奖（F31 National Cancer Institute）资助。本研究部分得到了CCSRI基金（项目号：700537）对JDL的资助，以及美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）基金（项目号：CA120711-01A1 和 CA120711-01A1）对AZ的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1X 达尔伯克’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | Invitrogen | 11995073 | |
| 杜尔贝科’D-磷酸盐缓冲液（1X），液体 | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| 含EDTA 4Na的0.05%（1X）胰蛋白酶溶液 | Invitrogen | 25300054 | |
| 运动员孵化器 | Berry Hill | 1550HA | 这些培养箱是最容易获得的设备之一。然而，视频中将展示不同的仪器。 |
| 运动型培养箱 | 贝里山 | 1502EA | 这些培养箱是最容易获得的设备之一。然而，视频中将展示不同的仪器。 |
| Dremel 旋转工具 | Dremel | ||
| Dremel 切割片，编号 36 | Dremel | 409 | |
| 便携式移液器辅助器 | Fisher Scientific | 1368115E | |
| 棉签 | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| 受精卵 | 各种 | 可使用多个不同供应商。鸡蛋重量应在约35-55克之间。产蛋母鸡的年龄应介于36至55周龄之间。 | |
| 血细胞计数板 | 豪泽科学 | 15170-090 | |
| 光纤显微镜照明器 | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25号针头 | |||
| Sybr Green 提取物—N-Amp 组织 PCR 试剂盒 | Sigma-Aldrich | XNATRG |
参考文献
- Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. A model system for studying metastasis using the embryonic chick. Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).
- Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos. In Vivo. 4, 215-219 (1990).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).
- Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases. Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).
- Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat Med. 12, 354-360 (2006).
- Ossowski, L., Reich, E. Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment. Cell. 33, 323-333 (1983).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).
- Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis. Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).
- Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction. Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).
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