量化活性 顺式-利用外植体电穿孔技术研究小鼠视网膜中的调控元件

摘要

本实验方案介绍了一种简单且经济的方法，通过离体电穿孔技术在活体小鼠视网膜中定量分析顺式调控元件（即增强子/启动子）的活性。文中详细描述了DNA制备、视网膜分离、电穿孔、视网膜离体培养以及固定后的分析与定量过程。

摘要

细胞基因网络中的转录因子通过结合到其靶基因的特定DNA序列，调控这些基因表达的空间-时间模式及表达水平 顺式-调控元件（CREs），短的（˜300-600 bp）的基因组DNA片段，可位于其所调控基因的上游、下游或基因内含子内部。顺式调控元件（CREs）即增强子/启动子通常包含多个成簇的转录激活因子和抑制因子的结合位点^1-3它们作为转录输入的逻辑整合器，以时空精确且定量准确的启动子活性形式产生统一的输出。大多数哺乳动物的研究 顺式迄今为止，对调控作用的研究主要依赖于小鼠转基因技术来检测顺式调控元件（CREs）的增强子功能^4-5该技术耗时长、成本高，且由于插入位点效应，结果大多缺乏定量性。另一方面，已在组织培养系统中建立了用于哺乳动物CRE功能的定量检测方法。例如，双荧光素酶报告基因检测），但 体内 这些结果的相关性通常不确定。

电穿孔为传统小鼠转基因技术提供了一个极佳的替代方案，因其能够实现对空间-时间及定量方面的评估 顺式-在活体哺乳动物组织中的调控活性。该技术在分析中尤为有用 顺式中枢神经系统中的调控作用，特别是在大脑皮层和视网膜中^6-8小鼠视网膜电穿孔，无论是 体内 和 离体，已由 Matsuda 和 Cepko 开发并进行了详尽描述^6-7,9我们最近开发了一种简单的方法，用于定量分析电穿孔小鼠视网膜中光感受器特异性顺式调控元件（CREs）的活性¹⁰由于通过电穿孔导入视网膜的DNA量在不同实验之间可能存在差异，因此所有实验中均需共电穿孔一个“上样对照”。在这方面，该技术与用于定量培养细胞中启动子活性的双荧光素酶检测非常相似。

在检测光感受器cis调控活性时，通常在新生小鼠（出生后第0天，P0）进行电穿孔，因为此时是视杆细胞生成的高峰期^11-12。一旦视网膜细胞类型退出有丝分裂进入终末分化状态，电穿孔效率会显著降低。由于新生小鼠视杆细胞生成速率较高，且视杆细胞占成年小鼠视网膜细胞总数的70%以上，因此在P0时期电穿孔转染的细胞大多数为视杆细胞。基于这一原因，视杆光感受器是通过电穿孔技术研究最为便捷的视网膜细胞类型。本文所描述的技术主要用于定量分析光感受器顺式调控元件（CREs）的活性。

方案

1. 电穿孔室的构建

1. 订购一个微载玻片，BTX Model 453，带有3.2 mm间隙（Harvard Apparatus #45-0105）（图2A）。金属导轨应完全密封至载玻片底部。
2. 使用Dremel工具从塑料微量离心管架上切下一个手柄，并将其切割成5个尺寸相同的小矩形块，每个尺寸为：长0.8 cm，高0.6 cm，宽0.3 cm（图2B）。这些塑料块为可重复使用的间隔物，用于在微载玻片腔室内成型各个独立的加样孔。
3. 将塑料间隔物均匀地插入微载玻片的金属导轨之间。间隔物应紧密贴合（图2C）。
4. 剪去P200移液器吸头的尖端，将其安装到3 ml注射器上，并用100%硅橡胶水族密封胶填充注射器。将密封胶填充至塑料间隔物之间的间隙中。填充时务必从底部向上填充，以避免密封胶塞与微载玻片基底之间形成气泡。
5. 在塑料间隔物上方放置一根金属棒，并用文件夹夹子固定，使间隔物在密封胶干燥过程中保持原位（图2D-E）。让密封胶过夜干燥。
6. 取下文件夹夹子、金属棒和塑料间隔物（图2F）。使用手术刀片清除金属导轨顶部的密封胶残留。使用解剖显微镜检查微载玻片，确保硅胶坝底部无气泡存在。清除加样孔内可能形成的密封胶薄膜，使加样孔内部暴露干净的金属表面。向其中一个加样孔加入水，检查水是否渗漏至相邻的加样孔。对所有加样孔重复此检测。
7. 完成的微载玻片可放入塑料培养皿中，其金属电极柱应靠近培养皿侧壁的窗口位置（图2G）；电极最终将连接至这些金属电极柱上。

2. DNA 制备

1. 将质粒 DNA 加入一个置于冰上的 1.5 mL 微离心管中，并用去离子水将体积补至 150 μL。可将多种质粒混合用于共电穿孔（例如，实验用 DsRed 载体和对照 GFP 载体）。计算加入管中的 DNA 量时，需注意 DNA 分装液的最终体积为 60 μL。通常每种载体的终浓度为 0.5 μg/μL。
2. 加入 15 μL 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 450 μL 100% 乙醇，使 DNA 沉淀。反复倒置或轻弹离心管数次以混匀。
3. 在 4°C、13,200 rpm 条件下离心 30 分钟，使 DNA 沉淀；用 70% 乙醇洗涤沉淀后，再次于 4°C、13,200 rpm 离心 15 分钟。将沉淀空气干燥至半透明状，约需 7 分钟，然后重悬于 54 μL 无菌水中。加入 6 μL 无菌 10× PBS（pH 7.4），混匀。

3. 眼部组织采集

1. 使用70%乙醇对电穿孔室及所有器械进行灭菌。眼球的采集和解剖无需在组织培养超净台中进行，但需用乙醇对实验人员手套和实验台面进行消毒，并在整个操作过程中尽量保持无菌条件。
2. 准备培养皿，内含解剖培养基（DMEM:F12按1:1比例混合，含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.29mg/ml L-谷氨酰胺和5μg/ml胰岛素）：两个35mm培养皿，每皿加入3ml培养基，另准备一个60mm培养皿，加入6ml培养基。此步骤应在组织培养超净台中完成。
3. 用70%乙醇对新生（出生后第0天）小鼠幼崽的头部和颈部进行消毒。用剪刀迅速剪下头部，并将头置于无菌的100mm培养皿中。
4. 用小剪刀剪除头皮以暴露眼球。使用弯头镊子轻柔地将眼球从眼眶中取出，并放入含有解剖培养基的35mm培养皿中。建议在低倍解剖显微镜下进行眼球摘除操作，以提高效率。
5. 重复步骤3.3和3.4，直至收集完所有眼球。解剖过程中将眼球置于室温下的解剖培养基中保存。每份DNA样品需使用3-4只眼球。

4. 视网膜分离

1. 使用70%乙醇对剃须刀片和无菌塑料移液管包装纸进行消毒。用刀片切下移液管的尖端，使其能够吸取整个眼球。不使用时，将移液管存放于塑料包装内。
2. 将一个眼球从35 mm培养皿转移至60 mm培养皿中。在解剖显微镜高倍镜下，使用精细镊子去除眼球表面的组织，如眼外肌和脂肪组织。随后，在基部夹断视神经。
3. 为分离视网膜，需在角膜缘处的巩膜上刺一个小孔。将两把镊子的其中一个尖端插入该孔中（方向与视网膜表面相切），轻轻撕开巩膜/视网膜色素上皮（RPE）。在白化小鼠中，巩膜和RPE相对于视网膜组织呈现光泽外观，而视网膜组织则为均匀的哑光灰色。在有色小鼠中，RPE呈黑色。保留晶状体不动。
4. 使用移液管将已解剖的视网膜转移至另一含培养基的35 mm培养皿中。
5. 重复步骤4.2至4.4，直至所有眼球均完成解剖。
6. 将视网膜置于37°C的组织培养孵育箱中保存，直至准备进行电穿孔操作。

5. 电穿孔前的准备

1. 准备35 mm培养皿中的培养基。每一份待电穿孔的DNA样品，需准备一皿解剖用培养基和一皿含10% FBS的培养用培养基。将培养皿正确标记。
2. 使用P200移液器和无菌1×PBS清洗电穿孔培养皿中的各个腔室。每个腔室容量为60–100 μl。每个腔室清洗三次。
3. 将DNA样品加入腔室中。未使用的腔室应加入60 μl的1×PBS。将电极连接至电穿孔培养皿。
4. 电穿孔仪设置如下：模式（mode）为LV；电压（voltage）为30 V；脉冲时长（pulse length）为50 msec；脉冲次数（number of pulses）为5次；间隔时间（interval）为950 msec；极性（polarity）为单极（unipolar）。

6. 电穿孔

1. 使用精细镊子夹住视网膜的晶状体，并将其转移至电穿孔室中。每个电穿孔室最多可容纳 3–4 个鼠视网膜（图 3）。
2. 使用镊子将视网膜排列整齐，使晶状体紧靠连接正极的金属条。每次转移后，用无尘纸清洁镊子，以避免 DNA 从一个电穿孔室带入下一个电穿孔室。
3. 当所有视网膜排列完毕后，按下电穿孔仪上的“开始”按钮。连接负极的金属条上应有微小气泡产生。
4. 断开电极连接，并关闭电穿孔仪。
5. 使用镊子轻轻将视网膜从电穿孔室壁移开。
6. 使用无菌移液管将视网膜从电穿孔室转移至含有解剖液的 35 mm 培养皿中。
7. 每个电穿孔室用无菌 1× PBS 清洗三次，然后用无菌水冲洗。用 70% 乙醇喷洒培养皿进行消毒。

7. 将视网膜置于滤膜上进行培养

1. 使用移液管将视网膜转移至含有培养基的35 mm培养皿中。
2. 标记一个无菌的6孔培养板的各孔，并在每个孔中加入3 ml培养基。
3. 使用无菌镊子将圆形Whatman Nuclepore滤膜（光面朝上）放置于各孔培养基的液面上方。
4. 在解剖显微镜下，使用无菌移液管将视网膜转移至滤膜上，确保晶状体面朝下。如果视网膜以晶状体面朝上着落，需用移液管将其拾起并重新放置。每个滤膜上放置的视网膜不得超过4个，并确保每个视网膜周围的小滴培养基彼此分离。请注意，本实验在晶状体完整的情况下进行视网膜培养，尽管其他方案建议在此步骤前移除晶状体⁹。
5. 将培养板置于37°C的组织培养箱（5% CO₂）中，培养所需时间，通常为8天。根据我们的经验，在8天的培养期间无需更换培养基，但若培养时间更长，则可能需要更换培养基。

8. 荧光视网膜外植体的收获与平铺

1. 在每个孔中加入4%多聚甲醛/1×PBS替换培养基。如果视网膜仍粘附在滤膜上，可用镊子将滤膜翻转，轻轻剥离视网膜。室温下用多聚甲醛固定30分钟。避光孵育，以防止荧光淬灭。
2. 用1×PBS冲洗视网膜，每次10分钟，共冲洗两次。
3. 使用一次性移液管将视网膜转移至载玻片上的少量 PBS 液滴中。在荧光解剖显微镜下，使用镊子将视网膜翻转，使其电穿孔面朝上（即，镜头朝下）。
4. 在载玻片的四角放置由破碎盖玻片制成的玻璃“支脚”（直径约1-2 mm的玻璃碎片）；这些支脚可防止视网膜被压平。将一片完整的玻璃盖玻片覆盖在载玻片上，使其盖住视网膜并 resting 在支脚上。必要时，使用移液器在载玻片与盖玻片之间加入更多PBS。

9. 平铺样本中荧光的成像与定量

1. 使用配备单色相机的荧光倒置显微镜，在4倍物镜下以红色和绿色通道对平铺的视网膜进行低倍成像。所有视网膜样本在相同荧光通道下的成像必须采用相同的曝光时间，以便比较荧光强度。确保任何图像中的像素均未饱和，否则将无法实现准确的定量分析。将图像以灰度TIFF格式导出。
2. 打开一个视网膜的图像集（即..，在 ImageJ 软件中使用红色通道和绿色通道）http://rsbweb.nih.gov/ij/）。在本教程中，绿色荧光通道（GFP蛋白）为对照构建体，在实验的所有视网膜样本中保持恒定；红色荧光通道（DsRed蛋白）为实验构建体，随每组视网膜样本而变化。图像应为灰度模式。
3. 在 ImageJ 中，选择对照绿色图像，并设定一个直径为 100 单位的感兴趣区域圆（Analyze/Tools/ROI manager/More/Specify）。复制该圆（ROI manager/Add），共创建八个圆。移动圆 1–5，选取五个电穿孔均匀的区域，避开视网膜外缘及晶状体上方区域图 4A）。此外，选择视网膜/晶状体外的三个区域（圆圈6-8）以测量背景荧光。选择红色图像，在ROI管理器中取消勾选“显示全部”框，然后重新勾选该框，八个圆圈均应显示在红色图像上。在ROI管理器中取消选中所有圆圈坐标。
4. 选择红色图像后，记录所有感兴趣区域（ROI manager/Measure）的平均像素值；此时应显示测量值1-8，其中1-5为红色视网膜区域的测量值，6-8为红色背景区域的测量值。选择绿色图像并记录其平均像素值；此时应显示测量值9-16，其中9-13为绿色视网膜区域的测量值，14-16为绿色背景区域的测量值。将测量数据复制到Excel中进行分析。图 5).
5. 分别对红色和绿色通道的三次背景测量值取平均值。将红色通道中每个视网膜测量值减去红色背景平均值；绿色通道同样进行此操作。对于每个视网膜感兴趣区域，用经背景校正后的红色测量值除以经背景校正后的绿色测量值，以将实验用的红色信号水平归一化至对照用的绿色信号水平（图 5).
6. 确定给定 DsRed 构建体的所有归一化测量值的平均值和标准差（例如，每个视网膜测量5次，共3个独立的视网膜）。为了对不同日期进行的电穿孔实验结果进行定量比较，每次电穿孔实验组中均需包含一个“标准”DsRed/GFP沉淀样本。通过将各实验的表达水平归一化至该“标准”的表达水平，即可实现跨实验的相对表达量比较。

10. 代表性结果：

一次成功的电穿孔可在视网膜表面约1/4至1/3的区域实现DNA构建体的表达（图4A）。由于视杆光感受器尤其能够被高效转导，该技术非常适合用于定量分析光感受器特异性启动子的活性（图4B）。我们此前已利用该方法定量分析了视杆细胞特异性基因Rho和Gnat1位点的一系列启动子变异体¹⁰。研究发现，该方法可实现近300倍范围内的启动子活性定量。

图5是来自单个电穿孔视网膜的示例数据集。在此特定示例中，实验性构建体pNrl(1.1kb)-DsRed在红色通道中检测，对照构建体pNrl(3.2kb)-GFP在绿色通道中检测。针对pNrl(1.1kb)-DsRed构建体的完整数据集应包含以该方式测量的6–9个视网膜，标准差基于所有“DsRed归一化至GFP”的数值进行计算。如果我们需比较pNrl(1.1kb)-DsRed与例如pNrl(0.8kb)-DsRed的表达水平，则两种构建体均需与相同的GFP对照（e.g.，pNrl(3.2kb)-GFP）共同电穿孔，并在相同的曝光时间下成像。若每天均进行标准的DsRed/GFP电穿孔实验（e.g.，pNrl(3.2kb)-dsRed + pNrl(3.2kb)-GFP），则可合并不同日期采集的数据。对于每个实验性构建体，其归一化的DsRed水平随后将归一化至“标准”构建体（pNrl(3.2kb)-dsRed）的归一化DsRed水平。

本文所描述的技术主要用于量化光感受器顺式调控元件（CREs）的活性^10,13。也可以在视网膜中较少见的细胞类型（如双极细胞）中量化细胞类型特异性的cis调控活性¹⁴，但这通常需要在垂直切片而非平铺制备样本中选择待量化的目标区域。对于在多种细胞类型（如光感受器和双极细胞）中驱动表达的CREs，情况同样如此。其余实验步骤基本相似。

图1. 视网膜外植体电穿孔实验流程概览。首先，从出生后第0天的小鼠幼崽中完整摘取眼球，并分离视网膜（P1）。其次，将视网膜置于含有DNA的电穿孔槽中进行电穿孔处理（P2）。第三步，将视网膜外植体转移至滤膜上，进行为期八天的培养（P3）。第四步，对外植体进行固定、切片载片并成像，使用ImageJ软件测量荧光强度（P4）。第五步，将ImageJ获得的数据导入电子表格程序进行处理，以定量分析不同启动子的活性差异（P5）。

图 2. 电穿孔培养皿的构建。A) 来自 Harvard Apparatus 的未改装微载玻片室，BTX 型号 453（目录号 #45-0105）。B) 使用 Dremel 工具将塑料试管架的手柄切下。将手柄切割成矩形间隔块，尺寸如下：长 0.8 cm，高 0.6 cm，宽 0.3 cm。C) 将塑料间隔块等间距地插入微载玻片室内。在间隔块之间的缝隙中注入水族箱密封胶（未显示）。D) 将金属条放置在间隔块上方。E) 使用文件夹夹子将金属条和间隔块夹紧在载玻片上，以固定所有部件，使密封胶过夜固化。F) 取出间隔块，并测试各孔以确保其不漏水。G) 制备完成的载玻片可放入塑料培养皿中，金属条位于培养皿侧面窗口的附近。

图 3. 含视网膜的电穿孔培养皿示意图。每个腔室中加入DNA溶液（每次最多可使用五种不同的溶液）。将视网膜放置于腔室中，并调整方向使晶状体倾斜靠在连接正极的金属条上；每个腔室可容纳三到四个视网膜。通电后，带负电荷的DNA分子将在电流作用下进入视网膜细胞。

图4. A) 利用ImageJ测量平铺视网膜中的荧光水平。在ImageJ软件中打开DsRed（实验组）和GFP（对照组）通道的灰度平铺图像；请注意，这些图像仅为示意图而进行了着色处理。在电转染均匀的区域上放置五个测量圆（1至5），避开边缘和晶状体（虚线所示）。在视网膜外区域放置三个测量圆（6至8），用于确定背景荧光水平。B) 高倍镜下电转染视网膜外植体的横截面图像。该外植体于出生后第8天固定，4°C下在30%蔗糖/1X PBS中过夜进行冷冻保护，包埋于OCT中，并切成12μm厚的冷冻切片。荧光表达载体pNrl(1.1kb)-DsRed和pNrl(3.2kb)-GFP在视网膜外核层（ONL）的光感受器细胞中表达。INL，内核层；GCL，节细胞层。

图5. 使用 Excel 处理荧光数据。在步骤1中，将每个测量圆的平均像素值复制到电子表格中（单元格 B3-B12、F3-F5、H3-H5）。测量值 #1-5 为 DsRed 视网膜信号值，#6-8 为 DsRed 背景值；测量值 #9-13 为 GFP 视网膜信号值，#14-16 为 GFP 背景值。请注意，测量值 #1 与 #9 对应同一个测量圆，#2 与 #10 同样对应，依此类推。在步骤2中，计算 DsRed 和 GFP 通道的平均背景值（单元格 F6、H6）。在步骤3中，从每个视网膜测量值中减去平均背景值（单元格 C3-C12）。在步骤4中，将每个减去背景后的 DsRed 测量值归一化为其对应的 GFP 测量值（单元格 D3-D7）。

讨论

外植体电穿孔是一种用于量化小鼠视网膜发育过程中cis-顺式调控活性的简便方法。与通过小鼠转基因技术进行cis-顺式调控分析相比，电穿孔成本显著更低，仅需新生小鼠仔鼠、DNA、解剖器械以及电穿孔和组织培养设备。此外，该方法耗时也大大缩短：一次实验仅需数小时的准备时间、约八天的培养周期，以及实验结束后的数小时用于成像和数据分析。与基于细胞培养的cis-顺式调控分析相比，外植体电穿孔更具优势，因其使用的是真实的视网膜组织。视网膜在外植体培养中发育基本正常，可形成三个明确的细胞层（外核层、内核层和神经节细胞层），尽管光感受器细胞未能形成外节段。

另一个优点是，外植体电穿孔具有高度可重复性。相同的构建体在不同视网膜中进行电穿孔，即使在不同日期操作，通常也能产生相同的相对表达水平。此外，由于电穿孔导入的质粒被认为以附加体形式存在于细胞核中，而不会整合到染色体中，因此似乎不受困绕基因整合实验的整合位点效应的影响。 顺式-在转基因小鼠中进行的调控分析。

外植体电穿孔技术确实存在若干局限性。首先，只有仍处于细胞周期中的细胞才能通过电穿孔实现高效的转导¹⁵在P0阶段，该方法主要靶向视网膜中的视杆细胞及其他晚期出生的视网膜细胞类型（双极细胞、无长突细胞、Müller胶质细胞）。已有文献报道，通过P0电穿孔可实现对视锥光感受器的转染。¹⁶ 但效率似乎较低。第二个局限性在于，外植体培养超过两周会导致视网膜逐渐发生形态异常，因此不建议进行。然而，如果需要在较晚时间点进行启动子定量，则 体内 电穿孔⁹ 可在所需时间点进行视网膜解剖，随后将解剖所得视网膜平铺并按第9节所述进行定量分析。第三个局限性在于，该检测方法仅具有中等通量。与基于细胞培养的检测方法可在单次实验中检测数百个构建体不同，本方案所述技术每个构建体至少需要一只完整的小鼠视网膜。因此，每天可合理电穿孔的构建体数量仅为数十个。

使用本方法对启动子活性进行定量时，另一个需要注意的问题是，DsRed的荧光可能会“渗漏”到GFP检测通道中，尤其是在检测非常强的启动子时。其原因是DsRed的发射光谱与GFP的部分发射光谱存在重叠。为避免这一问题，应使用经过优化的发射滤光片，以最大程度减少DsRed与GFP之间的光谱重叠。当无法获得此类优化滤光片组时，另一种可能的解决方案是使用蓝移的荧光蛋白（例如，以BFP或CFP替代GFP。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电穿孔培养皿，Microslide 453	BTX Technologies	45-0105	参见方案第1节中的修改说明
100%硅橡胶水族箱胶粘剂	Perfecto Manufacturing
塑料微量离心管架	Fisher Scientific	05-541	仅使用管架手柄部分
Dremel 工具			用于切下塑料管架的手柄
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	11965
F12	GIBCO, by Life Technologies	11765
L-Glu/pen/strep	GIBCO, by Life Technologies	10378-016	100倍浓度
胰岛素	Sigma-Aldrich	I-6634	配制1000倍储存液时，用5 mM HCl溶解至5 mg/mL，过滤除菌
FBS	GIBCO, by Life Technologies	26140-079
ECM 830 方波电穿孔仪	BTX Technologies
Nuclepore 滤膜	Whatman, GE Healthcare	110606	25 mm，0.2μm
组织培养孵箱			37°C，5% CO2
玻璃盖玻片 #1.5	Fisher Scientific	12-544E	厚度0.16 mm
配备相机的荧光倒置显微镜			相机应为单色相机（例如，Hamamatsu ORCA-ER 相机）
用于倒置显微镜的EGFP/DsRed滤光片组	Chroma Technology Corp.	86007	该滤光片组可最大程度减少红色与绿色通道间的串色
ImageJ 软件	National Institutes of Health		http://rsbweb.nih.gov/ij/