详细描述了将小鼠神经干细胞（NSCs）移植到已建立脱髓鞘模型的小鼠脊髓中的过程。内容包括神经干细胞的制备、胸椎第9节（T9）椎板切除术以及神经干细胞的移植操作，同时涵盖了小鼠术前和术后的护理措施。
本文内容
摘要
摘要
感染嗜神经性鼠肝炎病毒JHM株（MHV）的小鼠会表现出与多发性硬化症（MS）这种脱髓鞘疾病患者相似的病理和临床症状。我们已证明，将神经干细胞（NSCs）移植至患病小鼠的脊髓中，可显著促进髓鞘再生并改善临床症状。目前，针对慢性神经系统疾病的细胞替代疗法已成为现实，而体内模型对于理解移植细胞与宿主组织微环境之间相互作用至关重要。本演示提供了一种适用于向JHMV感染小鼠脊髓移植细胞的改良方法。简要而言，本文介绍的操作流程包括：i）移植前NSCs的准备，ii）小鼠术前护理，iii）通过椎板切除术暴露脊髓，iv）立体定位法注射NSCs，以及v）术后护理。
方案
1. 准备
- 配制赛拉嗪-氯胺酮溶液（氯胺酮为管制药品，应详细记录并存放于安全、上锁的场所）。
- 清洁并灭菌器械。
- 用无菌剂擦拭手术区域，铺上无菌纸巾，并安装好显微操作仪。
2. 移植用细胞的制备
- 细胞应重悬至浓度为 100,000 个细胞/µL，尽管每只小鼠仅移植 250,000 个细胞，但为便于注射器上样，需准备过量细胞（每只接受细胞移植的小鼠至少准备 300,000 个细胞）。
- 将待移植的细胞在 50 ml 锥形管中用 HBSS 洗涤 3 次。在最后一次离心前对细胞进行计数。
- 最后一次离心后，倾去 HBSS，并将离心管倒置放置，以防止液滴重新接触细胞沉淀。
- 用经紫外照射灭菌的无尘纸轻轻擦干管内壁。注意不要使细胞沉淀干燥。
- 将离心管直立，缓慢而轻柔地用最终所需体积一半的 HBSS 重悬细胞。
- 通过将大部分悬液吸入移液器吸头，然后调节移液器旋钮直至全部悬液进入吸头，以此测定总体积。该操作可确定为达到目标浓度还需添加多少 HBSS。
- 通过加入 HBSS 将体积调整至目标体积。
- 将细胞悬液放回冰上。若细胞在冰上放置超过 2 小时，需检查细胞活力。
3. 小鼠手术与移植的准备工作
- 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉，注射体积约为~100 μl 剂量或等效麻醉剂。从术前准备到缝合的整个手术过程需要30至40分钟。
- （可选：在每只小鼠尾巴上贴上编号的彩色胶带以确保识别）
- 使用电动剪毛器剃除小鼠从下背部至颈部、并向中线两侧各延伸2 cm范围内的背侧毛发。应尽可能贴近皮肤剪毛（可能需要在该区域多次重复操作）。
- 使用纱布棒蘸取少量脱毛膏（Nair），均匀涂抹于残留毛发处以去除剩余毛发。
- 1～2 分钟后，用蘸有肥皂水的纱布轻轻擦去脱毛剂。准备好的区域应为干净的裸露皮肤，不得残留任何毛发碎片，以免在后续手术过程中毛发进入伤口。
用碘溶液对准备好的区域进行消毒。
4. 椎板切除术
- 在操作过程中应频繁更换和/或消毒手套。将小鼠背侧朝上放置，头部朝向左侧（如果你是右利手）。用无菌布覆盖动物，确保无菌环境，并仅暴露已剃毛的区域。在椎板切除部位做一垂直切口（约1.3 cm），范围从胸椎T8至T12。
- 用左手持格拉费钳，牢固夹住T9处的脊柱（图1A），并将小鼠轻轻提起，以增强脊柱的自然弯曲。
- 使用手术刀在T10与T11之间的连接处划开，即两个棘突之间的间隙。通过小心刮除肌肉层以暴露骨面，进一步显露该连接部位（见图1B,C）。
- 使用剪刀通过小幅度剪切，进一步清除椎板及椎弓根周围的肌肉组织。这将打开椎骨之间的一个小空间。缓慢而轻柔地将剪刀的一侧刀片插入此间隙，并剪断椎弓根。务必始终保持剪刀的弯曲方向朝向外侧，远离脊髓。在另一侧重复此操作（见图1D,E）。
- 抬起椎板以暴露脊髓，并小心将其剪除。注意不要遗留任何游离或锋利的骨碎片（见图1F）。
- 注射前，使用无菌棉签清除任何血液。
5. 细胞注射
- 将带有针帽的针头连接至 Hamilton 注射器，并用纯水冲洗数次进行清洗，随后依次使用 70% 乙醇和 HBSS 冲洗。每次用纯水、70% 乙醇或 HBSS 填充后，插入推杆。
- 通过取出推杆、松开针帽并将针头从注射器上轻轻拉离以防止反压，准备 Hamilton 注射器用于加样细胞。确保在无菌手套操作下小心处理针头和针帽。
- 将 15μl 细胞悬液吸入移液器吸头中，然后将吸头紧压入注射器尾端，将细胞加载至注射器内。
- 将推杆插入约 5mm，然后拧紧针帽。
- 下压推杆，直至观察到部分细胞悬液从针头端流出。
- 确保注射器内无气泡，并将注射器水平放置，以防止细胞因重力作用形成浓度梯度。
- 用手握住 T8 与 T9 椎骨棘突之间脊最长肌部位已进行椎板切除的小鼠（图 2B、C）。
- 将止血钳固定在左侧（垂直）显微操作臂上，使小鼠前肢悬空，后肢轻轻接触无菌纸巾平台，如 图 2A 和 2B 所示。
- 将注射器固定在右侧显微操作臂上（呈 70° 角），并在夹紧前将注射器滑动至尽可能低的位置。
- 通过将小鼠尾巴固定在纸巾上以稳定动物，然后缓慢降低注射器（图 2B）。
- 将针头朝向脊髓下降，并通过背侧中线插入对侧半球 1mm 深度（图 2C）。针尖应位于靠近中央管的灰质区域。
- 缓慢注射 2.5μl 细胞悬液，注射速率为 1μl / 5 秒。注射完成后，等待 10 秒，然后每隔 10 秒将针头每次回撤十分之一圈，直至完全退出脊髓。注意观察是否有细胞悬液外溢。
- 迅速回撤注射器，并从显微操作臂上取下，水平放置于台面。
- 释放小鼠，并转移至缝合台。
- 对每只小鼠重复步骤 5.7–5.14，直至注射器内细胞用尽。在每只动物之间对器械（使用灭菌器）和针头（用乙醇擦拭）进行消毒。若观察到细胞聚集，应弃去剩余细胞并重新加样。
- 每次加样之间，按照步骤 5.1 的方法清洗注射器。
6. 缝合与术后护理
- 缝合切口。将缝合针插入切口两侧的浅筋膜中，穿线后拉紧浅筋膜（图3A），从而覆盖椎板切除部位暴露的脊髓。不要缝合附着于皮肤的皮下肌肉或背部骨骼肌。将缝线完全拉出，留出约1/2英寸的线头。使用持针器打三个结，并尽可能靠近结处剪断线头。
- 使用两到三个皮肤缝合钉（根据切口大小决定数量）闭合皮肤切口（图3B）。操作时应小心将皮肤从小鼠身体上轻轻拉起，避免将下方肌肉一并钉住。
- 使用26G3/8针头，在远离切口的下背部皮下注射0.5 ml乳酸林格氏液。
- 将小鼠放回笼中。为确保其在麻醉状态下呼吸顺畅，应将小鼠侧卧放置于笼内，避免手术部位接触笼内垫料。笼子应置于加热垫上。
- 在麻醉作用消退后对小鼠进行监测，以确认出血停止、缝合口保持闭合，且小鼠恢复至术前活动能力。
- 术后给予小鼠一次镇痛药布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg）治疗。
- 确保行动受限的小鼠能充分获取食物和水：使用加长3.5英寸吸管的水瓶；对于无法行走的小鼠，需人工喂食水和/或高热量营养补充剂（Nutri-Cal, Tomlyn）。
7. 代表性结果：
理想的结果可通过注射过程中细胞悬液无外溢以及手术后脊髓外观完整来识别。为此，在椎板切除术和注射过程中，必须对小鼠脊柱提供明亮且直接的照明。光纤照明有助于实现最佳光照条件（图 2A）。
图1 - 椎板切除术。 (A) 用格拉费镊子牢固夹持第9胸椎（T9）后，(B, C) 在T10与T11之间用手术刀片划痕，以利于显微剪刀进入。(D) 将显微剪刀小心地从T10与T11之间的间隙插入（箭头及插图E），并分别切断两侧的椎弓根（虚线，E），以游离背侧椎板。(F) 将椎板向前上方翻起并剪除。
图 2. 神经干细胞注射。 （A）显微操作仪的整体装置，左侧臂上固定有由止血钳夹持的小鼠，右侧臂上安装 Hamilton 注射器，角度为 70°。（B）止血钳夹持连接 T8 与 T9 棘突的背棘肌。（C）将针头沿中线插入，并进入对侧半球中央管附近的灰质。
图 3. 缝线与伤口闭合。 （A）在切口两侧的浅筋膜上施加缝线。（B）根据需要使用 2-3 个钉合器闭合切口（图中显示一个需要 3 个钉合器的伤口仅使用了 1 个钉合器）。
讨论
成功的移植手术主要取决于精细的椎板切除和细胞注射操作。在进行椎板切除时，最需要避免的主要问题是损伤脊髓。这种损伤可能在手术过程中发生，也可能由术后残留的尖锐骨碎片造成。为避免此类情况，应确保弯头显微剪刀的尖端始终朝向远离脊髓的方向，并仔细检查已完成椎板切除的脊柱区域，确保所有骨碎片均已清除，且残留的椎体结构没有明显突出或锯齿状的边缘。
如前所述，若在注射过程中光线明亮且直接照射到暴露的脊髓，则可观察到外溢现象。当使用30号针头（而非33号）或注射速度过快时，最有可能发生外溢。尽管本方案已为我们提供了良好的结果，但其他研究者曾报道在注射后需等待更长时间（最长可达5分钟）再撤出针头8,9。此外，较小直径的针头更为理想，但我们观察到某些细胞在通过33号针头时容易发生破裂。
为提高效率，建议配备一个移植团队，负责四个不同工作站（小鼠准备、椎板切除、注射和缝合）。此外，应优化每项操作的时间，以尽量缩短细胞在冰上等待的时间。例如，我们以每组四只小鼠进行移植（每支注射器负荷的剂量数），在第三只小鼠完成椎板切除后，负责注射的人员开始装填注射器；而在前一组的第二只小鼠完成椎板切除后，负责准备小鼠的人员即应开始对下一组小鼠实施麻醉。通过这种方式，即使每只小鼠的操作耗时约30至40分钟，我们也能在约3小时内完成40只小鼠的细胞（或对照培养基）移植。
目前，针对某些中枢神经系统疾病的细胞替代疗法正处于临床试验阶段10。神经干细胞（NSC）移植的体内模型尚无替代方法，而我们建立的将NSCs植入病毒诱导脱髓鞘小鼠脊髓中的移植方案，有助于利用一种重要的多发性硬化症模型，并且也可轻松地适用于其他模型。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯胺酮注射液（Ketaject） | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-542-02 | |
| 盐酸赛拉嗪（Xylazine Hydrochloride） | MP Biomedicals | 158307 | |
| 脱毛膏（Nair） | Church & Dwight Co. | ||
| 10 μl Hamilton 注射器，带可拆卸针头 | Hamilton Co | 7635-01 | |
| Hamilton 针头，30G 或 33G，½ 英寸，30° 斜面 | Hamilton Co | 7803-077803-05 | 在细胞通过针头后检测其活力，以确定最适针径 |
| 微型剪刀 | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | |
| 小型格拉夫镊（Small Graefe Forceps） | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| 立体定位仪 | Kopf Instruments | Model 1772 通用夹持器 | |
| 立体定位仪 | Kopf Instruments | Model 1773 电极夹持器 | |
| 立体定位仪 | Kopf Instruments | Model 902 小动物立体定位仪 | |
| 立体定位仪 | Kopf Instruments | Model 960 左侧电极支架 | |
| 缝合线 | Ethicon Inc. | 95057-064 | |
| 乳酸林格氏液 | Hospira Inc. | NDC 0409-7953-03 | |
| 皮肤缝合钉 | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| 止血钳 | Fine Science Tools | 13010-12 | |
| 手术刀刀片，型号 10、11 | Fisher Scientific | 268878, 268879 | |
| 缝合线 | Ethicon Inc. | 1676G | 5-0 规格，3/8" 圆形，19 mm 针，45 cm 编织线 |
| Reflex 7 伤口缝合钉施加器 | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm Reflex 伤口缝合钉 | Fine Science Tools | 12032-07 | |
| Olsen-Hegar 持针器 | Fine Science Tools | 12502-12 |
参考文献
- Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
- Weiner, H. L. The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease. Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).
- Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease. Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).
- Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).
- Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response. Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).
- Blakemore, W. F., Crang, A. J. Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , Oxford UP. Oxford. (1992).
- Liu, S. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).
- Keirstead, H. S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).
- Mayor, S. First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury. BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).
重印与许可
标签
