利用聚合物复合的嗜生态慢病毒转导人细胞以增强生物安全性

摘要

慢病毒是研究基因功能的重要研究工具；然而，研究人员可能希望避免产生编码已知或疑似癌基因的泛嗜性慢病毒。作为替代方案，我们提出了一种更安全的策略，即在经过改造以表达嗜鼠性病毒受体 mSlc7a1 的人源细胞上使用嗜鼠性慢病毒。

摘要

干细胞与肿瘤细胞生物学研究通常需要将已知或疑似癌基因通过病毒转导至人类细胞，这为实验室人员带来了重大的安全问题。泛嗜性慢病毒（如常用的VSV-G假型病毒）是研究基因功能的有力工具，因为它们能够转导多种细胞类型，包括非分裂细胞。然而，由于编码癌基因的泛嗜性病毒在操作时需要更高的生物安全等级并存在安全隐患，研究人员可能希望避免其制备和离心过程。一些强效的癌基因，如c-Myc和SV40大T抗原，已被证实可促进诱导性多能干细胞（iPSC）的生成。其他所有已知的诱导iPSC的遗传改变（OCT4、SOX2、KLF4、NANOG、LIN28以及p53功能缺失）也均与癌症相关，因此同样具有较高的安全风险。

尽管这些与癌症相关的病毒在细胞重编程和多能性研究中具有重要价值，但其使用必须确保安全。为解决这些生物安全问题，我们展示了一种利用嗜生态型慢病毒转导人细胞的方法，同时特别强调降低实验成本和操作的便捷性。我们所制备的嗜生态型慢病毒滴度足够高，可实现对超过90%表达相应受体的人细胞进行有效转导，从而验证了该方法的高效性。

慢病毒通常通过超速离心进行浓缩；然而，该过程需要数小时，且可能产生对人类生物医学研究人员具有感染性的气溶胶。作为替代方法，可通过与硫酸软骨素和聚凝胺（CS/PB）形成复合物，更安全地将病毒颗粒沉降至细胞上。该技术可使稳定表达鼠类逆转录病毒受体的细胞中的功能性病毒滴度最高提升至原来的3倍，且额外的时间和成本消耗可忽略不计。在人真皮成纤维细胞（HDFs）的转导中，使用约比先前报道的肿瘤细胞系最适浓度低4倍的CS/PB浓度即可达到最大增强效果，提示应针对目标细胞类型对聚合物浓度进行滴定优化。因此，我们描述了使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）在新细胞类型中检测聚合物毒性的方法。我们观察到，使用聚合物复合物或标准剂量的聚凝胺（PB，6 μg/ml）进行病毒转导后，HDFs的细胞活力相当，表明急性毒性极低。

在本实验方案中，我们描述了使用嗜鼠型慢病毒在人源细胞中过表达癌基因的方法，该方法可降低生物安全风险并提高转导效率。我们还展示了利用聚合物复合物增强转导效果的技术，该技术无需通过离心浓缩病毒颗粒，从而避免产生气溶胶。

方案

1. 慢病毒的制备、收集与冻存

1. 开始本实验方案前，请咨询您所在机构的安全负责人，并遵循其建议的安全指南。
2. 第1天。使用健康且处于快速生长期的293T细胞进行病毒制备。以每10 cm培养皿5 × 10⁶个细胞的密度接种细胞。病毒生产过程中使用不含抗生素的293T培养基（高糖DMEM，含10%胎牛血清和4 mM L-谷氨酰胺）。
3. 第2天。在傍晚时分进行293T细胞转染（以下数量适用于一个10 cm培养皿）。将所有试剂恢复至室温。取375 μl OptiMEM加入微量离心管中，然后加入25 μl Fugene HD。注意避免未稀释的Fugene直接接触管壁表面。
4. 在另一微量离心管中混合以下成分：
   • 5 μg 转移质粒（Slc7a1、目的载体或荧光对照载体）
   • 3.75 μg 包装质粒（pCMV-dR8.91 或 psPax2）
   • 1.25 μg 包膜质粒（泛嗜性病毒使用pMD2.G，嗜向性病毒使用pHCMV-EcoEnv）
   • 无血清OptiMEM补足至100 μl
5. 将上述两个管中的混合液合并，室温孵育20–30分钟。
6. 将293T细胞的培养基更换为10 ml新鲜的不含抗生素的293T培养基。将Fugene/质粒混合液逐滴加入培养皿中，于37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。
7. 第3天。将293T细胞的培养基更换为10 ml新鲜的不含抗生素的293T培养基。操作需轻柔，因为293T细胞贴壁较松，若用移液器用力吹打培养基可能导致细胞从单层脱落。将细胞置于湿润培养箱中继续孵育两天以生产病毒。
8. 第5天。收集病毒液，并使用0.45 mm低蛋白结合滤膜过滤。可立即使用，或分装成单次使用量后于-80°C冻存。冻存的泛嗜性病毒和嗜向性病毒分别在储存六个月和一个月后应重新测定滴度。
9. 按照以下方法测定病毒滴度，使用较易转导的细胞进行检测。将荧光对照病毒以系列稀释比例（例如1:10、1:100、1:1000）加入新鲜培养基中（含6 μg/ml PB），对细胞进行过夜转导。次日更换为新鲜培养基。转导后让细胞继续培养两天以开始表达荧光蛋白，然后通过FACS测定转导细胞的比例。根据产生<15%转导率的稀释度计算每毫升的转化单位（TU）滴度，以尽量减少多重转导事件的发生。
   

2. 利用小鼠逆转录病毒受体 Slc7a1 转导人靶细胞

1. 选择感染复数（MOI）= 2，以确保大多数细胞能够被转导。对于难以转导的靶细胞（如人包皮成纤维细胞，HDFs），需要更高的MOI；我们通常仅将病毒上清液稀释1:2，以实现大部分细胞的转导。
2. 使用含有6 μg/ml PB的新鲜培养基稀释病毒上清液，与靶细胞共孵育过夜，PB可通过增强病毒与靶细胞之间的静电相互作用来提高转导效率¹。理想情况下应使用最小体积的病毒液，例如35 mm培养皿使用1 ml，因为扩散效率是影响转导效率的限制因素。
3. 在去除病毒后，需将细胞继续培养至少48小时，再进行嗜同性病毒的转导，以确保Slc7a1受体得到充分表达。
4. （可选）如需要，可使用杀稻瘟菌素（blasticidin）筛选稳定转导并表达Slc7a1的细胞。应预先绘制杀稻瘟菌素的杀灭曲线，以确定最低有效浓度（通常为2 – 10 μg/ml），该浓度可在7天内杀死所有未转导的靶细胞。在去除Slc7a1病毒约2天后，将转导细胞更换至含杀稻瘟菌素的培养基中。持续在含杀稻瘟菌素的培养基中培养7天，此时所有存活细胞将稳定表达逆转录病毒受体，此后既可用于嗜同性病毒的转导，也可作为稳定表达Slc7a1的细胞系保存以供后续使用。

3. 聚合物复合物滴定法测定毒性

1. 第1天。 将细胞以每孔5000个细胞的密度接种于96孔板中，每个实验组至少设三个复孔。包括接种于完全培养基中的未转导细胞，以提供健康细胞的基线值，同时设置无血清培养基中的细胞样本作为生长停滞的对照。同时，将细胞接种于合适的容器（如24孔板）中，用于在各实验条件下通过显微镜或基于FACS的方法分析转导效率。
2. 第2天。 使用编码GFP的病毒感染为MTT和FACS分析所准备的细胞板，感染复数（MOI）为0.5，以转导约40%的目标细胞。测试不同浓度的CS/PB（例如每种组分分别为50、100、200、400、600和800 mg/ml），以及6 μg/ml的PB，以确定最佳用量。按下方第4部分所述方法制备聚合物复合物。
3. 第3天。 移除含病毒的培养基，更换为新鲜培养基。将培养板放回湿润培养箱中继续培养。
4. 第5天。 对FACS检测用的培养板进行分析，测定每种聚合物浓度下的转导效率。
5. 第6天。 吸去MTT板中所有孔的培养基，每孔加入100 μl MTT溶液（含1 mg/ml MTT的完全培养基）。在湿润培养箱中继续培养3小时，使代谢活跃细胞线粒体中的MTT被还原。
6. 吸去MTT溶液，每孔加入200 μl MTT溶剂（含0.1 N HCl和0.1% Igepal CA-630的异丙醇溶液）。
7. 室温孵育2小时，或直至紫色的MTT甲臜沉淀完全溶解。使用酶标仪在570 nm波长处读取吸光度，并减去690 nm处的背景值。
8. 根据FACS结果确定可最大程度增强转导效率、同时根据MTT结果对细胞代谢活性影响最小的最佳聚合物浓度。对于HDF细胞，我们依据下方“代表性结果”中所示数据选择了100 μg/ml的CS/PB。

4. 利用聚合物复合物进行嗜亲性转导

1. 将PB和硫酸软骨素用无菌水配制成20 mg/ml的储备液，经滤膜除菌。分装后于-20°C保存。
2. 用移液器将病毒上清液转移至微量离心管中，并用新鲜培养基稀释至所需终浓度（例如MOI为2）。依次加入等体积的PB和硫酸软骨素溶液（浓度根据上述步骤3确定），每次加入后轻轻弹击管壁以混匀。随着沉淀物形成，病毒混合液将立即变浑浊。室温孵育5分钟，以促进复合物形成。
3. 移除表达受体的靶细胞中的培养基，加入病毒混合液，于37°C、5% CO2条件下过夜孵育。移除病毒混合液后，用PBS洗涤细胞表面两次，以帮助去除病毒复合物。无需完全清除；我们观察到残留的聚合物复合物对细胞健康无不良影响。

5. 验证嗜生态转导的特异性

1. 首次制备嗜生态病毒时，出于安全考虑，应验证该病毒无法转导未经修饰的人类细胞。使用较高浓度的嗜生态慢病毒（仅用新鲜培养基对病毒上清液进行1至2倍稀释）与人类细胞共孵育过夜，并加入6 μg/ml PB或经优化的CS/PB浓度。
2. 移除含病毒的培养基，更换为新鲜培养基。细胞继续培养2天后，通过荧光载体进行FACS检测和/或使用目的基因特异性引物进行RT-PCR，以验证外源基因的表达。

6. 代表性结果：

图1A展示了慢病毒的生产流程，图1B展示了使用嗜鼠性慢病毒对人类细胞进行转导的过程，包括使用小鼠逆转录病毒受体Slc7a1进行转导前处理。在测定病毒滴度时，我们使用一种稳定转导了Slc7a1的人类横纹肌肉瘤细胞系（Slc-hRMS）。当使用荧光对照载体监测转导效率时，我们通常可在Slc-hRMS细胞中实现>90%的嗜鼠性病毒转导效率，如图2A和2B所示。人真皮成纤维细胞（HDFs）的转导率通常较低，因为这些细胞未经过杀稻瘟菌素筛选以富集受体表达（图2C）。在Slc-hRMS细胞上测定的嗜鼠性慢病毒滴度通常为VSV假型病毒的10–20%（图2D）。

一次冻融循环会使嗜生态病毒的滴度降低 16 - 3%，相当于 VSV 假型病毒单次冻融循环过程中的滴度损失（p > 0.05）。与以往报道相反²，我们未观察到干冰速冻对病毒滴度有促进作用。相反，仅需将病毒管直接放入 -80°C 冰箱中，即可获得更高的冻融后滴度（数据未显示）。

MTT 活性检测法可灵敏地检测靶细胞的生长停滞情况。用病毒联合浓度高达 800 μg/ml 的 CS/PB 进行转导，对人真皮成纤维细胞（HDF）的代谢无影响（图 3A）。在无病毒的情况下暴露于 CS/PB 也对细胞无毒性作用（数据未显示）。对用病毒联合不同浓度 CS/PB 转导的 HDF 进行流式细胞术（FACS）分析，结果显示与仅使用 PB 相比，转导效率得到增强（图 3B）。最大增强效应出现在 100 μg/ml CS/PB 时（图 3C），该浓度显著低于此前报道的数值³。因此，针对特定的靶细胞类型优化实验条件至关重要。

与CS/PB的复合使Slc-hRMS中的观察滴度大约提高了3倍（图4A，p < 0.01）。实际上，这种效应在低病毒浓度下对转导效率的影响大于高病毒浓度下的影响（图4B），这很可能是由于在较高病毒浓度下发生了多重转导细胞以及受体饱和所致。

使用嗜鼠病毒进行转导时，仅针对表达小鼠逆转录病毒受体的细胞具有特异性。当使用嗜鼠病毒转导未经修饰的人类细胞时，无论采用PB还是CS/PB方法，均未观察到荧光信号高于未转导对照组的背景水平，如图5A所示。在显微镜下，人包皮成纤维细胞（HDFs）在无受体表达的情况下未显示任何转导信号（图5B），而预先导入受体后则可观察到荧光表达细胞（图5C）。

图1. 示意图 （A） 病毒的生产过程以及 （B） 用小鼠逆转录病毒受体转导人细胞，随后进行嗜同种慢病毒转导。

图 2. 携带 GFP 的嗜鼠性慢病毒对人细胞的高效转导。细胞预先转导了小鼠逆转录病毒受体 Slc7a1。(A) 筛选获得稳定表达 Slc7a1 的人横纹肌肉瘤细胞系（Slc-hRMS），转导（蓝色）或未转导（粉色）GFP 的结果。(B) 嗜鼠性病毒转导的 Slc-hRMS 细胞的荧光显微图像（4X）。(C) 人包皮成纤维细胞（HDFs）经嗜鼠性 GFP 慢病毒转导（蓝色）与未转导（粉色）的结果；细胞在进行嗜鼠性转导前两天已转导 Slc7a1。(D) 在 Slc-hRMS 细胞上测定的 VSV-G 假型慢病毒与嗜鼠性慢病毒的滴度。

图3. 优化人真皮成纤维细胞中硫酸软骨素/聚溴化物（CS/PB）的浓度。(A) 仅存在PB或不同浓度CS/PB条件下，通过MTT法测定HDF的细胞活力。(B) 通过FACS检测不同浓度CS/PB对HDF转导效率的增强作用。(C) 转导增强效果的定量分析，显示在100 μg/ml CS/PB时转导效率最高。

图 4. 400 μg/ml CS/PB 对 Slc-hRMS 细胞进行嗜同性慢病毒转导的影响。(A) 滴度提升效果，以及 (B) 与单独使用 6 μg/ml 聚凝胺相比的转导率倍数变化。

图 5. 在缺乏小鼠逆转录病毒受体 Slc7a1 的情况下，人包皮成纤维细胞（HDFs）无法被嗜生态病毒感染。 (A) BJ 人成纤维细胞的流式细胞术图，未转导（粉红色）或转导（蓝色）嗜生态 GFP 慢病毒，两种情况均在无受体 Slc7a1 的条件下进行。BJ 人成纤维细胞转导嗜生态 GFP 慢病毒，(B) 未预先转导受体 Slc7a1 和 (C) 预先转导受体 Slc7a1（4X）的情况。

讨论

基于莫洛尼鼠白血病病毒（MLV）及其受体 mSlc7a1 的重组嗜鼠性γ逆转录病毒已被广泛研究并易于获取，过去二十多年中一直用于向小鼠细胞递送转基因。近年来，嗜鼠性γ逆转录病毒也被用于向人类细胞递送癌基因；在细胞重编程的背景下，使用 mSlc7a1 以避免产生携带人类癌基因的兼嗜性病毒已有充分依据^4,5。然而，在转导难处理的细胞群体（包括常作为重编程理想靶标的原代细胞）方面，慢病毒相较于γ逆转录病毒具有显著优势⁶，这是因为慢病毒的前整合复合物能够介导非分裂细胞的转导⁷。

为改变病毒的嗜性、毒性及其他特性，已成功制备出包含MLV在内的数十种不同假型的慢病毒⁸。MLV假型的嗜鼠性慢病毒已被用于转导小鼠细胞⁹，但极少应用于人类细胞¹⁰。因此，我们提出将MLV假型的嗜鼠性慢病毒作为一种安全、经济高效且高度有效的载体，用于向人类细胞递送已知或疑似癌基因，包括细胞重编程因子。

需要特别注意的是，本方案并未完全消除生产和使用泛嗜性慢病毒的必要性；相反，该方案将癌基因与泛嗜性病毒分离，使研究人员避免可能因接触与癌症相关的病毒而导致的自我接种风险。蛋白mSlc7a1及其人类同源物hSlc7a1是普遍表达的氨基酸转运蛋白，目前尚无证据表明其具有致瘤性或能够赋予受体细胞生长优势¹¹，因此将mSlc7a1引入异嗜性病毒的风险相对较低。这一额外步骤对于缺乏符合相应生物安全等级的专用病毒或组织培养设施的实验室可能尤为有用。

在某些情况下，可通过将 Slc7a1 质粒直接转染入靶细胞，从而完全避免使用泛嗜性病毒；然而，该技术所适用的许多靶细胞同样难以转染。作为替代方案，利用杀稻瘟菌素筛选分离 Slc7a1 转导细胞的能力意味着可先使用 VSV-G 假型慢病毒一次性建立表达受体的细胞库，此后便可常规使用嗜生态病毒对这些细胞进行转导，以开展大量实验。研究人员应始终遵循所在机构关于使用任何慢病毒（无论其嗜性如何）的安全指南。

采用本方案获得的嗜生态病毒滴度通常略低于VSV假型病毒，一般为泛嗜性病毒滴度的10%至20%，与以往研究结果一致⁹。这些滴度是在稳定转导了Slc7a1的人细胞中测定的，因此嗜生态病毒观察到的较低滴度可能部分归因于靶细胞中受体基因表达水平的差异。尽管如此，本方案获得的病毒滴度已完全足以满足大多数应用需求，并可实现大部分细胞的转导，在某些情况下转导率超过> 90%的细胞。

基于离心的技术常用于浓缩病毒颗粒。然而，离心过程需要数小时，可能产生具有传染性的气溶胶，并可能导致病毒颗粒显著损失。¹² 作为替代方法，使用壳聚糖/聚苯乙烯磺酸盐（CS/PB）复合物可在不改变病毒趋向性的前提下增强转导效率。³ 该方法快速（5分钟）且成本低廉（每10 ml病毒仅需0.03美元），同时可使观察到的滴度提高约三倍。该方法无需特殊设备或专有试剂，我们在人真皮成纤维细胞（HDFs）暴露于CS/PB后观察到极低的急性毒性，这与先前在其他细胞系中的研究结果一致。¹³ 该方案的一个潜在缺点是，部分在显微镜下可见的聚合物复合物会在培养过程中附着于细胞表面并持续数天。我们不能排除这些复合物虽然对细胞无明显毒性，但仍可能对细胞过程产生更细微影响的可能性。

本文介绍了一种安全高效地利用致癌因子转导人类细胞的方法。该方法对于研究癌基因和干细胞生物学（包括诱导多能干细胞）的研究人员具有重要应用价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	小鼠 MLV 受体
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G 包膜
pCMV-dR8.91	Addgene		D. Trono 实验室14 包装质粒（等效质粒 psPax2 可从 Addgene 获取，货号 12260）
pHCMV-Ec–nv	Addgene	15802	嗜同种型包膜
FUGW	Addgene	14883	GFP 对照质粒
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche Group	04 709 705 001
六亚甲基二溴化铵（Polybrene）	Sigma-Aldrich	H9268
鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素钠盐	Sigma-Aldrich	C4384
杀稻瘟菌素 S	Fisher Scientific	BP 2647100
3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴盐（MTT）	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021